KatushkaS158A熒光蛋白的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種KatushkaS158A熒光蛋白的新應用，屬于免疫學和光學成像領域。所述KatushkaS158A熒光蛋白既可以作為模型抗原用于免疫學的活體光學成像，又可以用于熒光標記成像，有望替代傳統OVA等模型抗原，更直接且無干擾地用于免疫光學成像研究。
【專利說明】KatushkaSI 58A巧光蛋白的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫學和光學成像領域，具體涉及一種Ka化shkaS158A英光蛋白的新 應用。
【背景技術】
[0002] 英光蛋白作為優秀的報告分子，在生物學的各個領域中都得到了廣泛的應用。 1962年第一次從水母中發現綠色英光蛋白GFP開始，英光蛋白的應用已經深入到生物學研 究的各個領域。英光蛋白已廣泛應用于蛋白質的標記與定位研究、蛋白質與蛋白質的相互 作用、各類細胞的遷移、W及發展用于探測細胞生理病理狀態的探針，為生物學問題的解決 提供了極大的方便。隨著新的英光蛋白不斷被發現及其突變的改進，目前已經報道的英光 蛋白的發射光譜幾乎涵蓋了整個可見光譜范圍，甚至已到達近紅外波段。如此種類繁多的 各色英光蛋白出現，同時也為實時動態的多色成像提供了重要的標記物。
[0003] 我們知道，在活體內的成像相比于細胞成像而言，具有更大的難度，對英光蛋白的 要求更高。因為組織對光的吸收和散射作用，W及背景信號的干擾，GFP起源的英光蛋白由 于其發射峰波長相對較短，在活體成像上就沒有發射峰波長更長的紅色英光蛋白有優勢。 因此，為了達到更好的活體成像的目的，需要理化性能更穩定、亮度更高的紅色英光蛋白。 隨著Ka化Shka W及其突變體Ka化shkaS158A等一批優秀的深紅色英光蛋白（發射峰大于 600nm)的發現與改造，由于其發射峰波長位于620nm W上，相比于綠色和紅色英光蛋白（例 女口，發射峰小于600nm的英光蛋白化RED)而言，在活體光學成像時具有更好的組織穿透深 度，因而備受關注。隨著光學成像技術的發展，W及活體動態研究的需要，Ka化Shka W及 KatushkaS158A等英光蛋白越來越多地用于小鼠體內動態觀察細胞與分子的運動和研究其 行為規律。
[0004] 在腫瘤免疫學的研究中，由于很多腫瘤相關抗原并不能引起機體產生足夠的免疫 響應并且達到顯著抑制腫瘤生長的效果，而且腫瘤相關抗原在一些正常組織細胞中仍然有 表達。為了更好地研究機體對于某一種已知抗原產生特異性免疫響應的過程，研究者們通 過基因工程的手段，在腫瘤細胞中引入某一種外來的具有強烈免疫原性的蛋白作為抗原， 該種蛋白被稱為模型抗原，它在研究機體對特定抗原產生免疫應答的過程及其機制中發揮 了重要的作用。由于模型抗原相對于研究個體(例如，小鼠)來說是外來蛋白，在其體內是完 全不表達的，在腫瘤免疫的研究中可通過表達該抗原的腫瘤細胞引入到小鼠體內，可W很 好地研究機體對于單一抗原產生免疫響應的過程。常見的模型抗原包括來自于雞蛋的卵清 蛋白（OVA)、淋己細胞性脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV)的糖蛋白、流感病毒核蛋白、來自于流感 A病毒的血細胞凝集素、W及來自于大腸桿菌的目-半乳糖巧酶等。模型抗原同樣需要具備 一些基本的條件；首先是穩定表達抗原的腫瘤細胞，且其生長速度沒有受到明顯的影響，而 且對于生物體的致死特性也沒有改變；再次，對生物體免疫模型抗原后，能夠刺激機體產生 針對表達同樣抗原的腫瘤細胞的特異性免疫應答，能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長。
[0005] 當應用光學成像研究模型抗原誘導的特異性免疫應答時，由于目前的模型抗原均 不具有產生英光的性質，因此模型抗原需要額外偶聯英光蛋白基因后再轉染入腫瘤細胞 內，W便達到標記腫瘤模型抗原的目的。英光蛋白尤其是Ka化shkaS158A等紅色英光蛋白 在C57BL/6小鼠中的免疫原性尚未見報道，但是不得不承認的是，英光蛋白作為外源蛋白， 其免疫原性的確是不可W忽視的，通過腫瘤細胞該種外源引入小鼠體內的英光蛋白，可能 會被小鼠的免疫系統所識別，在一定程度上激發機體產生特異性體液免疫或者細胞免疫。 雖然該種免疫響應可能較弱，但也是不可忽視的，也許會對某些研究過程中產生明顯的干 擾。因此將Ka化shkaS158A開發成一種模型抗原，由于其自身帶有英光，不需要其它額外的 蛋白進行標記，在腫瘤免疫學的活體光學成像研究中具有重要的意義。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是解決上述問題而提供了一種Ka化shkaS158A英光蛋白的新應用， 該英光蛋白KatushkaS158A不僅僅可W用于光學標記成像，而是可W替代傳統OVA等模型 抗原，用于腫瘤免疫學的光學成像研究。
[0007] 本發明所采用的技術方案是：
[0008] KatushkaS158A英光蛋白的應用，所述Ka1:ushkaSl58A英光蛋白既可W作為模型 抗原用于免疫應答的光學成像研究，又可W用于細胞的光學標記成像。
[0009] 進一步地，所述Ka化shkaS158A英光蛋白中起到模型抗原作用的蛋白質序列 為：T化QNG化I。
[0010] 進一步地，所述Ka化shkaS158A英光蛋白可W與樹突狀細胞進行賠育，從而獲得 樹突狀細胞疫苗。
[0011] 進一步地，所述Ka化shkaS158A英光蛋白可W與任何抗原膚相偶聯，作為免疫輔 助蛋白W增強抗原膚的特異性免疫應答。
[0012] 進一步地，不僅僅局限于Ka1:ushkaSl58A，還包括Ka1:ushkaSl58A的突變體。
[0013] 本發明具有W下優點：
[0014] 本發明提出了四聚體英光蛋白Ka化shkasl58A的一種新的功能，即作為模型抗原 用于免疫光學成像研究，而不再需要其它額外的模型抗原。也就是說，英光蛋白可W直接作 為模型抗原誘導特異性的免疫響應，同時也可W作為英光標記分子用于成像研究。該樣不 僅可W簡化實驗方案，更重要是它充分利用了英光蛋白的免疫原性，同時也就避免了其它 模型抗原需要偶聯英光蛋白標記時所帶來的潛在干擾。
【專利附圖】
【附圖說明】
[00巧]圖1為KatushkaS158A的作為模型抗原應用的基本技術路線圖；
[001引 圖2為Ka化shkaS158A的電泳鑒定結果圖；
[0017] 圖3為KatushkaS 158A的光譜數據圖；
[001引圖4為KatushkaS158A候選抗原膚與RMA-S細胞的親和力檢測結果圖；
[0019] 圖5為ka化shkaS158A候選抗原膚體外刺激免疫小鼠脾臟細胞增殖能力檢測結果 圖；
[0020] 圖6為KatushkaS158A抗原體外誘導免疫小鼠的脾臟細胞產生細胞因子IFN-Y 的檢測圖；
[0021] 圖7為酶聯免疫吸附測定（ELISA)檢測免疫小鼠血清中KatushkaS158A特異性抗 體的產生圖；
[0022] 圖8為流式細胞儀分析免疫小鼠和免疫小鼠脾臟細胞CD8+/CD4+比例的差異圖；
[0023] 圖9為KaUishkaS158A表達的B16腫瘤細胞株（簡稱KaUishkaS158A-B16)的光學 成像圖；
[0024] 圖10為Ka化shkaS158A-B16腫瘤細胞株的流式分析表征圖；
[00巧]圖11為Ka化shkaS158A-B16腫瘤細胞在巧7BL/6的生長的整體英光成像結果圖；
[0026] 圖12為KatushkaS158A免疫組小鼠和PBS對照組小鼠接種KaUishkaS158A-B16 腫瘤細胞后腫瘤體積生長變化圖；
[0027] 圖13為KatushkaS158A免疫組小鼠和PBS對照組小鼠接種KaUishkaS158A-B16 腫瘤細胞后第20天剝離腫瘤后拍照結果圖；
[002引圖14為KatushkaS158A免疫小鼠和PBS對照小鼠接種B16腫瘤細胞后腫瘤體積 生長變化圖；
[0029] 圖15為Ka化shkaS158A免疫組小鼠和PBS對照組小鼠皮窗中接種 KatushkaS158A-B16后的成像顯不結果圖；
[0030] 圖16為KatushkaS158A-B16腫瘤接種后第二天和第走天時KaUishkaS158A免疫 組和PBS對照組小鼠中淋己細胞的運動趨向性規律變化差異圖；
[003U 圖17為培養的DC與KatushkaS158A抗原賠育1小時后顯微鏡成像圖；
[0032] 圖18為培養的DC與Ka化shkaS158A賠育后，流式細胞儀檢測DC表面CD80/CD86 表達水平的變化圖；
[0033] 圖19為負載抗原的DC疫苗免疫處理的小鼠在皮下接種Ka化shkaS158A-B16腫瘤 細胞后腫瘤體積生長變化圖；
[0034] 圖20為負載抗原的DC疫苗免疫小鼠皮下接種Ka化shkaS158A-B16腫瘤后小鼠生 存率的統計圖。
【具體實施方式】
[00巧]下面結合附圖和實施方式對本發明做進一步詳細的說明。
[0036] 實施例1
[0037] 本實施例提出了 KatushkaS158A英光蛋白新功能，通過相應實驗證實其能夠作為 模型抗原用于腫瘤免疫學的研究。該功能的掲示首先需要找到KatushkaS158A (見序列表 1)序列中的抗原表位TSLQNG化I，命名為Kl 12 (見序列表1)，繼而證實Ka化shkaS158A蛋 白能夠誘導體液免疫(產生Ka化shkaS158A特異性抗體）和細胞免疫(誘導淋己細胞增殖和 IFN-Y的產生)，并且能夠使經過Ka化shkaS158A免疫的小鼠產生免疫保護作用從而抑制 KatushkaS158A-B16腫瘤的生長速度。
[0038] 圖1描述了本實施例的技術路線，KatushkaS158A英光蛋白通過基因工程的手 段導入B16細胞，得到KatushkaS158A-B16腫瘤細胞株，能夠在巧7BL/6小鼠中形成腫 瘤。將純化得到的Ka化ShkaS 158A蛋白免疫至正常的巧7BL/6小鼠中，使小鼠產生特 異性針對Ka化shkaS158A蛋白的免疫保護作用，通過測定免疫組小鼠和對照組小鼠接種 KatushkaS158A-B16后腫瘤的生長速度差異而表征出來。
[0039] 從圖2和圖3中可W看出為，KatushkaS 158A蛋白大小在95kD和130kD之間， 符合四聚體蛋白的大小（單體為28kD，四聚體為112kD)。而且通過光譜圖可W發現， KatushkaS158A激發峰為587nm，發射峰為624nm，屬于深紅色英光蛋白，非常利于活體光學 成像。
[0040] 通過BIMS和SYFPEITHI程序預測出KatushkaS158A的肥-抓特異性的表位膚， 綜合兩者的結合，最后篩選出了 5條候選表位膚進行后續的驗證。
[0041] 預測出的Ka1:ushkaSl58A候選表位膚
[0042]
【權利要求】
1. KatushkaS158A熒光蛋白的應用，其特征在于，所述KatushkaS158A熒光蛋白既可以 作為模型抗原用于免疫應答的光學成像研究，又可以用于細胞的光學標記成像。
2. 根據權利要求1所述的KatushkaS158A熒光蛋白的應用，其特征在于，所述 KatushkaS158A熒光蛋白中起到模型抗原作用的蛋白質序列為：TSLQNGCLI。
3. 根據權利要求1所述的KatushkaS158A熒光蛋白的應用，其特征在于，所述 KatushkaS 158A熒光蛋白可以與樹突狀細胞進行孵育，從而獲得樹突狀細胞疫苗。
4. 根據權利要求1所述的KatushkaS158A突光蛋白的應用，其特征在于，所述 KatushkaS158A熒光蛋白可以與任何抗原肽相偶聯，作為免疫輔助蛋白以增強抗原肽的特 異性免疫應答。
5. 根據權利要求1所述的KatushkaS158A熒光蛋白的應用，其特征在于，不僅僅局限于 KatushkaS158A，還包括 KatushkaS158A 的突變體。
【文檔編號】G01N33/533GK104237502SQ201310641505
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2013年12月3日
【發明者】駱清銘, 張智紅, 劉順 申請人:華中科技大學