一種基于雜交鏈式反應信號放大技術測定赤霉素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于雜交鏈式反應信號放大技術測定赤霉素的方法，其特征是將赤霉素抗體固定在羧基化磁珠上，在目標物赤霉素存在時，磁珠上赤霉素抗體、膠體金上的赤霉素抗體與赤霉素之間形成夾心式免疫復合體，加入富含G堿基的H1和H2，在膠體金上的DNA1激發雜交鏈式反應，從而在免疫復合物上形成富含G堿基的DNA長鏈，在化學發光試劑3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛的作用下產生化學發光，根據化學發光實現赤霉素的測定。該方法具有高靈敏度，高選擇性，低成本，操作簡單等特點。
【專利說明】一種基于雜交鏈式反應信號放大技術測定赤霉素的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種基于雜交鏈式反應信號放大技術測定赤霉素的方法。
【背景技術】
[0002]赤霉素(GA，2，4α，7_三羥基-1-甲基-8-亞甲基赤霉-3-烯-1,10-二羧酸-1，4 α -內酯)是普遍存在于高等植物中的一種植物激素，參與調節植物生長發育的多種生理過程，如促進細胞分裂、植株矮化等，現廣泛應用于水果、蔬菜的增產、增效等方面。目前我國對赤霉素的最高殘留限量未做出規定，但美國、日本等國家規定其在水果、蔬菜中的最高殘留限量為0.2mg/kg (趙瑛博，周艷明，忻雪，王巖松.食品科學，2011，32(06): 209;呂保英.食品分析大全.北京:高等教育出版社，1997:723)。測定赤霉素的方法主要有熒光光譜法(中華人民共和國浙江進出口商品檢驗局.SN0350—1995.出口水果中赤霉素殘留量的檢測方法.北京:中國進出口商品檢驗局，1998)、酶聯免疫法(袁琳.外源赤霉素GA3對大豆光合作用的促進和葉片內源赤霉素GA1+3水平.植物生理與分子生物學學報，2008，28 (4): 317)、氣相色譜法(許慶琴，范哲峰.大口徑毛細管氣象色譜法快速測定植物組織中的赤霉素.分析科學學報，2000，6:524)、毛細管電泳-質譜(Ge Liya, Pen CYC, Yong JffH et.al..Analyses of gibberellins by capillaryelectrophoresis-mass spectrometry combined with solid-phase extraction[J].Journal of Chromatography A, 2007, 1159(1/2): 242)、毛細管電泳-激光誘導突光(Chen H, Guo X F， Zhang H S, Wang H.Simultaneous determination of phytohormonescontaining carboxyl in crude extracts of fruit samples based on chemicalderivatization by capillary electrophoresis with laser-1nduced fluorescencedetection.Journal of Chromatography B.2011, 879(20): 1802)和液相色譜法(周艷明，湯媛，牛森.高效液相色譜法檢測草莓中赤霉素殘留量的研究.食品工業科技，2009，1: 311)等。
[0003]這些方法中有些前處理方法太過繁瑣，有些方法靈敏度較低。本發明利用納米金為標記物和磁珠為載體，以雜交鏈式反應為信號放大技術，實現植物赤霉素的測定，具有方法簡單、成本低、靈敏度高的優點。
【發明內容】
[0004]本發明旨在發明一種方法簡單、成本低、靈敏度高、選擇性高的測定赤霉素的方法。
[0005]實現發明目的技術方案是:
一種基于雜交鏈式反應信號放大技術測定赤霉素的方法，其特征是將赤霉素抗體固定在羧基化磁珠上，在目標物赤霉素存在時，磁珠上赤霉素抗體、膠體金上的赤霉素抗體與GA之間形成夾層式免疫復合體，加入富含G堿基的Hl和H2，在膠體金上的DNAl激發雜交鏈式反應，從而在免疫復合物上形成富含G堿基的DNA長鏈，在化學發光試劑3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)的作用下產生化學發光，根據化學發光實現GA的測定。
[0006]測定步驟為:
(I)抗體標記磁珠的制備
將0.2mL 10mg/mL的羧基化磁珠加入到一小離心管中，用0.4mL 0.1M咪唑-HCl緩沖溶液中洗三遍。然后用咪唑-HCl緩沖溶液分散成0.4mL的溶液，再將0.4mL 0.25M NHS和0.5M EDC加入該小試管中，在37 °C下培養30分鐘。然后用0.4mL 0.1M的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)清洗三遍，再用0.4mL 0.1M的磷酸鹽緩沖液分散成溶液。將得到的抗體標記磁珠存放在4°C的環境中備用。
[0007](2)抗體和DNAl標記膠體金的制備
首先將5yL IOmM的TCEP加入100 μ L 10_6M DNAl溶液中，37°C下培養30分鐘，得TCEP活化過的100 μ L I(T6M DNAl溶液。
[0008]再將200 μ L 2mg/mL的GA抗體加入到粒徑為20nm的1.0mL膠體金(AuNP)溶液中，在室溫下培養30分鐘。然后，再加入用TCEP活化過的IOOyL 10-6Μ DNAl溶液。在室溫下輕搖16小時后，得抗體和DNAl標記膠體金溶液。再用2.0mL 0.1M的磷酸緩沖液(pH=7.4)洗滌三次。并用2.0mL磷酸鹽緩沖液進行懸浮處理，并在4°C環境下保存。
[0009](3)水果和蔬菜樣品制備過程
將樣本切碎、混合，研 磨得到均勻的混合物。然后，取IOg均勻的混合物放在IOOmL的錐形瓶中。在錐形瓶中加入25mL乙醇溶液后，將樣品進行超聲波處理10分鐘。再將混合物用孔徑為0.45 μ m的微孔膜過濾。
[0010](4)分析測定
本發明所使用的化學發光測定原理如在圖1所示。首先將樣品或標準溶液與抗體標記磁珠混合，反應5-30分鐘，進行磁分離后，用50 μ L PBST緩沖液洗滌兩遍，并將其懸浮在50 μ L的PBS溶液中。然后，加入5-20 μ L抗體和DNAl標記膠體金，在室溫下反應30分鐘后進行磁分離，并且使用50 μ L PBST緩沖液洗滌三次。然后加入20 μ L含0.5 μ M的Hl和Η2的混合溶液進行雜交鏈式反應，在室溫下反應10-70分鐘后，再用50 μ L PBST溶液洗滌三遍。然后使其懸浮于40 μ L磷酸緩沖溶液中。將得到的溶液進行化學發光(hv)檢測。
[0011](5)化學發光檢測
使用IFFS-E型多功能化學發光檢測儀進行化學發光檢測。將一個2mL的小玻璃瓶放在化學發光檢測儀的光電倍增管暗箱中。然后向小玻璃瓶中加入IOyL pH為8.5的四丁基氫氧化銨-磷酸鹽緩沖液。接著再加入步驟(4)所得的溶液10 μ L。再用注射器從光電倍增管頂端小孔中注入100 μ L 30mM的TMPG溶液，引發化學發光反應，根據化學發光強度對樣品或標準溶液的濃度進行定量測定。
[0012]所述的3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)按照已報道的方法合成(Kojima，E.;Ohba, Y.; Kai, Μ.; Ohkura, Y.Anal.Chim.Acta 1993, 280, 157-162)。
[0013]所述的三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(TCEP，98%)，3_吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA)、細胞分裂素(Kt)和脫落酸(ABA)購于阿法埃莎公司。
[0014]所述的赤霉素抗體(Ab)從美國紐約Creative Biomart公司購買。
[0015]所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(DEC)、N_羥基琥珀酰亞胺(NHS)和牛血清白蛋白(BSA)是從Sigma公司購買的。
[0016]所述的羧基化磁珠(粒徑為0.4-0.6Mm，濃度為8-12mg/mL) (MB)購買于天津市倍思樂色譜技術開發中心。
[0017]所述其他化學試劑從國藥集團化學試劑有限公司購買。
[0018]所有使用的化學用品都是化學純，所有的溶劑都用二次去離子水離子配置。
[0019]在一升水中溶解0.13g KH2POjP 1.93g Na2HPO4獲得0.1M pH 7.4的磷酸緩沖液。
[0020]將0.2g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4.12H20, 8.0g NaCl 和 0.2g KCl 溶解于一升水中，得到0.15M pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。
[0021]在磷酸緩沖溶液中加入Tween-20，使Tween-20的體積比為0.05%得PBST溶液。
[0022]咪唑-HCl緩沖液:咪唑6.8g，加水約600mL水中，然后用IM鹽酸調節pH至7.4，最后加蒸懼水至I升。
[0023]四丁基氫氧化銨-磷酸鹽緩沖液:取質量濃度10%四丁基氫氧化銨溶液26.4mL,加水800mL后，用IM磷酸溶液調節pH值至8.5，再用水稀釋至I升。
[0024] DNA從北京賽百盛基因技術有限公司獲得。它們的核苷酸序列如下:
【權利要求】
1.一種基于雜交鏈式反應信號放大技術測定赤霉素的方法，其特征是將赤霉素抗體固定在羧基化磁珠上，在目標物赤霉素存在時，磁珠上赤霉素抗體、膠體金上的赤霉素抗體與赤霉素之間形成夾心式免疫復合體，加入富含G堿基的Hl和H2，在膠體金上的DNAl激發雜交鏈式反應，從而在免疫復合物上形成富含G堿基的DNA長鏈，在化學發光試劑3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛的作用下產生化學發光，根據化學發光實現赤霉素的測定，測定步驟為: (1)抗體標記磁珠的制備
將0.2mL 10mg/mL的羧基化磁珠加入到一小離心管中，用0.4mL 0.1M咪唑-HCl緩沖溶液中洗三遍；然后用咪唑-HCl緩沖溶液分散成0.4mL的溶液，再將0.4mL 0.25M N-羥基琥珀酰亞胺和0.5M 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽加入該小試管中，在37 °C下培養30分鐘；然后用0.4mL 0.1M pH=7.4的磷酸鹽緩沖液清洗三遍，再用0.4mL0.1M的磷酸鹽緩沖液分散成溶液，將得到的抗體標記磁珠存放在4°C的環境中備用； (2)抗體和DNAl標記膠體金的制備 首先將5yL IOmM的三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽加入100 μ L 10-6Μ DNAl溶液中，37°C下培養30分鐘，得三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽活化過的100 μ L 10-6Μ DNAl溶液； 再將200 μ L 2mg/mL的GA抗體加入到粒徑為20nm的1.0mL膠體金溶液中，在室溫下培養30分鐘，再加入用TCEP活化過的100 μ L 10-6Μ DNAl溶液，在室溫下輕搖16小時后，得抗體和DNAl標記膠體金溶液；再用2.0mL 0.1M ρΗ=7.4的磷酸緩沖液洗滌三次，并用2.0mL磷酸鹽緩沖液進行懸浮處理，并在4°C環境下保存； (3)水果和蔬菜樣品制備過程 將樣本切碎、混合，研磨得到均勻的混合物，然后，取IOg均勻的混合物放在IOOmL的錐形瓶中，在錐形瓶中加入25mL乙醇溶液后，將樣品進行超聲波處理10分鐘，再將混合物用孔徑為0.45 μ m的微孔膜過濾； (4)分析測定 首先將樣品或標準溶液與抗體標記磁珠混合，反應5-30分鐘，再進行磁分離后，用50 μ L PBST緩沖液洗滌兩遍，并將其懸浮在50 μ L的磷酸鹽緩沖溶液中；然后，加入5-20 μ L抗體和DNAl標記膠體金,在室溫下反應30分鐘后進行磁分離，并且使用50 μ LPBST緩沖液洗滌三次；然后加入20 μ L含0.5 μ M的Hl和Η2的混合溶液進行雜交鏈式反應，在室溫下反應10-70分鐘后，再用50 μ L PBST溶液洗滌三遍，然后使其懸浮于40 μ L磷酸緩沖溶液中，將得到的溶液進行化學發光檢測； (5)化學發光檢測 使用IFFS-E型多功能化學發光檢測儀進行化學發光檢測，將一個2mL的小玻璃瓶放在化學發光檢測儀的光電倍增管暗箱中，然后向小玻璃瓶中加入10 μ L pH為8.5的四丁基氫氧化銨-磷酸鹽緩沖液，接著再加入步驟(4)所得的溶液10 μ L ;再用注射器從光電倍增管頂端小孔中注入100 μ L 30mM的3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛溶液，引發化學發光反應，根據化學發光強度對樣品或標準溶液的濃度進行定量測定。
2.根據權利要求1的測定赤霉素的方法，其特征在于所述的羧基化磁珠粒徑為0.4-0.6Mm,濃度為 8_12mg/mL。
3.根據權利要求1的測定赤霉素的方法，其特征在于所有使用的化學用品都是化學純，所有的溶劑都用二次去離子水離子配置。
4.根據權利要求1的測定赤霉素的方法，其特征在于所述的DNA1、Hl和H2的核苷酸序列如下:
5.根據權利要求1的測定赤霉素的方法，其特征在于分析測定時使用IOPL抗體修飾磁珠，抗體和DNAl修飾膠體金用量為20μ?,樣品或標準溶液與抗體標記磁珠混合反應時間為.30分鐘，雜交鏈反應時間為70分鐘。
6.根據權利要求1的測定赤霉素的方法，其特征在于PBST溶液是在磷酸緩沖溶液中加入Tween-20,使Tween-20的 體積比為0.05%得到的溶液。
【文檔編號】G01N33/74GK103674935SQ201310655870
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】混旭, 蘇國慶 申請人:青島科技大學