一種散結鎮痛藥品的檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種散結鎮痛藥品的檢測方法，包括以下步驟：（1）將散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物混合，得到待測溶液；（2）將所述待測溶液進行液相色譜檢測，得到所述待測溶液的指紋圖譜；所述液相色譜檢測的洗脫程序為梯度洗脫；（3）根據所述待測溶液的指紋圖譜、預定標準曲線和散結鎮痛藥品樣品的質量，得到散結鎮痛藥品待測樣品中所含成分的含量。本發明采用梯度洗脫進行液相色譜檢測，得到的指紋圖譜中各活性成分的色譜峰峰形和分離度均較好，有利于計算色譜峰的峰面積，從而得到散結鎮痛藥品樣品中各成分的含量。本發明提供的方法實現了對散結鎮痛藥品中各活性成分的定量測定，從而能夠更真實的反映散結鎮痛藥品的品質。
【專利說明】一種散結鎮痛藥品的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥分析【技術領域】，尤其涉及一種散結鎮痛藥品的檢測方法。
【背景技術】
[0002]散結鎮痛藥品的處方中含有龍血竭、三七、浙貝母和薏苡仁，其功能為軟堅散結、化瘀定痛，主要用于治療痰瘀互結兼氣滯所致的繼發性痛經、月經不調、盆腔包塊、不孕以及子宮內膜異位等疾病。散結鎮痛藥品中含有酚類化合物、皂苷類化合物、生物堿和油脂等化學成分，這些化學成分對散結鎮痛藥品發揮藥效具有重要的作用，因此檢測散結鎮痛藥品中相關成分的方法成為人們研究的焦點。
[0003]現有技術公開了一種散結鎮痛藥品中黃酮類成分的檢測方法(顏月園，蕭偉，吳云.散結鎮痛膠囊中黃酮類成分的指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18:5.)，具體過程為:采用液相色譜檢測，檢測條件為Waters SymmetryiC18色譜柱；流動相為乙腈-水；檢測波長為275nm ;流動相流速為1.0mL ^mirT1 ;色譜柱柱溫為30°C;對照品溶液的制備方法為取7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A和龍血素B適量，加適量的甲醇制成7，4’ - 二羥基黃酮質量濃度為0.0504mg/mL、龍血素A質量濃度為0.0522mg/mL、龍血素B質量濃度為0.0934mg/mL的混合溶液；供試品溶液的制備方法為取散結鎮痛膠囊樣品2g，加入50mL質量百分濃度為50% 的甲醇的水溶液，進行超聲提取30min，將提取后的溶液濾過，取續濾液采用0.45μ m的濾膜濾過。檢測結果為散結鎮痛膠囊中的主要成分為7，4’- 二羥基黃酮、龍血素A和龍血素B。
[0004]現有技術公開的散結鎮痛藥品的檢測方法只能對散結鎮痛藥品中的相關成分進行定性的檢測，沒有對其進行定量的檢測，因此現有技術提供的檢測方法不能完全地反映散結鎮痛藥品的質量。
【發明內容】
[0005]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種散結鎮痛藥品的檢測方法，本發明提供的檢測方法既能對散結鎮痛藥品中的相關成分進行定性檢測又能對其進行定量檢測，該方法能夠全面的反映散結鎮痛藥品的質量。
[0006]本發明提供了一種散結鎮痛藥品的檢測方法，包括以下步驟:
[0007](I)、將散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物混合，得到待測溶液；
[0008](2)、將所述待測溶液進行液相色譜檢測，得到所述待測溶液的指紋圖譜，所述液相色譜檢測中的流動相包括流動相A和流動相B，所述流動相A為乙腈，所述流動相B為水或三氟乙酸，所述流動相A和流動相B的體積百分數之和為100% ；
[0009]所述液相色譜檢測的洗脫程序為梯度洗脫，所述梯度洗脫為:
[0010]O~12min內，所述流動相A的體積百分數從12%~14%上升至17%~19%,所述流動相B的體積百分數從86%~88%下降至81%~83% ；
[0011 ] 12min~22min內，所述流動相A的體積百分數從17%~19%上升至27%~29%，所述流動相B的體積百分數從81%?83%下降至71%?73% ；
[0012]22min?35min內，所述流動相A的體積百分數從27%?29%上升至39%?41%，所述流動相B的體積百分數從71%?73%下降至59%?61% ；
[0013]35min?45min內，所述流動相A的體積百分數保持在39%?41%,所述流動相B的體積百分數保持在59%?61% ；
[0014]46min?55min內，所述流動相A的體積百分數從39%?41%上升至89%?91%,所述流動相B的體積百分數從59%?61%下降至9%?11% ；
[0015](3)、根據所述待測溶液的指紋圖譜、預定標準曲線和散結鎮痛藥品待測樣品的質量，得到散結鎮痛藥品待測樣品中所含成分的含量，所述標準曲線為散結鎮痛藥品待測樣品所含成分的對照品溶液的質量濃度與相應的峰面積之間的線性曲線。
[0016]優選的，所述醇類化合物為C原子數為I?5的醇類化合物。
[0017]優選的，所述醇類化合物為乙醇或甲醇。
[0018]優選的，所述醇類化合物為無水甲醇。
[0019]優選的，所述梯度洗脫具體為:
[0020]O?12min內，所述流動相A的體積百分數從13%上升至18%,所述流動相B的體積百分數從87%下降至82% ；
[0021]12min?22min內，所述流動相A的體積百分數從18%上升至28%,所述流動相B的體積百分數從82%下降至72% ；
[0022]22min?35min內，所述流動相A的體積百分數從28%上升至40%,所述流動相B的體積百分數從72%下降至60% ；
[0023]35min?45min內，所述流動相A的體積百分數保持在40%,所述流動相B的體積百分數保持在60% ；
[0024]46min?55min內，所述流動相A的體積百分數從40%上升至90%,所述流動相B的體積百分數從60%下降至10%。
[0025]優選的，所述流動相的流速為1.5mL.mirT1?2.0mL.mirT1。
[0026]優選的，所述液相色譜檢測的檢測器為紫外檢測器；
[0027]檢測波長為260nm?300nm。
[0028]優選的，所述液相色譜檢測中的色譜柱柱溫為30°C?45°C。
[0029]優選的，所述步驟(I)為:
[0030]將散結鎮痛藥品待測樣品溶于醇類化合物中，超聲提取，得到待測溶液。
[0031]優選的，所述超聲提取的時間為15分鐘?60分鐘。
[0032]本發明提供了一種散結鎮痛藥品的檢測方法，包括以下步驟:(I)、將散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物混合，得到待測溶液；(2)、將所述待測溶液進行液相色譜檢測，得到所述待測溶液的指紋圖譜，所述液相色譜檢測中的流動相包括流動相A和流動相B，所述流動相A為乙腈，所述流動相B為水或三氟乙酸，所述流動相A和流動相B的體積百分數之和為100% ;所述液相色譜檢測的洗脫程序為梯度洗脫，所述梯度洗脫為:0?12min內，所述流動相A的體積百分數從12%?14%上升至17%?19%，所述流動相B的體積百分數從86%?88%下降至81%?83% ；12min?22min內，所述流動相A的體積百分數從17%?19%上升至27%?29%，所述流動相B的體積百分數從81%?83%下降至71%?73% ；22min?35min內，所述流動相A的體積百分數從27%?29%上升至39%?41%，所述流動相B的體積百分數從71%?73%下降至59%?61% ；35min?45min內，所述流動相A的體積百分數保持在39%?41%,所述流動相B的體積百分數保持在59%?61% ；46min?55min內，所述流動相A的體積百分數從39%?41%上升至89%?91%，所述流動相B的體積百分數從59%?61%下降至9%?11% ; (3)、根據所述待測溶液的指紋圖譜、預定標準曲線和散結鎮痛藥品待測樣品的質量，得到散結鎮痛藥品待測樣品中所含成分的含量，所述標準曲線為散結鎮痛藥品待測樣品所含成分的對照品溶液的質量濃度與相應的峰面積之間的線性曲線。本發明采用這種梯度洗脫進行液相色譜檢測，分離出了散結鎮痛藥品中的活性成分，得到的指紋圖譜中各活性成分的色譜峰的峰形較好，且各色譜峰之間具有較好的分離度，有利于計算色譜峰的峰面積，從而得到散結鎮痛藥品待測樣品中各成分的含量。本發明提供的方法實現了對散結鎮痛藥品中各活性成分的定量測定，從而能夠更真實的反映散結鎮痛藥品的品質。
[0033]實驗結果表明，本發明提供的散結鎮痛藥品的檢測方法具有良好的重復性、穩定性以及精密度，能夠準確測定散結鎮痛藥品待測樣品中相關成分的含量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1為本發明實施例1得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0035]圖2為本發明實施例2得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0036]圖3為本發明實施例3得到的對照品溶液的指紋圖譜；
[0037]圖4為本發明實施例5得到的白藜蘆醇的標準曲線；
[0038]圖5為本發明實施例5得到的7，4’ - 二羥基黃酮的標準曲線；
[0039]圖6為本發明實施例5得到的龍血素A的標準曲線；
[0040]圖7為本發明實施例5得到的龍血素B的標準曲線；
[0041]圖8為本發明實施例5得到的紫檀芪的標準曲線；
[0042]圖9為本發明實施例8得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0043]圖10為本發明實施例9得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0044]圖11為本發明實施例11得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0045]圖12為本發明實施例12得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0046]圖13為本發明實施例13得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0047]圖14為本發明實施例14得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0048]圖15為本發明實施例31得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0049]圖16為本發明實施例32得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0050]圖17為本發明實施例33得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0051]圖18為本發明實施例34得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0052]圖19為本發明實施例35得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0053]圖20為本發明實施例36得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0054]圖21為本發明實施例37得到的龍血素A的紫外吸收曲線；
[0055]圖22為本發明實施例37得到的龍血素B的紫外吸收曲線；
[0056]圖23為本發明實施例37得到的白藜蘆醇的紫外吸收曲線；[0057]圖24為本發明實施例37得到的7，4’ - 二羥基黃酮的紫外吸收曲線；
[0058]圖25為本發明實施例37得到的紫檀芪的紫外吸收曲線；
[0059]圖26為本發明實施例38得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0060]圖27為本發明實施例39得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0061]圖28為本發明實施例40得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0062]圖29為本發明實施例41得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0063]圖30為本發明實施例42得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0064]圖31為本發明實施例43得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0065]圖32為本發明實施例44得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0066]圖33為本發明實施例45得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0067]圖34為本發明實施例46得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0068]圖35為本發明實施例47得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0069]圖36為本發明實施例48得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0070]圖37為本發明實施例49得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0071]圖38為本發明實施例50得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0072]圖39為本發明實施例51得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0073]圖40為本發明實施例52得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0074]圖41為本發明實施例53得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0075]圖42為本發明實施例54得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0076]圖43為本發明實施例63得到的待測溶液的對照指紋圖譜；
[0077]圖44為本發明實施例65得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0078]圖45為本發明實施例66得到的待測溶液的指紋圖譜；
[0079]圖46為本發明實施例67得到的待測溶液的指紋圖譜。
【具體實施方式】
[0080]本發明提供了一種散結鎮痛藥品的檢測方法，包括以下步驟:
[0081](I)、將散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物混合，得到待測溶液；
[0082](2)、將所述待測溶液進行液相色譜檢測，得到所述待測溶液的指紋圖譜，所述液相色譜檢測中的流動相包括流動相A和流動相B，所述流動相A為乙腈，所述流動相B為水或三氟乙酸，所述流動相A和流動相B的體積百分數之和為100% ;所述液相色譜檢測的洗脫程序為梯度洗脫，所述梯度洗脫為:
[0083]O?12min內，所述流動相A的體積百分數從12%?14%上升至17%?19%,所述流動相B的體積百分數從86%?88%下降至81%?83% ；
[0084]12min?22min內，所述流動相A的體積百分數從17%?19%上升至27%?29%，所述流動相B的體積百分數從81%?83%下降至71%?73% ；
[0085]22min?35min內，所述流動相A的體積百分數從27%?29%上升至39%?41%，所述流動相B的體積百分數從71%?73%下降至59%?61% ；
[0086]35min?45min內，所述流動相A的體積百分數保持在39%?41%,所述流動相B的體積百分數保持在59%?61% ；[0087]46min?55min內，所述流動相A的體積百分數從39%?41%上升至89%?91%，所述流動相B的體積百分數從59%?61%下降至9%?11% ；
[0088](3)、根據所述待測溶液的指紋圖譜、預定標準曲線和散結鎮痛藥品待測樣品的質量，得到散結鎮痛藥品待測樣品中所含成分的含量，所述標準曲線為散結鎮痛藥品待測樣品所含成分的對照品溶液的質量濃度與相應的峰面積之間的線性曲線。
[0089]本發明提供的散結鎮痛藥品的檢測方法采用液相色譜進行檢測，分離出了散結鎮痛藥品中的活性成分，得到的指紋圖譜中各活性成分的色譜峰的峰形較好，且各色譜峰之間具有較好的分離度，有利于計算色譜峰的峰面積，從而得到散結鎮痛藥品待測樣品中各成分的含量。本發明提供的方法實現了對散結鎮痛藥品中各活性成分的定量測定，從而能夠更真實的反映散結鎮痛藥品的品質。
[0090]本發明將散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物混合，得到待測溶液；優選將散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物混合后進行成分提取，固液分離后得到待測溶液。本發明對所述固液分離的方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的固液分離的技術方案即可，在本發明中，所述固液分離的方法優選為過濾。本發明對所述過濾的方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的過濾的技術方案即可；在本發明中，所述過濾的方法優選為先進行濾紙過濾，再將得到的濾液采用濾膜進行過濾；所述濾紙優選為定量濾紙；所述濾膜的孔徑優選為0.20 μ m?0.24 μ m,更優選為0.21 μ m?0.23 μ m，最優選為0.22 μ m。
[0091]本發明對所述散結鎮痛藥品待測樣品的形態沒有特殊的限制，可以直接將散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物混合，也可以將散結鎮痛藥品制備成粉末狀待測樣品。在本發明中，所述醇類化合物優選為C原子數為I?5的醇類化合物，更優選為甲醇或乙醇，最優選為甲醇，最最優選為無水甲醇；所述醇類化合物的純度優選為分析純。本發明對所述散結鎮痛藥品待測樣品和醇類化合物的來源沒有特殊的限制，如可以由市場購買獲得，具體的，本發明可以采用江蘇康緣藥業股份有限公司提供的散結鎮痛膠囊作為待測樣品；采用南京化學試劑公司提供的甲醇或乙醇。
[0092]在本發明中，所述散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物的質量比優選為1: (10?50)，更優選為1: (20?45)，最優選為1: (30?42)，最最優選為1: (35?40)。本發明為了準確得到上述質量比例的待測溶液，優選按照下述方法制備待測溶液:
[0093]精密稱定散結鎮痛藥品待測樣品后，向其中精密加入醇類化合物，將得到的混合溶液稱定重量后進行成分提取，將成分提取后的溶液冷卻后再次稱定重量，用上述醇類化合物補足成分提取減失的重量，將補足重量后的溶液混合均勻后采用濾紙進行過濾，再將得到的濾液采用濾膜再次過濾，得到待測溶液。在本發明中，所述精密稱定散結鎮痛藥品待測樣品的稱量精度為0.0Olg，所述精密加入醇類化合物的精度為1% ;所述冷卻的溫度優選為5°C?40°C，更優選為10°C?35°C，最優選為10°C?30°C。
[0094]本發明對所述混合、稱定重量、過濾、濾膜過濾、精密稱定、精密加入以及冷卻的方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的混合、稱定重量、過濾、濾膜過濾、精密稱定、精密加入以及冷卻的技術方案即可，具體的，本發明可以采用搖勻的方法將上述溶液混合均勻；采用Mettler AE240型號的電子分析天平或BP211D型號的電子分析天平對上述混合溶液進行稱定重量以及精密稱定散結鎮痛藥品待測樣品；采用自然冷卻的方法將上述成分提取后的溶液冷卻。[0095]在本發明中，所述成分提取的方法優選為超聲波提取或回流提取；所述超聲波提取的超聲功率優選為240W?260W，更優選為245W?255W，最優選為250W ;所述超聲波提取的超聲頻率優選為30KHz?50KHz，更優選為35KHz?45KHz，最優選為40KHz。所述回流提取的溫度優選為80°C?98°C，更優選為85°C?95°C，最優選為90°C ;所述回流提取的時間優選為40min?80min,更優選為50min?70min,最優選為60min。的時間優選為；本發明更優選采用超聲波進行成分提取；本發明對所述超聲波提取采用的儀器沒有特殊的限制，如可以采用昆山市超聲儀器有限公司提供的KQ-250DB型數控超聲波清洗器。在本發明中，所述成分提取的時間優選為15min?60min,更優選為20min?40min,最優選為25min?35min。
[0096]得到待測溶液后，本發明將待測溶液進行液相色譜檢測，得到所述待測溶液的指紋圖譜。本發明優選精密吸取待測溶液，將其注入液相色譜儀，進行液相色譜檢測，得到所述待測溶液的指紋圖譜。在本發明中，所述精密吸取待測溶液的精度為1%;本發明對所述吸取的方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的吸取的技術方案即可。在本發明中，所述待測溶液的用量優選為3 μ L?8 μ L，更優選為4 μ L?6 μ L，最優選為5 μ L。在本發明中，所述液相色譜檢測中的流動相包括流動相A和流動相B，所述流動相A為乙腈，所述流動相B為水或三氟乙酸，所述流動相A和流動相B的體積百分數之和為100%。在本發明中，所述流動相B優選為水，更優選為超純水；所述乙腈和三氟乙酸的純度優選為色譜純。本發明對所述乙腈、三氟乙酸和超純水的來源沒有特殊的限制，如可以由市場購買獲得，具體的，本發明可以采用美國天地公司提供的乙腈和三氟乙酸。
[0097]在本發明中，所述液相色譜檢測的洗脫程序為梯度洗脫，所述梯度洗脫具體為:
[0098]O?12min內，所述流動相A的體積百分數從12%?14%上升至17%?19%,所述流動相B的體積百分數從86%?88%下降至81%?83% ;優選的，所述流動相A的體積百分數從13%上升至18%，所述流動相B的體積百分數從87%下降至82% ；
[0099]12min?22min內，所述流動相A的體積百分數從17%?19%上升至27%?29%，所述流動相B的體積百分數從81%?83%下降至71%?73% ;優選的，所述流動相A的體積百分數從18%上升至28%，所述流動相B的體積百分數從82%下降至72% ；
[0100]22min?35min內，所述流動相A的體積百分數從27%?29%上升至39%?41%，所述流動相B的體積百分數從71%?73%下降至59%?61% ;優選的，所述流動相A的體積百分數從28%上升至40%，所述流動相B的體積百分數從72%下降至60% ；
[0101]35min?45min內，所述流動相A的體積百分數保持在39%?41%,所述流動相B的體積百分數保持在59%?61% ;優選的，所述流動相A的體積百分數保持在40%，所述流動相B的體積百分數保持在60% ；
[0102]46min?55min內，所述流動相A的體積百分數從39%?41%上升至89%?91%,所述流動相B的體積百分數從59%?61%下降至9%?11% ;優選的，所述流動相A的體積百分數從40%上升至90%，所述流動相B的體積百分數從60%下降至10% ；
[0103]本發明對所述流動相的體積百分數變化的方式沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的梯度洗脫中流動相的體積百分數變化方式即可，如可以采用線性變化的方式，具體的，在本發明中，所述梯度洗脫中流動相A的體積百分數優選線性上升，流動相B的體積百分數優選線性下降。在本發明中，所述流動相的流速優選為1.5mL.min-1?2.0mT,.min \ 更優選為 1.6mL.min 1 ~1.8mL.min \ 最優選為 1.7mL.min、
[0104]在本發明中，所述液相色譜檢測中的色譜柱優選為Waters Symmetry@C18型號的色譜柱、Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 型號的色譜柱或 Phenomenex Kinetex2.6uC18100A型號的色譜柱，更優選為Phenomenex Kinetex2.6u C18100A型號的色譜柱；在本發明中，所述色譜柱填充劑優選為十八烷基硅烷鍵合硅膠。
[0105]在本發明中，所述液相色譜檢測的色譜柱柱溫優選為30°C~45°C，更優選為35°〇~421:，最優選為40°C;所述液相色譜檢測的檢測器優選為紫外檢測器，所述檢測的波長優選為260nm~300nm,更優選為270nm~290nm,最優選為280nm。
[0106]本發明對所述液相色譜檢測使用的儀器沒有特殊的限制，可以采用Agilentl290型號的超高壓液相色譜儀或Agilentl200SL型號的液相色譜儀，采用DAD紫外檢測器。
[0107]得到所述待測溶液的指紋圖譜，本發明優選根據所述待測溶液的指紋圖譜與預定的對照品溶液的指紋圖譜，對散結鎮痛藥品待測樣品進行定性檢測。在本發明中，所述預定的對照品溶液的指紋圖譜優選按照以下步驟獲得:
[0108]制備對照品溶液；
[0109]將對照品溶液進行液相色譜檢測，得到對照品溶液的指紋圖譜。
[0110]在本發明中，所述對照品優選包括白藜蘆醇、7，4 ’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B和紫檀芪。本發明優選將白藜蘆醇、7，4’- 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪與醇類化合物混合，得到對照品溶液；更優選精密稱定白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B和紫檀芪后將其混合，再加入醇類化合物，得到對照品溶液。在本發明中，所述對照品溶液中白藜蘆醇的質量濃度優選為20 μ g/mL~40 μ g/mL,更優選為25 μ g/mL~35 μ g/mL,最優選為30 μ g/mL ;所述對照品溶液中7，4’ - 二羥基黃酮的質量濃度優選為20 μ g/mL~40y g/mL,更優選為25 μ g/mL~35 μ g/mL,最優選為30 μ g/mL ;所述對照品溶液中龍血素A的質量濃度優選為20 μ g/mL~40 μ g/mL,更優選為25 μ g/mL~35 μ g/mL,最優選為30 μ g/mL ;所述對照品溶液中龍血素B的質量濃度優選為30 μ g/mL~50 μ g/mL,更優選為35 μ g/mL~45 μ g/mL,最優選為40 μ g/mL ;所述對照品溶液中紫檀苗的質量濃度優選為90 μ g/mL~110 μ g/mL,更優選為95 μ g/mL~105 μ g/mL,最優選為100 μ g/mL。本發明對所述精密稱定和混合的方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的精密稱定和混合的技術方案，將白藜蘆醇、7，4’- 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪與醇類化合物稱量準確、混合均勻即可。
[0111]在本發明中，所述白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮和紫檀芪的純度優選大于99wt%;所述醇類化合物與上述技術方案所述醇類化合物一致，在此不再贅述。本發明對所述白藜蘆醇、7，4’- 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪和醇類化合物的來源沒有特殊的限制，可以由市場購買獲得，具體的，本發明可以采用陜西永健制藥有限公司提供的白藜蘆醇、杭州廣林生物醫藥科技有限公司提供的紫檀芪、中國藥品`生物制品檢定所提供的用于含量測定的龍血素A和龍血素B ；中國食品藥品檢定研究院提供的7，4’- 二羥基黃酮；南京化學試劑公司提供的甲醇或乙醇。
[0112]得到對照品溶液后，本發明將得到的對照品溶液優選按照上述技術方案所述的對散結鎮痛藥品樣品待測溶液進行液相色譜檢測的方法進行液相色譜檢測，得到對照品溶液的指紋圖譜，在此不再贅述；[0113]得到對照品溶液的指紋圖譜后，本發明將對照品溶液的指紋圖譜與上述技術方案所述散結鎮痛藥品樣品待測溶液的指紋圖譜進行比對，對散結鎮痛藥品待測樣品進行定性測定，指認出散結鎮痛藥品樣品待測溶液的指紋圖譜中的色譜峰。本發明提供的方法能夠對散結鎮痛藥品樣品中的相關成分進行定量的檢測，所述定量檢測的方法具體為:
[0114]根據預定的標準曲線、上述技術方案得到的待測溶液的指紋圖譜與所述散結鎮痛藥品待測樣品的質量，得到散結鎮痛藥品待測樣品中成分的含量；在本發明中，所述標準曲線為散結鎮痛藥品待測樣品所含成分的對照品溶液的質量濃度與相應的峰面積之間的線性曲線，優選按照以下方法獲得:
[0115]將所述散結鎮痛藥品待測樣品所含成分的對照品制備成系列濃度的對照品溶液；
[0116]將所述系列濃度的對照品溶液進行液相色譜檢測，得到指紋圖譜；
[0117]根據所述指紋圖譜中各色譜峰的峰面積及對應的對照品溶液中對照品的質量濃度，得到標準曲線。
[0118]在本發明中，所述對照品優選包括白藜蘆醇、7，4 ’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B和紫檀芪；本發明優選將白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪與醇類化合物混合，得到對照品溶液的母液，將所述母液用上述醇類化合物逐倍稀釋，得到系列濃度的對照品溶液；
[0119]本發明對所述混合和稀釋的方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的制備對照品溶液的技術方案即可；本發明對所述母液中白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B和紫檀芪的濃度以及所述母液稀釋的倍數沒有特殊的限制，能夠確定母液及其稀釋后的溶液中白藜蘆醇、7，4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B和紫檀芪的質量濃度值即可；在本發明中，所述白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪與醇類化合物和上述技術方案所述白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀芪與醇類化合物一致，在此不再贅述。
[0120]制備得到系列濃度的對照品溶液后，本發明分別對各濃度的對照品溶液進行液相色譜檢測，得到指紋圖譜；在本發明中，所述液相色譜檢測的方法與上述技術方案所述對散結鎮痛藥品樣品待測溶液的液相色譜檢測方法一致，在此不再贅述；
[0121]得到系列濃度對照品溶液的指紋圖譜后，本發明計算得到所述指紋圖譜中各色譜峰的峰面積。本發明在計算色譜峰面積的過程中優選以龍血素B為參照物，本發明的檢測方法建立的指紋圖譜是主要針對散結鎮痛藥品中龍血竭酚類化合物建立的指紋圖譜，發明人研究發現，龍血素B在指紋圖譜中的保留時間適中，分離較好，對照品易得，因此選擇龍血素B作為參照物。本發明對所述計算色譜峰面積的方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的計算色譜峰面積的技術方案即可，如本發明可以采用Agilent ChemStation軟件計算上述對照品溶液指紋圖譜中各色譜峰的峰面積。
[0122]得到所述對照品溶液指紋圖譜中各色譜峰的峰面積后，本發明根據所述色譜峰的峰面積及其對應的對照品在對照品溶液中的質量濃度，得到散結鎮痛藥品待測樣品所含成分的標準曲線。本發明優選將色譜峰的峰面積值作為縱坐標，對應的對照品在對照品溶液中的質量濃度值作為橫坐標，進行線性擬合，得到標準曲線。
[0123]本發明優選以白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B和紫檀芪為對照品，分別得到白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B和紫檀芪的標準曲線。在本發明中，所述白藜蘆醇標準曲線的回歸方程為Y1=Ie.906\-51.701，其中Y1為指紋圖譜中白藜蘆醇的色譜峰面積，X1為待測溶液中白藜蘆醇的質量濃度，相關系數R1為0.9999 ;所述7，4’ - 二羥基黃酮標準曲線的回歸方程為Y2=15.722X2+0.4522，其中Y2為指紋圖譜中
7,4’ - 二羥基黃酮的色譜峰面積，X2為待測溶液中7，4’ - 二羥基黃酮的質量濃度，相關系數民為I ;所述龍血素A標準曲線的回歸方程為Y3=I0.217X3-1.162，其中Y3為指紋圖譜中龍血素A的色譜峰面積，X3為待測溶液中龍血素A的質量濃度，相關系數R3為I ;所述龍血素B標準曲線的回歸方程為Y4=8.1063X4-2.4522，其中Y4為指紋圖譜中龍血素B的色譜峰面積，X4為待測溶液中龍血素B的質量濃度，相關系數R4為I ;所述紫檀芪標準曲線的回歸方程為Y5=14.5754XS-153.6806，其中Y5為指紋圖譜中紫檀芪的色譜峰面積，X5為待測溶液中紫檀芪的質量濃度，相關系數R5為0.9998。
[0124]得到標準曲線后，本發明根據上述技術方案得到的待測溶液的指紋圖譜、所述標準曲線和散結鎮痛藥品待測樣品的質量，得到所述散結鎮痛藥品待測樣品中所含成分的含量。本發明優選按照上述技術方案所述計算色譜峰面積的方法，計算得到待測溶液指紋圖譜中各色譜峰的峰面積，根據得到的各色譜峰的峰面積及相應的標準曲線，得到待測溶液中各組分的質量濃度；根據所述待測溶液的體積和待測溶液中各組分的質量濃度，得到所述待測溶液中各組分的質量；根據所述待測溶液中各組分的質量和散結鎮痛藥品待測樣品的質量，得到散結鎮痛藥品待測樣品中所含組分的含量。本發明優選測定得到散結鎮痛藥品待測樣品中白藜蘆醇、7，4’ - 二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B和紫檀芪的含量。
[0125]本發明提供的散結鎮痛藥品的檢測方法，采用液相色譜進行檢測，分離出了散結鎮痛藥品中的活性成分，得到的指紋圖譜中各活性成分的色譜峰的峰形較好，且各色譜峰之間具有較好的分離度，有利于計算色譜峰的峰面積，從而得到散結鎮痛藥品待測樣品中各成分的含量。本發明提供的方法實現了對散結鎮痛藥品中各活性成分的定量測定，從而能夠更真實的反映散結鎮痛藥品的品質。
[0126]本發明對提供的散結鎮痛藥品的檢測方法進行了方法學的考察，主要包括:待測溶液和對照品溶液的穩定性考察、精密度考察以及檢測方法的重復性考察；在進行考察過程中測試了對照品的加樣回收率以及定量限與檢測限。本發明對所述穩定性、精密度、重復性的考察方法以及加樣回收率和定量限與檢測限的檢測方法沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的考察穩定性、精密度、重復性的技術方案以及檢測加樣回收率和定量限與檢測限的方法即可。
[0127]本發明待測溶液的穩定性考察結果說明，本發明提供的方法制備的待測溶液在24小時內具有良好的穩定性；本發明對照品溶液的穩定性考察結果說明，本發明提供的方法制備的對照品溶液在24小時內具有良好的穩定性；本發明待測溶液的精密度考察結果說明，本發明提供的方法制備的待測溶液具有良好的精密度；本發明對照品溶液的精密度考察結果說明，本發明提供的方法制備的對照品溶液具有良好的精密度；本發明檢測方法的重復性考察結果說明，本發明提供的散結鎮痛藥品的檢測方法具有良好的重復性；本發明對照品的加樣回收率檢測結果說明，本發明提供的檢測方法能準確測定散結鎮痛藥品中相關成分的含量；本發明對照品的定量限與檢測限的檢測結果為，白藜蘆醇的定量限為4.85ng、檢測限為1.21ng ；7, 4，- 二輕基黃酮的定量限為2.14ng、檢測限為1.07ng ;龍血素A的定量限為7.19ng、檢測限為0.90ng ;龍血素B的定量限為6.30ng、檢測限為1.58ng ;紫檀芪的定量限為7.41ng、檢測限為1.80ng，這說明，本發明提供的方法對散結鎮痛藥品待測樣品所含組分的測定具有較高的靈敏度。
[0128]為了進一步了解本發明，下面結合實施例對本發明提供的散結鎮痛藥品的檢測方法進行詳細描述，但不能將它們理解為對本發明保護范圍的限定。
[0129]以下各實施例中，液相色譜檢測采用的儀器為:Agilentl290超高壓液相色譜儀、DAD紫外檢測器；
[0130]超聲波提取采用的儀器為:KQ_250DB型數控超聲波清洗器；
[0131]稱定重量采用的儀器為:Mettler AE240電子分析天平和BP211D電子分析天平；
[0132]所用的散結鎮痛藥品為江蘇康緣藥業股份有限公司提供的散結鎮痛膠囊；所用的龍血素A的產品批號為111660-200402、龍血素B的產品批號為111558-200303，龍血素A和龍血素B均為中國藥品生物制品檢定所提供的用于含量測定的龍血素A和龍血素B ;所用的紫檀芪的產品批號為20110723，購買于杭州廣林生物醫藥科技有限公司；所用的白藜蘆醇購買于陜西永健制藥有限公司；所用的乙腈和三氟乙酸均為色譜純，購買于美國天地公司；所用的甲醇和乙醇均為分析純，購買于南京化學試劑公司；7，4’ - 二羥基黃酮購買于中國食品藥品檢定研究院。
[0133]實施例1
[0134]精確稱量散結鎮痛藥品粉末樣品lg，將其置于具塞錐形瓶中，向具塞錐形瓶中精密加入無水乙醇25mL，將得到的混合溶液采用250W、40KHz的超聲波進行成分提取30分鐘，將成分提取后的溶液冷卻到10°C，將冷卻后的溶液過濾，取續濾液過0.22 μ m的濾膜，得到待測溶液；
[0135]將上述制備得到的待測溶液進行液相色譜檢測，檢測的條件具體為:
[0136]以十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；
[0137]色譜柱型號為Phenomenex Kinetex2.6u C18100A,色譜柱柱長為100mm,內徑為
4.6mm，粒徑為 2.6 μ m ;
[0138]色譜柱柱溫為40°C;
[0139]以乙腈為流動相A，以超純水為流動相B，所述流動相A和流動相B的體積百分數之和為100%，進行梯度洗脫:
[0140]O?12min內，所述流動相A的體積百分數從13%線性上升至18%,所述流動相B的體積百分數從87%線性下降至82% ；
[0141]12min?22min內，所述流動相A的體積百分數從18%線性上升至28%,所述流動相B的體積百分數從82%線性下降至72% ；
[0142]22min?35min內，所述流動相A的體積百分數從28%線性上升至40%,所述流動相B的體積百分數從72%線性下降至60% ；
[0143]35min?45min內，所述流動相A的體積百分數保持在40%,所述流動相B的體積百分數保持在60% ；
[0144]46min?55min內，所述流動相A的體積百分數從40%線性上升至90%,所述流動相B的體積百分數從60%線性下降至10% ；
[0145]所述流動相A和流動相B的流速為1.7mL.mirT1 ；[0146]檢測波長為280nm。
[0147]將本發明實施例1制備的待測溶液進行液相色譜檢測得到的指紋圖譜如圖1所示，圖1為本發明實施例1得到的待測溶液的指紋圖譜，根據得到的指紋圖譜計算實施例1得到的待測溶液中主要成分的含量，所述待測溶液中主要成分的含量以單位質量的主要成分的峰面積表示，計算方法為將指紋圖譜中主要成分的峰面積乘以待測溶液的稀釋倍數除以待測溶液的取樣量，計算結果如表1所示，表1為本發明實施例1和實施例2得到的待測溶液中主要成分的含量。
[0148]實施例2
[0149]采用實施例1的技術方案檢測得到待測溶液的指紋圖譜，并根據得到的指紋圖譜計算指紋圖譜中色譜峰的；不同的是，本實施例采用回流提取的方法替換實施例1中的超聲提取，回流提取的時間為60分鐘；檢測結果如圖2和表1所示，圖2為本發明實施例2得到的待測溶液的指紋圖譜。
[0150]表1本發明實施例1和實施例2得到的待測溶液中主要成分的含量
【權利要求】
1.一種散結鎮痛藥品的檢測方法，包括以下步驟: (1)、將散結鎮痛藥品待測樣品與醇類化合物混合，得到待測溶液； (2)、將所述待測溶液進行液相色譜檢測，得到所述待測溶液的指紋圖譜，所述液相色譜檢測中的流動相包括流動相A和流動相B,所述流動相A為乙腈,所述流動相B為水或三氟乙酸，所述流動相A和流動相B的體積百分數之和為100% ； 所述液相色譜檢測的洗脫程序為梯度洗脫，所述梯度洗脫為: O~12min內，所述流動相A的體積百分數從12%~14%上升至17%~19%,所述流動相B的體積百分數從86%~88%下降至81%~83% ； 12min~22min內，所述流動相A的體積百分數從17%~19%上升至27%~29%，所述流動相B的體積百分數從81%~83%下降至71%~73% ； 22min~35min內，所述流動相A的體積百分數從27%~29%上升至39%~41%，所述流動相B的體積百分數從71%~73%下降至59%~61% ； 35min~45min內，所述流動相A的體積百分數保持在39%~41%,所述流動相B的體積百分數保持在59%~61% ； 46min~55min內，所述流動相A的體積百分數從39%~41%上升至89%~91%,所述流動相B的體積百分數從59%~61%下降至9%~11% ； (3)、根據所述待測 溶液的指紋圖譜、預定標準曲線和散結鎮痛藥品待測樣品的質量，得到散結鎮痛藥品待測樣品中所含成分的含量，所述標準曲線為散結鎮痛藥品待測樣品所含成分的對照品溶液的質量濃度與相應的峰面積之間的線性曲線。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇類化合物為C原子數為I~5的醇類化合物。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述醇類化合物為乙醇或甲醇。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述醇類化合物為無水甲醇。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脫具體為: O~12min內，所述流動相A的體積百分數從13%上升至18%,所述流動相B的體積百分數從87%下降至82% ； 12min~22min內，所述流動相A的體積百分數從18%上升至28%,所述流動相B的體積百分數從82%下降至72% ； 22min~35min內，所述流動相A的體積百分數從28%上升至40%,所述流動相B的體積百分數從72%下降至60% ； 35min~45min內，所述流動相A的體積百分數保持在40%,所述流動相B的體積百分數保持在60% ； 46min~55min內，所述流動相A的體積百分數從40%上升至90%,所述流動相B的體積百分數從60%下降至10%。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述流動相的流速為1.5mL.min-1~2.0mT,.mirf1。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色譜檢測的檢測器為紫外檢測器； 檢測波長為260nm~300nm。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色譜檢測中的色譜柱柱溫為30°C~45°C。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)為: 將散結鎮痛藥品待測樣品溶于醇類化合物中，超聲提取，得到待測溶液。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述超聲提取的時間為15分鐘~60分 鐘。
【文檔編號】G01N30/06GK103760276SQ201310648506
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月4日 優先權日:2013年12月4日
【發明者】蕭偉, 王振中, 秦建平, 李家春, 陳寶來, 文紅梅, 吳建雄 申請人:江蘇康緣藥業股份有限公司