包被免疫球蛋白（IgG）酶標條的保存處理方法
【專利摘要】一種包被免疫球蛋白（IgG）酶標條的保存處理方法，其步驟如下：處理液制備：取0.01moL/LpH7.2磷酸鹽緩沖溶液1L，加熱至沸騰并保持3分鐘；然后冷卻至室溫；然后依次加入牛血清蛋白10～40g、卵清蛋白（OVA）10～40g，攪拌混合均勻；再加入疊氮鈉0.010～0.040g、硫柳汞鈉鹽0.1～0.60g，攪拌混合均勻，即制得處理液處理包被有免疫球蛋白IgG的酶標條。經處理液處理的酶標條，其制備成本低，且保存期限長。
【專利說明】包被免疫球蛋白(IgG)酶標條的保存處理方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農藥免疫檢測技術，尤其是應用于食品檢測領域中，對于農藥殘留成分檢測。在通過酶聯免疫檢測農藥殘留時，酶聯免疫檢測時的包被免疫球蛋白(IgG)酶標條需要保持活性。本發明具體涉及的是包被免疫球蛋白酶標條的保存處理方法。
【背景技術】
[0002]ELISA檢測技術是近幾十年發展起來的新技術，其核心是抗原抗體結合反應。在直接競爭法酶聯免疫吸附測定(ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay)過程中，需要將特異性抗體(IgG, Immunoglobulin,免疫球蛋白)包被在酶標條上,然后進行相關的實驗。由于免疫球蛋白屬于活性蛋白，包被在酶標條上后如果不進行適當的技術處理，很快就會因為細菌等污染而變質，失去活性，導致酶標條失效。目前，生產包被免疫球蛋白的酶聯免疫試劑盒的公司在試劑盒組分上大都申請專利公開技術進行保護，但是對于酶標條的保存處理技術，作為核心技術，在文獻中都沒有公開。
[0003] 申請人:作為出入境檢驗單位，需要經常對各種食品的農藥殘留進行檢測。目前采用農藥免疫檢測技術進行檢測。首先要將農藥分子與載體蛋白質連接起來，人工合成農藥-載體蛋白質結合物免疫原，然后以此免疫動物制備特異性抗血清。在直接競爭ELISA法的實驗中，要將特異性抗血清的IgG分離出來并人工合成酶標半抗原，進而建立免疫學檢測方法。農藥免疫學檢測方法與傳統的農藥分析方法相比，具有不需要復雜昂貴的儀器設備，操作簡便，樣品前處理簡單，檢測快速，檢測容量大，成本低廉等特點，因此具有潛在的廣泛的應用價值。目前農藥免疫檢測技術中酶聯免疫吸附檢測技術已經被廣泛應用于食品中農藥殘留檢測。由于經常需要應用到包被免疫球蛋白的酶標條，由于外購成本高昂，因此需要自制，但是自制的酶標條如果當下不使用，則無法保存，因此在每次檢驗測試前都需制備酶標條，造成檢測時間比較長。因此如何保持自制的酶標條的長期內保持活性，成了難題。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種包被免疫球蛋白IgG的酶標條的保存處理方法，該保存處理方法簡單，能夠保證自制的酶標條活性達4個月之久。
[0005]為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案是一種包被免疫球蛋白(IgG)酶標條的保存處理方法，其步驟如下:1)處理液制備:取0.01moL/L pH7.2磷酸鹽緩沖溶液1L，加熱至沸騰并保持3分鐘；然后冷卻至室溫；然后依次加入牛血清蛋白10?40g、卵清蛋白(OVA)IO?40g，攪拌混合均勻;再加入疊氮鈉0.010?0.040g、硫柳汞鈉鹽0.1?0.60g，攪拌混合均勻，即制得處理液備用；
2)利用步驟2)制備的所述處理液處理包被有特異性抗體免疫球蛋白IgG的酶標條，在所述酶標條每孔中加入所述處理液400 μ L，于37°C條件下水浴Ih ;將所述酶標條甩干，拍干殘余的水分；裝進鋁箔袋充入氮氣在4°C保存。[0006]所述酶標條制備方法為，首先將免疫球蛋白IgG50ul用PH9.1碳酸鹽緩沖液按照1:100稀釋比進行稀釋獲得免疫球蛋白IgG稀釋使用液；在酶標條每孔中加入IOOul包被緩沖液，然后用免疫球蛋白IgG稀釋使用液從酶標條第I孔開始橫向倍比稀釋，5°C包被過夜，次日倒掉包被緩沖液，每孔加250ul磷酸鹽緩沖溶液0.01moL/L pH7.2洗滌三次，每次間隔三分鐘，制得所述酶標條。碳酸鹽緩沖液配制:0.10.lmol/L的碳酸鈉1.1mL,加入8.9mL0.lmol/L碳酸鈉中，混合后加水定容至100mL。
[0007]本發明的包被有免疫球蛋白IgG的酶標條通過處理液處理進行保存，通過實驗測試可知，處理過的酶標條在2?8°C條件下至少可以保存4個月之久。本發明的處理液處理的酶標條，通常用于進行食品中農藥殘留檢測。
[0008]對于經本發明的處理液處理過的包被免疫球蛋白IgG的酶標條的活性檢測應用的ELISA直接競爭法。其檢測原理，以農藥甲霜靈的檢測為例。首先制備甲霜靈免疫原，然后進行動物免疫制備特異性抗體免疫球蛋白IgG，然后進行在在酶標條上包被免疫球蛋白IgG，在包被的酶標條中加入待測標本和酶標記的半抗原中進行競爭反應結合，加入酶底物顯色液、終止液，利用酶標儀讀取吸光光度值，根據標準曲線進行定量。進行處理過的酶標條活性測試時，將待測標本替換為濃度已知的甲霜靈抗原標本，與測試結果的濃度對比可知酶標條的活性保持程度。
【具體實施方式】
[0013]現結合實例對本發明的包被免疫球蛋白IgG的酶標條保存處理方法進行具體說明。本發明涉及的試劑均為分析純。
[0014]特異性抗體免疫球蛋白IgG制備為本領域公知技術。通過免疫原(完全抗原)對動物進行免疫得到特異性抗血清，通過血清分離提純獲得特異性抗體免疫球蛋白IgG，并在-20°C下保存用于后續試驗試用。在本實施例中以農藥甲霜靈為例。甲霜靈由于是小分子，其需要和載體蛋白結合成為免疫原，載體蛋白一般選擇牛血清蛋白或卵清蛋白。利用制備的免疫原對家兔免疫，免疫四次，持續時間約4個月，獲得特異性血清，對特異性血清分離，獲得甲霜靈多克隆抗體，即特異性抗體免疫球蛋白IgG，于-20°C下保存。
[0015]由于本發明對包被有免疫球蛋白IgG的酶標條保存處理方法，因此，首先需要制備免疫球蛋白IgG酶標條的包被，在本實施例中酶標條。
[0016]首先取-20°C保存的免疫球蛋白IgG50yL，加入PH9.1碳酸鹽緩沖液450yL，稀釋成1: 10的儲備液，然后再用碳酸鹽緩沖液稀釋至1: 100的使用液。在酶標條每孔中加入100 μ L碳酸鹽緩沖液，然后用1: 100免疫球蛋白IgG的使用液在酶標條上從第I孔開始橫向倍比稀釋，共8個稀釋度，每孔100 μ L，5°C包被過夜。次日用0.01moL/L pH7.2的PBS溶液，即磷酸鹽緩沖液進行清洗，清洗3次，每次每孔加250 μ L，每次間隔3分鐘，清洗完畢后等待進一步技術處理。碳酸鹽緩沖液配制:0.10.lmol/L的碳酸鈉1.1mL,加入8.9mL0.lmol/L碳酸鈉中，混合后加水定容至100mL。
[0017]制備處理液:取0.01moL/L pH7.2的PBS溶液1L，在電加熱板上加熱至沸騰，并保持3分鐘。蓋上無菌的表面皿冷卻至室溫。依次加入牛血清蛋白(BSA) 10?40g、卵清蛋白(OVA) 10?40g，蓋上無菌的表面皿，然后在磁力攪拌器上攪拌10分鐘。然后再加入疊氮鈉0.010 ~ 0.040g、硫柳汞鈉0.1?0.60g,攪拌10分鐘，備用。[0018]向上述包被有免疫球蛋白IgG的酶標條每孔中加入制備的處理液400 μ L，于37°C烘箱中水浴lh。將酶標條甩干，并將其在預先滅菌過的卷紙上拍干殘余的水分。裝進鋁箔袋充入一定量的氮氣4°C保存。
[0019]處理液制備中，維持無菌的環境很重要，首要對磷酸鹽緩沖液進行滅菌，在處理液中加入牛血清蛋白及卵清蛋白，可以封閉酶標條上包被的免疫球蛋白IgG的自由基，同時利用疊氮鈉和硫柳汞鈉鹽作為防腐劑進行進一步處理。
[0020]經處理液處理的包被有免疫球蛋白IgG酶標條的活性檢測實例
為了保持實驗的準確性，采用的酶標半抗原為_20°C甘油保存確保它的原始活性，而且有關酶標條的綜合實驗都采用直接競爭ELISA法，標記酶為辣根過氧化物酶，底物溶液為商用的TMB商用的TMB (3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺)，終止液為2moL/L硫酸，測定其活性變化。
[0021]經處理液處理的免疫球蛋白IgG包被的酶標條在37°C時的保存期限
免疫球蛋白IgG包被過的酶標條必須經過處理液適當的處理,才能在2-8°C條件下放置4個月左右。不經過處理的酶標條在37°C的環境中不超過24小時就會喪失全部的活性。大量的實驗表明，處理后的酶標條在37°C的環境中72小時后，仍然能保持良好的活性。實驗結果見表一。表一為經處理液處理的包被免疫球蛋白IgG的酶標條在37°C條件下保存期限測試的吸光光度值。檢測標準品為8瓶甲霜靈系列濃度標準溶液，標準溶液甲霜靈濃度為 25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、l.5625ng/ml、0.7812ng/ml、0.3906ng/ml、Ong/mlo
[0022]表一
【權利要求】
1.一種包被免疫球蛋白(IgG)酶標條的保存處理方法，其步驟如下:1)處理液制備:取0.0lmoL/L pH7.2磷酸鹽緩沖溶液I L，加熱至沸騰并保持3分鐘；然后冷卻至室溫；然后依次加入牛血清蛋白10?40g、卵清蛋白(OVA) 10?40g，攪拌混合均勻；再加入疊氮鈉0.010?0.040 g、硫柳汞鈉鹽0.1?0.60 g，攪拌混合均勻，即制得處理液備用； 2)利用步驟2)制備的所述處理液處理包被有特異性抗體免疫球蛋白IgG的酶標條，在所述酶標條每孔中加入所述處理液400 μ L，于37°C條件下水浴I h ;將所述酶標條甩干，拍干殘余的水分；裝進鋁箔袋充入氮氣在4°C保存。
2.根據權利要求1所述的包被免疫球蛋白(IgG)酶標條的保存處理方法，其特征在于所述酶標條制備方法為，首先將免疫球蛋白IgG50ul用PH9.1碳酸鹽緩沖液按照1:100稀釋比進行稀釋獲得免疫球蛋白IgG稀釋使用液；在酶標條每孔中加入IOOul包被緩沖液，然后用免疫球蛋白IgG稀釋使用液從酶標條第I孔開始橫向倍比稀釋，5°C包被過夜，次日倒掉包被緩沖液，每孔加250ul磷酸鹽緩沖溶液0.01moL/L pH7.2洗滌三次，每次間隔三分鐘，制得所述酶標條。
【文檔編號】G01N33/68GK103698532SQ201310631105
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月2日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】周洪斌 申請人:鎮江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心