高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。1）食物過敏原蛋白偶聯磁珠，所述的食物過敏原包括但不限于水產類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白；2）構建標準曲線：梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標準品與食物過敏原蛋白偶聯磁珠進行免疫反應，然后利用抗人IgG二抗進行信號放大反應，根據平均吸光度值和相應的濃度進行線性回歸，構建標準曲線；3）篩查食物過敏原，利用食物過敏原蛋白偶聯磁珠與過敏患者的血清進行免疫反應，然后利用抗人IgG二抗進行信號放大反應，然后確定食物過敏原的種類及對應的抗體的濃度。本發明靈敏度范圍不高于2pg/mL，可適用于轉基因食品的過敏原檢測。
【專利說明】高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及食物安全及過敏檢測領域，尤其涉及一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]過敏性疾病影響全世界近四分之一的人口，被世界衛生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一。食物過敏醫學上也稱變態反應，是指機體受抗原(包括半抗原)刺激后，產生相應的抗體或致敏淋巴細胞，當再次接觸同一種抗原后在體內引起體液或細胞免疫反應，由此導致組織損傷或機體生理機能障礙。它是一種復發率很高的疾病。據食品過敏或過敏性反應網絡統計，約有90%的過敏反應是由花生、果仁、魚、貝類、雞蛋、牛奶、大豆、魚蝦、蘑菇和小麥等食物引起(以花生引起的過敏最為嚴重)，10%的過敏是由170多種其他食物引起。根據流行病學調查，近年來過敏癥發病率呈逐年上升的趨勢。據調查西方大概有20-25%的人受過過敏原的襲擾，我國大約有5-10%的人受過敏原的襲擾。上海、浙江、廣東等沿海地區收過敏原襲擾的人群已超過10%，隨著工業的快速發展，生活水平的提高，飲食的改善，受過敏原襲擾的人群每年以1.5%的速度增加。美國每年約有29T2.5%的人發生食物過敏，兒童及嬰幼兒的發病率約59T8%。據不完全統計，我國的發病率高于發達國家。目前，隨著科技進步和經濟的發展，產生了諸多新的食品資源，以及食品生產、流通、消費方式的改變，傳統的食物過敏的地域性打破，并且隨著轉基因作物的大量出現，許多新的轉基因食品大量涌現，也使得食物過敏更具備了潛在的危險性。食物過敏在相當大的程度上危害著過敏人群的健康，保護消費者食品安全已經成為食品安全管理部門及食品生產企業所面臨的重要問題。
[0003]許多人在直接或者間接接觸這些過敏原之后，會因過敏而患上支氣管哮喘、上呼吸道結膜炎、濕疹、皮炎等癥，有時甚至產生危及生命的過敏性休克。因此迫切需要從眾多食物中篩查出隱藏的過敏原，讓易敏者避開含有致敏成分的食物以及治療過敏反應，同時排除類似過敏癥狀慢性疾病的誤診。過敏患者由于攝入引發過敏反應的食物過敏原蛋白后，體內嗜堿粒細胞和肥大細胞脫顆粒化引起特異性的IgG沉淀抗體進入血液，使血液中這種特異性IgG抗體水平提高。該特異性IgG抗體在體外能識別其對應的抗原，即食物過敏原蛋白，并與之結合。
[0004]對于過敏原性的檢測，體內實驗方法可提供最為直接的證據，如雙盲食物激發試驗和皮膚針刺試驗，但由于安全因素等方面的考慮，只有在不得已的情況下在醫院進行，而且費用昂貴、風險大；與此相比體外實驗方法具有方便、安全的優點，但卻存在著準確性差的缺點。隨著科技的發展，未來食品過敏原檢測將向準確、安全、經濟、快速、高通量、高靈敏度的體外檢測技術方向發展。
[0005]食物過敏原診斷試劑的種類很多，影響試劑質量的因素也很多，為保證試劑質量需要盡可能的提高技術指標。靈敏度作為一項重要的技術指標，對試劑盒的評價具有重要的意義。因為極少量的分析物可能對界定疾病狀態、疾病篩查有重要意義。在食物過敏原檢測中體內產生的抗體是十分微量的，而市場上現有技術大多只能達到納克級，在檢測低于此濃度時就變得比較困難，而難以達到預期目的。
【發明內容】
[0006]為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種高靈敏食物過敏原檢測方法及其試劑盒。
[0007]一種高靈敏食物過敏原檢測方法，步驟如下:
1)食物過敏原蛋白偶聯磁珠，所述的食物過敏原包括但不限于水產類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白；
2)構建標準曲線:梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標準品與食物過敏原蛋白偶聯磁珠進行免疫反應，然后利用抗人IgG 二抗進行信號放大反應，根據平均吸光度值和相應的濃度進行線性回歸，構建標準曲線；
3)篩查食物過敏原，利用食物過敏原蛋白偶聯磁珠與過敏患者的血清進行免疫反應，然后利用抗人IgG 二抗進行信號放大反應，然后根據得到的信號與步驟2)所得的標準曲線確定食物過敏原的種類及對應的抗體的濃度。
[0008]所述的信號放大反應為顯色反應。
[0009]所述的步驟3)中確定食物過敏原的種類的cut-off值設定為抗體濃度Ing/mL的值在標準曲線對應的吸光度值。
[0010]所述的步驟I)中，具體方法如下: 1.1)取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把離心管置于搖床上，室溫條件下活化30min ；
1.2)將離心管置于磁力架上吸住磁珠，棄掉清液，并向離心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液；重復洗滌3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液；
1.3)再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白luL，把離心管置于搖床上，40 °C條件下反應45min ；
1.4)重復1.2)的洗滌步驟；
1.5)加入4.9901^ 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液，4°C條件下封閉保
存待用。
[0011]所述的步驟3)中，具體方法如下:
3.1)取若干只2mL的離心管，分別加入300uL偶聯食物過敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，如此洗滌3次。最后吸干；
3.2)向洗滌后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀釋的抗體，室溫條件下孵育40min ；
3.3)孵育結束后，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，再加入300uL的PBS洗滌液，漩渦震蕩，再用磁力架吸住磁珠，如此洗滌5次，最后吸干液體；
3.4)向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標記的二抗120uL，含20%甘油，室溫條件下孵育40min ；
3.5)重復步驟3.3)； 3.6)向洗滌后的磁珠中加入IOOuL的TMB顯色液，避光反應15min ；
3.7)避光反應后，向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液，終止反應，并把液體轉移到酶標板上；
3.8)用酶標儀讀取吸光度值；
3.9)結果計算。
[0012]所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者無基團,粒徑大小在100nnT3um。
[0013]食物過敏原檢測試劑盒，它包括但不限于已包被的水產類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白中的一種或多種的磁性納米微球、人IgG標準液、辣根過氧化物酶標記二抗、TMB、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，靈敏度范圍不高于2pg/mL。
[0014]所述的試劑盒，適用于轉基因食品的過敏原檢測。
[0015]本發明的有益效果:將磁珠作為固相載體，來代替ELISA檢測中的酶標板微孔。此固相載體相比于普通ELISA的酶標板微孔擁有更大的表面負載量，并且可以對目標物質具有更強的富集作用，通過外加磁場和洗滌的過程可以對目標物起到一個濃縮的作用，最終提高食物過敏原檢測的靈敏度、準確性和線性范圍。靈敏度范圍不高于2pg/mL，可適用于轉基因食品的過敏原檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1是實施例四中試劑線性實驗的結果示意圖；
圖2是實施例試劑線性實驗的結果示意圖。
【具體實施方式】
[0017]以下結合附圖和實施例對本發明做進一步的說明。
[0018]本發明的食物過敏原檢測試劑盒，其組成包括已包被的水產類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白的磁性納米微球，人IgG標準液、辣根過氧化物酶標記二抗，TMB，樣品稀釋液，洗滌液和終止液。
[0019]1、食物過敏原蛋白偶聯磁珠
①取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把離心管置于搖床上，室溫條件下活化30min。
[0020]②將離心管置于磁力架上吸住磁珠，棄掉清液，并向離心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸鹽緩沖液；如此重復洗滌3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液。
[0021]③再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL，l%牛血清蛋白luL，把離心管置于搖床上，40°C條件下反應45min。
[0022]④重復②的洗滌步驟。
[0023]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液，4°C條件下封閉保存。待用。
[0024]2、食物過敏原檢測試劑盒的使用方法①取若干只2mL的離心管，分別加入300uL偶聯食物過敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，如此洗滌3次。最后吸干。
[0025]②向洗滌后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)梯度稀釋的抗體,室溫條件下孵育 40min。
[0026]③孵育結束后，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，再加入300uL的PBS洗滌液，漩渦震蕩，再用磁力架吸住磁珠，如此洗滌5次，最后吸干液體。
[0027]④向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標記的二抗120uL (含20%甘油)，室溫條件下孵育40min。
[0028]⑤重復步驟③。
[0029]⑥向洗滌后的磁珠中加入1OOuL的TMB顯色液，避光反應15min。
[0030]⑦避光反應后，向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液，終止反應。并把液體轉移到酶標板上。
[0031]⑧用酶標儀讀取吸光度值。
[0032]⑨結果計算 取重復孔平行三次的吸光度平均值；以系列標準溶液的平均吸光度值和相應的濃度進行線性回歸，構建標準曲線；計算樣品重復孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL對應的吸光度)的那個吸光度值從標準曲線中計算出食物過敏原抗體的含量，此含量反應了患者的過敏程度。
[0033]實施例一
I對蝦過敏原蛋白偶聯磁珠
①取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、ImL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和IOOuL 100mg/mL的NHS溶液，把離心管置于搖床上，室溫條件下活化30min。
[0034]②將離心管置于磁力架上吸住磁珠，棄掉清液，并向離心管中加入5mL 50mMpH6.5的磷酸鹽緩沖液；如此重復洗滌3次，最后一次加入4.499mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液。
[0035]③再向其中加入5ug/mL的對奸過敏原蛋白500uL (對奸過敏原是一種相對分子質量約36Kd的酸性糖蛋白，屬肌肉中的原肌球蛋白。蛋白濃度1.5mg/mL，溶于PBS，效價≥1:1000-5000。)，1%牛血清蛋白luL，把離心管置于搖床上，40°C條件下反應45min。
[0036]④重復②的洗滌步驟。
[0037]⑤加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與IOuL 1%BSA溶液，4°C條件下封閉保存。待用。
[0038]2對蝦過敏原抗體的檢測方法
①取3只2mL的離心管，分別加入300uL偶聯對蝦過敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，如此洗滌3次。最后吸干。
[0039]②向洗滌后的磁珠中加入120uL (含20%甘油)的小鼠抗對蝦過敏原蛋白單克隆抗體(溶于 PBS，pH7.4 中，蛋白濃度 lmg/mL，含 BSA 等穩定劑，ELISA(1:500)，IHC(1:200)，IP (1:50), WB (1:300)。)，室溫條件下孵育 40min。
[0040]③孵育結束后，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，再加入300uL的PBS洗滌液，漩渦震蕩，再用磁力架吸住磁珠，如此洗滌5次，最后吸干液體。
[0041]④向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標記的二抗120uL (含20%甘油)，室溫條件下孵育40min。
[0042]⑤重復步驟③。
[0043]⑥向洗滌后的磁珠中加入IOOuL的TMB顯色液，避光反應15min。
[0044]⑦避光反應后，向其中加入IOOuL ImoL/L的鹽酸溶液，終止反應。并把液體轉移到酶標板上。
[0045]⑧用酶標儀讀取吸光度值。
[0046]⑨結果計算
取重復孔平行三次的吸光度平均值；以系列標準溶液的平均吸光度值和相應的濃度進行線性回歸，構建標準曲線；計算樣品重復孔的平均吸光度值大于CUt-Off值(Ing/mL對應的吸光度)的那個吸光度值從標準曲線中計算出對蝦過敏原抗體的含量。特異性達91.3%。
[0047]實施例二:食物過敏原篩查試驗
對35例食物過敏患者抽取血液，將其制備血清，來篩查食物過敏原。檢測吸光度值，計算抗體濃度，其中值大于cut-off值(Ing/mL對應的吸光度)的判斷為陽性。其檢測結果如下表1所示:
表1
【權利要求】
1.一種高靈敏食物過敏原檢測方法，其特征在于，步驟如下: 1)食物過敏原蛋白偶聯磁珠，所述的食物過敏原包括但不限于水產類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白； 2)構建標準曲線:梯度稀釋抗食物過敏原的IgG抗體標準品與食物過敏原蛋白偶聯磁珠進行免疫反應，然后利用抗人1gG 二抗進行信號放大反應，根據平均吸光度值和相應的濃度進行線性回歸，構建標準曲線； 3)篩查食物過敏原，利用食物過敏原蛋白偶聯磁珠與過敏患者的血清進行免疫反應，然后利用抗人1gG 二抗進行信號放大反應，然后根據得到的信號與步驟2)所得的標準曲線確定食物過敏原的種類及對應的抗體的濃度。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的信號放大反應為顯色反應。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中確定食物過敏原的種類的cut-off值設定為抗體濃度1ng/mL的值在標準曲線對應的吸光度值。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟1)中，具體方法如下: .1.1)取一只5mL的離心管向其中分別加入3.84mL 50mM pH4.0的磷酸鹽緩沖液、1mL5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和1OOuL 100mg/mL的NHS溶液，把離心管置于搖床上，室溫條件下活化30min ； .1.2)將離心管置于磁力架上吸住磁珠，棄掉清液，并向離心管中加入5mL50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液；重復洗滌3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液； .1.3)再向其中加入5ug/mL的食物過敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白luL，把離心管置于搖床上，40 °C條件下反應45min ； .1.4)重復1.2)的洗滌步驟； .1.5)加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸鹽緩沖液與1OuL 1%BSA溶液，4°C條件下封閉保存待用。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中，具體方法如下: .3.1)取若干只2mL的離心管，分別加入300uL偶聯食物過敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸鹽緩沖液，如此洗滌3次； 最后吸干； .3.2)向洗滌后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀釋的抗體，室溫條件下孵育40min ； .3.3)孵育結束后，用磁力架吸住磁珠，棄掉清液，再加入300uL的PBS洗滌液，漩渦震蕩，再用磁力架吸住磁珠，如此洗滌5次，最后吸干液體； .3.4)向洗滌后的磁珠中加入100ng/mL的辣根過氧化物酶標記的二抗120uL，含20%甘油，室溫條件下孵育40min ； .3.5)重復步驟3.3)； .3.6)向洗滌后的磁珠中加入1OOuL的TMB顯色液，避光反應15min ； .3.7)避光反應后，向其中加入1OOuL 1moL/L的鹽酸溶液，終止反應，并把液體轉移到酶標板上； .3.8)用酶標儀讀取吸光度值； .3.9)結果計算。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者無基團，粒徑大小在100nnT3um。
7.一種根據權利要求1所述的方法的食物過敏原檢測試劑盒，其特征在于，它包括但不限于已包被的水產類、奶類、蛋類、肉類、谷物類、堅果類、水果類、蔬菜類、豆類食物過敏原蛋白中的一種或多種的磁性納米微球、人IgG標準液、辣根過氧化物酶標記二抗、TMB、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，靈敏度范圍不高于2pg/mL。
8.根據權利要 求7所述的試劑盒，其特征在于，適用于轉基因食品的過敏原檢測。
【文檔編號】G01N33/68GK103616520SQ201310645509
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】沈曉亮, 錢兵, 劉意, 宋偉杰, 方序, 葉俊英, 董婧 申請人:浙江天科高新技術發展有限公司, 杭州賽恩生物技術有限公司