綠色熒光蛋白gfp的熒光定量檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于綠色熒光蛋白(GFP)的熒光定量檢測方法。其主要特征在于：(1)光學檢測系統采用了半透半反鏡與光纖相結合的方法，確保了檢測靈敏度，同時降低了系統復雜度；(2)激發光源采用了LED，熒光檢測采用了光敏二極管，有效降低了系統體積與成本；(3)GFP定量采用了實時定標的方法，通過實時的定標模型來克服由標準品或檢測系統帶來的系統誤差，確保了檢測精度。所述的GFP熒光定量檢測方法，在一個高通量熒光檢測平臺上實現，其主要特征在于，通過兩維運動平臺，實現96孔檢測板中，單個孔位的定位與檢測。本發明涉及的GFP熒光檢測方法及系統具有靈敏度高、定量準確等特點，為基于GFP的標志物檢測提供了一條簡便、可靠的途徑。
【專利說明】綠色熒光蛋白GFP的熒光定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于熒光的生物標志物檢測方法，尤其涉及一種用于綠色熒光蛋白(GFP)的熒光定量檢測方法。該檢測方法通過對GFP的熒光強度進行檢測，結合實時定標模型，實現綠色熒光蛋白的定量檢測，屬于生物診斷檢測領域。
【背景技術】
[0002]基于熒光的生物標志物檢測方法具有特異性高、靈敏度高、準確度高、動態范圍寬等優點，廣泛應用于生命、醫學檢測及診斷中。傳統的熒光檢測系統中，為了獲取理想的點光源，確保足夠的激發強度，往往采用體積較大的激光作為激發光源；另一方面，為了確保檢測靈敏度，光電檢測器也往往選擇價格較為昂貴的光電倍增管。為了減小熒光檢測系統的體積，降低系統成本，“LED+光敏二極管”的組合方式正在被越來越多的光電檢測系統所采納。熒光檢測中，獨立的激發光路與接收光路往往需要依靠精巧的位置校準方法來實現激發光路、檢測點、及接收光路的三點匯聚。通過引入半透半反鏡，可以將激發光路與接收光路部分的統一起來，特別是將兩者與檢測點的接口合二為一，顯著降低了位置校準的復雜度。然而，現有的大部分熒光檢測系統(發明專利:上轉換磷光免疫層析試紙條檢測系統(申請號:200510030549.6)，一維多重檢測上轉換磷光生物傳感器(申請號:200610027354.0))，由于采用了激發光源、光電檢測器、與檢測信號點之間直接耦合的工作模式，三者之間的位置關系受到約束，降低了系統的靈活度。另外，該類檢測系統的光學模塊往往包括多個透鏡模組，結構復雜，容易引起檢測性能的不穩定。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是針對上述【背景技術】中的不足，提供一種基于光纖技術的GFP熒光檢測方法。與現有方法不同，通過引入光纖技術，來實現激發光路、接收光路、及公共檢測接口的相互耦合。一方面，允許檢測點到光敏二極管及其所在的信號處理電路板之間存在一定的距離，增強了系統實現的靈活度；另一方面，節省了若干聚焦透鏡，進一步降低了檢測系統的復雜度。
[0004]本發明是通過以下技術方案實現的。本發明涉及的光纖檢測模塊主要包括:聚焦透鏡、半透半反鏡、激發光路光纖、接收光路光纖、LED、光敏二極管、濾光片組，以及固定套筒等。其中聚焦透鏡為激發光路與接收光路所共用，為光纖檢測模塊與熒光檢測點之間的公共接口。半透半反鏡對不同波長的光起到分光的作用，具體來講，在本發明中，通過選擇合適的半透半反鏡，使得LED發出的激發光能夠經其反射，入射到熒光檢測點上；同時，檢測點激發出來的熒光則能夠經過半透半反鏡透射到光敏二極管。半透半反鏡通過激發光纖與LED實現激發光路的耦合。半透半反鏡通過接收光纖與光敏二極管實現接收光路的耦合。在激發光纖與接收光纖的端面上分別嵌入了相應規格的濾光片，以確保實際激發光的波長在允許范圍之內；同時，濾除進入接收光纖的，非特定熒光波長的干擾光，降低背景噪聲，提高檢測準確度。[0005]本發明實現的技術方案中，還包括了一種高通量檢測方法來實現GFP的實時定標檢測。該高通量檢測系統由“X-Y”兩維運動平臺所驅動，由嵌入式系統控制。在操作界面的指引下，借助該高通量掃描運動平臺，可以實現對包括標準品、及待測樣品在內的多個樣品的批量化檢測。同時，利用多個標準品檢測結果建立的實時定標模型，來推算待測樣品的濃度定量信息。這種依靠高通量檢測平臺實現的實時定標檢測方法，有利于克服由于標準品狀態的不穩定性、待測樣品狀態的不穩定性、檢測試劑狀態的不穩定性、以及系統各個硬件模塊的不穩定性所帶來的各類系統偏差，確保檢測結果的準確性。
[0006]本發明具有實質性特點和顯著進步，本發明主要采用了四項技術措施:1)通過引入半透半反鏡，實現了針對單一檢測點，激發光路與接收光路的物理接口統一。2)通過引入光纖技術，實現了檢測點與激發光源和光敏二極管之間的柔性耦合，提高了系統實現的靈活度。3)通過引入實時定標的檢測技術，有效克服了各類影響因素可能導致的系統偏差。
4)通過引入兩維運動平臺，在嵌入式系統控制下，實現各個孔位的單點檢測，提高了檢測系統的工作效率，改善了檢測過程的操作方便性。本發明采用了上述技術措施使得提出的GFP熒光檢測方法，具有結構簡單、靈活度高、準確度高、操作簡便的優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]圖1光纖檢測模塊的結構示意圖
[0008]圖2高通量檢測平臺的結構示意圖
【具體實施方式】
[0009]如圖1所示，本發明涉及的光纖檢測模塊主要包括:聚焦透鏡1、半透半反鏡2、激發光路光纖3、接收光路光纖4、LED5、光敏二極管6、激發濾光片7、接收濾光片8，以及固定套筒9等組件。其中，LED5在恒流源的驅動下，發出強度穩定、特定波長的激發光，通過LED5與激發光路光纖3的直接耦合，大部分的激發光進入了光纖3，經過光纖3另外一個端面的激發濾光片7，濾除其它波長的雜散光，隨后經過半透半反鏡2反射到聚焦透鏡1，最終經聚焦透鏡I出射的激發光在預定的焦距位置處，形成了一個一定大小的激發光斑。在激發光斑的激勵下，待測GFP樣品受激發出的熒光，首先通過聚焦透鏡I匯聚到半透半反鏡2，再通過半透半反鏡2透射到接收濾光片8，隨后進入接收光路光纖4，直至最終到達光電傳感器光敏二極管6。光敏二極管6上面的PN結，將光信號轉換為光電流，隨后經過1-V放大電路的處理，得到微弱的電壓信號，為了提高檢測靈敏度，可以將原始的電壓信號進一步放大到A/D轉換器允許的量程范圍，最終完成信號的測量。光纖檢測模塊中聚焦透鏡1、半透半反鏡2，以及光纖3和4的工作端面均封閉在固定套筒9中。
[0010]如圖2所示，本發明涉及的高通量檢測平臺主要包括:X方向運動導軌1、Y方向運動導軌2、X方向驅動電機3、Y方向驅動電機4、X方向運動皮帶5、Y方向運動皮帶6、檢測板載物檢測臺7、光電檢測頭8、X方向定位光柵9、Y方向定位光柵10,以及嵌入式測控系統11等。將檢測板(如標準的96孔板)放置在載物檢測臺上面，嵌入式測控系統9控制X方向驅動電機3,通過X方向運動皮帶5,帶動上層運動平臺沿著X方向運動導軌I運動到指定位置(運動位置通過X方向定位光柵9來確定)，然后，嵌入式測控系統9控制Y方向驅動電機4,通過Y方向運動皮帶6,帶動檢測板載物檢測臺7沿著Y方向運動導軌2運動到指導位置(運動位置通過Y方向定位光柵10來確定)。嵌入式測控系統通過光纖檢測模塊的光電檢測頭8，對單個檢測孔實施信號采集，然后，再采用類似的方法，讓下一個檢測孔位運動到光電檢測頭8的下方，再對其實施光電信號采集，直至本次檢測中的所有孔位檢測完畢。根據所有檢測孔位的檢測結果，建立實時的標準品檢測模型，再依據該模型來推算待測樣品的濃度。
【權利要求】
1.一種基于光纖技術的GFP熒光檢測方法，具體的熒光檢測光纖模塊包括:聚焦透鏡(I)、半透半反鏡(2)、激發光路光纖(3)、接收光路光纖(4)、LED (5)、光敏二極管(6)、激發濾光片(7)、接收濾光片(8)，以及固定套筒(9)等組件。其中，LED(5)在恒流源的驅動下，發出強度穩定、特定波長的激發光，通過LED(5)與激發光路光纖(3)的直接耦合，大部分的激發光進入了光纖(3)，經過光纖(3)另外一個端面的激發濾光片(7)，濾除其它波長的雜散光，隨后經過半透半反鏡(2)反射到聚焦透鏡(I)，最終經聚焦透鏡(I)出射的激發光在預定的焦距位置處，形成了一個一定大小的激發光斑。在激發光斑的激勵下，待測GFP樣品受激發出的熒光，首先通過聚焦透鏡(I)匯聚到半透半反鏡(2)，再通過半透半反鏡(2)透射到接收濾光片(8)，隨后進入接收光路光纖(4)，直至最終到達光電傳感器光敏二極管(6)。光敏二極管(6)上面的PN結，將光信號轉換為光電流，隨后經過1-V放大電路的處理，得到微弱的電壓信號，為了提高檢測靈敏度，可以將原始的電壓信號進一步放大到A/D轉換器允許的量程范圍，最終完成信號的測量。
2.根據權利要求1所述的GFP熒光檢測方法，其特征是，激發光源LED(5)及光敏二極管(6)到檢測點的光路分別是通過激發光路光纖(3)與接收光路光纖(4)耦合得到的。
3.根據權利要求1所述的GFP熒光檢測方法，其特征是，激發光路光纖(3)與接收光路光纖(4)通過一個半透半反鏡(2)相互耦合，得到了一個面向檢測點的公共光電檢測接口。
4.根據權利要求1所述的GFP熒光檢測方法，其特征是，在激發光路光纖(3)與接收光路光纖(4)的端面上分 別嵌入了一個激發光濾光片(7)與一個接收光濾光片(8)。
5.根據權利要求1所述的GFP熒光檢測方法，其特征是，激發光路光纖(3)與接收光路光纖(4)的工作端面分別直接與LED (5)與光敏二極管(6)相互耦合。
6.根據權利要求1所述的GFP熒光檢測方法，其特征是，其檢測過程采用了實時定標的方法，即讓待測樣品與標準品同時檢測，通過實時建立的標準品校準模型來推算待測樣品的濃度。
7.根據權利要求1所述的GFP熒光檢測方法，其特征是，包括待測樣品、標準品等在內的多個樣品檢測過程，是通過一個高通量兩維檢測平臺來實現的。
【文檔編號】G01N21/64GK103616359SQ201310638365
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月4日 優先權日:2013年12月4日
【發明者】鄒明強, 張孝芳, 李莉, 劉彩虹, 齊小花, 劉峰 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院