基于微電極芯片的有機磷檢測方法
【專利摘要】本發明涉及電化學檢測領域，公開了一種基于微電極芯片的有機磷檢測方法。本發明中，在微電極芯片的工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，在微電極芯片表面滴加有機磷待測樣品液，分別測定滴加有機磷待測樣品液之前和之后的伏安曲線，得到基準伏安曲線和測量伏安曲線，根據測量伏安曲線相對于基準伏安曲線的峰值電流是否有下降，確定有機磷待測樣品液中是否含有有機磷，并根據峰值電流的下降量，確定有機磷的濃度。由于本發明的有機磷檢測方法使用微電極芯片，使得有機磷檢測儀器能實現小型化、微型化，而且由于能測定電流的變化量，因此能定量檢測有機磷。
【專利說明】基于微電極芯片的有機磷檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及電化學檢測領域，特別涉及基于微電極芯片的有機磷檢測方法。
【背景技術】
[0002]電化學檢測方法是利用電極將不同物質發生的生化反應產生的信號轉換成電信號，從而確定物質間進行反應的微觀過程、物質含量等。常用的電化學測試方法有:電流分析法(也稱為計時安培法)、差分脈沖安培法(DPA)、差分脈沖伏安法(DPV)、循環伏安法(CV)、線性掃描伏安法(LSV)、常規脈沖伏安法(NPV)、方波伏安法(SWV)等。自電化學的檢測方法發明以來，經過不斷地發展，對電極與溶液界面的特性研究已經具有了非常好的理論基礎，電化學檢測可以應用于無機離子、有機離子、蛋白質、氨基酸、DNA等分析物，這也是此方法可以廣泛用于生物傳感器的原因。
[0003]生物傳感器是在化學傳感器的基礎上發展起來的，它是由產生信號的敏感元件(分子識別元件)和信號轉換器件組成。生物傳感器的發展始于1962年，當時L.c.dark將電極與含有葡萄糖氧化酶的膜結合應用于葡萄糖檢測。隨后其應用領域不斷擴展，檢測方法也不斷改進。根據檢測物質的不同，可分為免疫傳感器、DNA傳感器、酶傳感器、細胞傳感器等幾類。
[0004]最近二三十年里，微電子機械系統(MicroElectromechanical System, MEMS)加工技術的發展使生物傳感器及其生化分析儀器進一步向小型化、數字化和高可靠性的方向發展。隨著生物技術的日臻完善、微電子學技術的迅速發展以及實際應用領域的迫切要求，作為一種多學科交叉的高技術、一種強有力的分析工具，生物傳感器已成功地應用于醫學、國防、環境、食品工業及農業等領域。
[0005]MEMS技術對電化學生物傳感器的最主要影響是電極的改進，電極的尺寸有原來的常規電極發展到了微電極。傳統分別使用的三電極系統電極(參比電極、輔助電極、工作電極)可以集成于一個芯片上；一個傳感器器件上就可以集成多個具有獨立檢測功能的電極，從而實現了一個器件可以同時檢測多種生物樣品。微電極不僅僅具有小型化的優點，更重要的是它與常規電極相比具有無可比擬的優點，即極高的穩態電流密度、極短的響應時間、極化電流小、傳質速率高、信噪比大等特點。
[0006]另一方面，有機磷農藥主要用作農業殺蟲劑，少數品種用作殺菌劑、除草劑和脫葉齊U。本類農藥殺蟲效果好，殘效期較短，但對溫血動物具有一定毒性，毒性與化學結構有關。多數屬于中等毒和低毒，少數屬于高毒類。有機磷農藥在工農業生產中廣泛應用，但農藥的長期大量使用所帶來的農藥殘留問題卻成為影響人類健康與環境安全的重大隱患。對有機磷農藥殘留的常規檢測方法包含:高效液相色譜、氣相色譜法、質譜法、酶聯免疫法等，這些檢測方法雖然檢測精度高，但需要借助繁雜的前處理過程、技術復雜、成本高、檢測周期長，不適合于現場實時、快速檢測，而且藥劑有毒；也有采用試紙條通過酶反應和顯色劑實現檢測的方法，這種方法雖然快速方便，但檢測效果不好，只能大約定量，而且只能確定含有有機磷，無法確定具體是哪一種有機磷。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種基于微電極芯片的有機磷檢測方法，使得有機磷檢測儀器能實現小型化、微型化，而且能定量檢測有機磷。
[0008]為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種基于微電極芯片的有機磷檢測方法，包含以下步驟:
[0009]S1.提供一微電極芯片；其中，所述微電極芯片包含襯底以及制作在所述襯底上的至少一組微電極；所述微電極包含工作電極；
[0010]S2.將鄰苯二胺與有機磷抗體混合之后，滴到所述微電極芯片表面，在工作電極上選擇性加電，在所述加電的工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征，得到基準伏安曲線；
[0011]S3.將有機磷待測樣品液滴到所述微電極芯片表面，反應預設時間之后，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征，得到所述有機磷待測樣品液對應的測量伏安曲線.[0012]S4.將所述測量伏安曲線與所述基準伏安曲線進行比較，根據峰值電流是否有下降，確定所述有機磷待測樣品液中是否含有有機磷；根據峰值電流的下降量，確定有機磷的濃度。
[0013]本發明的實施方式還提供了一種微電極芯片，包含:襯底、制作在所述襯底上的至少一組微電極、電極引線和引線焊盤；所述微電極通過所述電極引線連接至所述引線焊盤；
[0014]所述微電極包含:工作電極、對電極和參比電極；一組微電極中的工作電極和對電極的相對位置固定。
[0015]本發明實施方式相對于現有技術而言，在微電極芯片的工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，在微電極芯片表面滴加有機磷待測樣品液，分別測定滴加有機磷待測樣品液之前和之后的伏安曲線，得到基準伏安曲線和測量伏安曲線，根據測量伏安曲線相對于基準伏安曲線的峰值電流是否有下降，確定有機磷待測樣品液中是否含有有機磷，并根據峰值電流的下降量，確定有機磷的濃度。由于本發明的有機磷檢測方法使用微電極芯片，使得有機磷檢測儀器能實現小型化、微型化，而且由于能測定電流的變化量，因此能定量檢測有機磷。
[0016]另外，在所述步驟S1之后，所述步驟S2之前，還包含以下步驟:
[0017]采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對所述微電極芯片的工作電極進行表征，得到第一伏安曲線；
[0018]在所述步驟S2中，還包含以下子步驟:
[0019]在工作電極表面形成有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，采用循環伏安法對所述微電極芯片的工作電極進行表征，得到第二伏安曲線；
[0020]在得到第二伏安曲線之后，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對所述微電極芯片的工作電極進行表征，得到基準伏安曲線。
[0021]在工作電極表面形成有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之前，測定第一伏安曲線，通過比較基準伏安曲線與第一伏安曲線，可以確保有機磷抗體結合到工作電極表面，從而保證后續對有機磷待測樣品液的檢測的準確性。
[0022]另外，在所述步驟S2中，還包含以下子步驟:
[0023]在采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征之前，在所述微電極芯片表面滴加牛血清蛋白，反應預設時間之后，用磷酸鹽緩沖液清洗所述微電極芯片表面。
[0024]通過使用牛血清蛋白(BSA)預處理會發生非特異性吸附的反應物質，使這些物質在使用前即與BSA充分反應結合，達到消除非特異性吸附的目的，使后續對有機磷待測樣品液的檢測中，發生的都是有機磷抗原與有機磷抗體之間的特異性吸附，從而保證檢測結果的準確性。
[0025]另外，在所述步驟SI中提供的微電極芯片包含至少兩組微電極；
[0026]在所述步驟S2中，還包含以下子步驟:
[0027]在不同的工作電極上聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法分別對工作電極進行表征，得到各工作電極的基準伏安曲線；
[0028]在所述步驟S3中，還包含以下子步驟:
[0029]將至少兩份有機磷待測樣品液分別滴到所述微電極芯片表面，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法分別對工作電極進行表征，得到各有機磷待測樣品液對應的測量伏安曲線。
[0030]通過在多個工作電極上結合不同的有機磷待測樣品液，然后同時采用二茂鐵甲醇以循環伏安法分別對工作電極進行表征，可以提高檢測效率，實現快速檢測。
[0031]另外，在以下情形中，用磷酸鹽緩沖液清洗所述微電極芯片表面:
[0032]在得到第一伏安曲線之后，在工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之前；
[0033]在工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，得到基準伏安曲線之IIJ ；
[0034]在待所述有機磷待測樣品液反應預設時間之后，得到測量伏安曲線之前。
[0035]在微電極芯片表面進行每一步操作之后，都用磷酸鹽緩沖液清洗微電極芯片表面，可以消除前一步操作對后一步操作的影響，從而進一步保證有機磷檢測結果的準確性。
[0036]另外，所述工作電極和對電極為叉指電極、螺旋電極或微帶電極中的任意一種。工作電極和對電極的特殊形狀主要為使電流密度在各工作電極間分配更加均勻，以減小各工作電極因分布位置不同引起的差異。
[0037]另外，所述工作電極和所述對電極均為金電極。工作電極和對電極為同一材料Au可以同時完成制作，而不需要增加額外的工藝步驟，這使得以較為極簡單的工藝步驟實現三電極體系的集成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1是根據本發明第一實施方式的基于微電極芯片的有機磷檢測方法的流程圖；
[0039]圖2是微電極芯片上三個電極的分布示意圖；
[0040]圖3A是循環伏安法電位與時間的關系示意圖；
[0041]圖3B是循環伏安法電流與電位的關系示意圖；
[0042]圖4是微電極芯片的工作原理示意圖；
[0043]圖5是CV曲線的峰值電流計算不意圖。【具體實施方式】
[0044]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領域的普通技術人員可以理解，在本發明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術細節。但是，即使沒有這些技術細節和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現本申請各權利要求所要求保護的技術方案。
[0045]本發明的第一實施方式涉及一種基于微電極芯片的有機磷檢測方法，具體流程如圖1所示，包含以下步驟:
[0046]步驟101，提供一微電極芯片；其中，微電極芯片包含襯底以及制作在襯底上的至少一組微電極，微電極包含工作電極。
[0047]比如說，采用MEMS或激光加工技術，在玻璃或高分子材料上制作含有微通道的基片，通過物理或化學組裝的方法，在通道的敏感區域制作貴金屬薄膜微電極陣列，再通過電化學或化學方法修飾電極表面。再將含有微通道的基片與被打孔的PDMS蓋片封合成微流控電極陣列芯片。具體地說，微電極芯片的結構如圖2所示，包括:微電極、電極引線及引線焊盤等。微電極芯片通常采用三電極系統，即微電極包含:工作電極(Work Electrode，簡稱 “WE”)，對電極(Counter Electrode,簡稱 “CE”)和參比電極(Reference Electrode,簡稱“ RE ”)，如圖2所示，圖中，1為WE，2為CE，3為RE，構成一組微電極，WE通過電極引線4-1連接至引線焊盤5-1，CE通過電極引線4-2連接至引線焊盤5-2，RE通過電極引線4_3連接至引線焊盤5-3。芯片封裝時，將微電極芯片上的引線焊盤與PCB電路板上相應的焊盤用金線或鋁線連接，然后在PCB電路板上加一鏤空蓋板，只露出微電極部分(即圖中中間圓圈內的部分)，形成測試樣品槽，完成微電極芯片的封裝，此種設計也可以保護焊線及焊點，防止焊線和焊點在測量實驗中因多次液體沖洗而斷裂脫落。將封裝好的微電極芯片與電化學平臺連接，即可進行后續的電化學測量實驗。
[0048]在三電極系統中，工作電極為金(Au)，對電極為鉬(Pt)，參比電極為銀/氯化銀(Ag/AgCl)。雖然Pt因其優異的電化學惰性是三電極體系中對電極最為常用的材料，經實驗發現，在低的掃描電位情況下，Au完全可以替代Pt作對電極，也就是說，工作電極為金電極，對電極可以為鉬電極或者金電極。當工作電極和對電極均為金電極時，工作電極和對電極為同一材料Au而可以同時完成，而不需要增加額外的工藝步驟，這使得以較為簡單的工藝步驟便可實現三電極體系的集成。這樣以增加少量成本的代價使后續實驗操作大為簡化，并且使三電極體系的相對位置固定，從而消除了免疫測試過程中參比和對電極移動引起的測量誤差，大大提高了芯片批內和批間的一致性。比如說，如圖2所示，整個微電極芯片中所有工作電極和對電極共用參比電極3，圖中圓形表示工作電極，其相對應的對電極用環繞在工作電極之外的環形表示，中間3X5排列的15個工作電極對應的對電極為6，工作電極與對應的對電極成對使用，組與組之間不可互換使用。
[0049]所有電極均制作在Si02/Si襯底上，Si02厚約500納米，這樣可以使各電極間有良好的電絕緣。WE、RE和CE間最近的距離均為200微米。工作電極和對電極可以為叉指電極、螺旋電極或微帶電極中的任意一種，RE、CE的特殊形狀主要是為了使電流密度在各工作電極間分配更加均勻，以減小各工作電極因分布位置不同引起的差異。工作電極的形狀和大小亦非隨意選取，電極設計成圓形可以避免邊緣局部電流密度過大，電極大小也很重要，太小會因電極邊緣漏電流過大影響測量精度，太大則可能加大聚合膜厚度在工作電極上的不均勻的可能性，從而影響免疫芯片的一致性，不利于實用化。
[0050]步驟102，將鄰苯二胺與有機磷抗體混合之后，滴到微電極芯片表面，在工作電極上選擇性加電，在加電的工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜，米用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征，得到基準伏安曲線。
[0051]循環伏安法是指在電極上施加一個線性掃描電壓，以恒定的變化速度掃描，當達到某設定的終止電位時，再反向回歸至某一設定的起始電位，循環伏安法電位與時間的關系如圖3A所示(橫坐標是時間,縱坐標是電位)，電流相應曲線則如圖3B所示(橫坐標是電位，縱坐標是電流)。
[0052]在實際實驗中，可以采用如下條件進行有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜的聚合:采用循環伏安法(CV)共聚鄰苯二胺(0PD)與有機磷抗體，在電極表面形成部分絕緣膜，在避光除氧條件下進行，電位范圍:0-0.8伏(V);掃描速度:100毫伏/秒(mV/s);聚合圈數:2圈；0PD濃度:5毫摩爾/升(mM/L);抗體濃度:稀釋1000倍；支持電解質:pH7.010mM/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。
[0053]此外，值得說明的是，在實際檢測中，在步驟101之后，步驟102之前，采用二茂鐵甲醇(FeM)以循環伏安法對微電極芯片的工作電極進行表征，得到第一伏安曲線；也就是說，對裸電極進行表征，為后續驗證在工作電極表面是否形成有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜提供基礎。采用FeM以循環伏安法對裸電極進行表征的操作條件為:FeM水溶液濃度:ImM/L ;支持電解質:pH7.010mM/L磷酸鹽緩沖液；電位范圍:-0.3-+0.5V。在工作電極表面形成有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之前，測定第一伏安曲線，通過比較基準伏安曲線與第一伏安曲線，可以確保有機磷抗體結合到工作電極表面，從而保證后續對有機磷待測樣品液檢測的準確性。具體地說，在工作電極表面形成有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，采用循環伏安法對微電極芯片的工作電極進行表征，得到第二伏安曲線；在得到第二伏安曲線之后，再采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對微電極芯片的工作電極進行表征，得到基準伏安曲線。通過測定第二伏安曲線可以檢驗在工作電極表面是否確實形成了有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜，有利于確保后續試驗的準確性。
[0054]此外，影響微電極芯片對實際樣品檢測精度的重要因素是非特異性吸附。樣品中有大量的蛋白質和膠原，它們與抗體的結合能力較弱，會與抗原發生競爭反應，盡管處于劣勢地位，但它們一樣會阻礙FeM與工作電極發生電荷交換，使有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜的阻抗上升，其結果會導致實測值比真實值偏大。在精度要求不高的情況下，非特異性吸附效應可以忽略，但要進一步提高微電極芯片在臨床使用中的價值，這種效應必須克服。在實際使用中，在得到基準伏安曲線之前，可以在微電極芯片表面滴加牛血清蛋白(BSA)，反應預設時間之后，用磷酸鹽緩沖液清洗微電極芯片表面。比如說，加1納克/毫升(ng/mL)BSA孵化30分鐘以消除非特異性吸附，可以覆蓋掉大部分的非特異性吸附的位點，這樣在后續的試驗中，發生的吸附都是所需要的特異性吸附，可以對所觀測的反應進行定量。非特異性吸附主要是因為一些非共價鍵的作用力導致的，比如說疏水作用力、范德華力、靜電作用力等等。通過使用牛血清蛋白(BSA)預處理會發生非特異性吸附的反應物質，使這些物質在使用前即與BSA充分反應結合，達到消除非特異性吸附的目的，使后續對有機磷待測樣品液的檢測中，發生的都是有機磷抗原與有機磷抗體之間的特異性吸附，從而保證檢測結果的準確性。
[0055]步驟103，將有機磷待測樣品液滴到微電極芯片表面，反應預設時間之后，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征，得到有機磷待測樣品液對應的測量伏安曲線。
[0056]值得一提的是，在本步驟中，原位加入一定體積的有機磷待測樣品，孵化30分鐘后，采用CV進行表征。所謂原位是指保持實驗裝置固定不動，這對沒有集成CE和RE的芯片非常重要，因為把CE、RE移出FeM溶液會引起三電極的相對位置發生變化，且易導致濃度發生改變從而引起較大的誤差。由于本實施方式采用集成了三個電極的微電極芯片，因此原位指的是不需要將芯片移動至恒溫箱中孵化。
[0057]步驟104，將測量伏安曲線與基準伏安曲線進行比較，根據峰值電流是否有下降，確定有機磷待測樣品液中是否含有有機磷；根據峰值電流的下降量，確定有機磷的濃度。
[0058]微電極芯片的工作原理如圖4所示，當抗體大分子403與0PD402共聚時，會在聚合膜中形成缺陷，這些缺陷可能相互連通，尤其是在聚合膜很薄的時候，很多連續的缺陷會與工作電極相通，FeM的分子405遠小于抗體分子(分子量僅為抗體分子的萬分之一)，因而可以自由穿透這些缺陷與工作電極401發生電荷交換。當抗原404與抗體結合后，聚合物膜表面的缺陷部分得以彌補，FeM運動受阻，表現為聚合物膜阻抗上升或伏安(CV)曲線峰值電流下降，而下降的程度正比于對應抗原的量，只要檢測出峰值電流的變化即可計算出相應的抗原濃度，峰值電流計算示意圖如圖5所示。
[0059]由上述工作原理可以看出，本實施方式是通過有機磷抗體OPs-Ab和有機磷抗原OPs-Ag的特異性吸附來檢測有機磷的，如果CV曲線的峰值電流下降，說明有機磷樣品液中含有OPs-Ab能檢測出的OPs-Ag。如果微電極芯片的工作電極表面聚合的OPs-Ab是一種有機磷單克隆抗體，該抗體可以檢測五種藥物:甲基對硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷、氯硫磷、皮蠅磷，那么可以檢測有機磷樣品液中是否含有這五種藥物中的一種或幾種。而由于峰值電流的下降程度正比于OPs-Ag的量，那么可以通過計算峰值電流的變化得到OPs-Ag的濃度，即有機磷待測樣品液中有機磷的含量。
[0060]值得說明的是，峰值電流的下降量與有機磷濃度之間的關系需要事先確定，具體確定方法如下:
[0061]在測得基準伏安曲線之后，將已知濃度的有機磷標準液滴到微電極芯片表面，反應預設時間之后，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征，得到參考伏安曲線.[0062]將參考伏安曲線與基準伏安曲線進行比較，獲得峰值電流的下降量，得到一組峰值電流的下降量與有機磷濃度的對應關系；
[0063]重復上述步驟，改變有機磷標準液的濃度，直到得到有機磷濃度的預設范圍內峰值電流的下降量與有機磷濃度之間的關系。
[0064]此外，值得一提的是，在微電極芯片表面進行每一步操作之后，都用磷酸鹽緩沖液清洗微電極芯片表面，可以消除前一步操作對后一步操作的影響，從而進一步保證有機磷檢測結果的準確性。具體地說，在以下情形中，用磷酸鹽緩沖液清洗微電極芯片表面:
[0065]在得到第一伏安曲線之后，在工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之前；
[0066]在工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，得到基準伏安曲線之IIJ ;
[0067]在待有機磷待測樣品液反應預設時間之后，得到測量伏安曲線之前。
[0068]與現有技術相比，本發明在微電極芯片的工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，在微電極芯片表面滴加有機磷待測樣品液，分別測定滴加有機磷待測樣品液之前和之后的伏安曲線，得到基準伏安曲線和測量伏安曲線，根據測量伏安曲線相對于基準伏安曲線的峰值電流是否有下降，確定有機磷待測樣品液中是否含有有機磷，并根據峰值電流的下降量，確定有機磷的濃度。由于本發明的有機磷檢測方法使用微電極芯片，使得有機磷檢測儀器能實現小型化、微型化，而且由于能測定電流的變化量，因此能定量檢測有機磷。
[0069]本發明的第二實施方式涉及一種基于微電極芯片的有機磷檢測方法。第二實施方式在第一實施方式基礎上做了進一步改進，主要改進之處在于:在本發明第二實施方式中，通過在多個工作電極上結合不同的有機磷待測樣品液，然后同時采用二茂鐵甲醇以循環伏安法分別對工作電極進行表征，可以提高檢測效率，實現快速檢測。
[0070]具體地說，在步驟101中提供的微電極芯片包含至少兩組微電極。
[0071]在步驟102中，在不同的工作電極上聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法分別對工作電極進行表征，得到各工作電極的基準伏安曲線；
[0072]在步驟103中，將至少兩份有機磷待測樣品液分別滴到微電極芯片表面，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法分別對工作電極進行表征，得到各有機磷待測樣品液對應的測量伏安曲線。
[0073]上面各種方法的步驟劃分，只是為了描述清楚，實現時可以合并為一個步驟或者對某些步驟進行拆分，分解為多個步驟，只要包含相同的邏輯關系，都在本專利的保護范圍內；對算法中或者流程中添加無關緊要的修改或者引入無關緊要的設計，但不改變其算法和流程的核心設計都在該專利的保護范圍內。
[0074]本發明的第三實施方式涉及一種微電極芯片，包含:襯底、制作在襯底上的至少一組微電極、電極引線和引線焊盤；微電極通過電極引線連接至引線焊盤；該微電極包含:工作電極、對電極和參比電極；一組微電極中的工作電極和對電極的相對位置固定。其中，工作電極和對電極為叉指電極、螺旋電極或微帶電極中的任意一種。工作電極可以為金電極，對電極可以為鉬電極；或者，工作電極和對電極均為金電極。
[0075]微電極芯片的引線焊盤與印制電路PCB板上相應的焊盤用金線或鋁線連接；在PCB板上加一鏤空蓋板，露出微電極部分，形成測試樣品槽，得到封裝好的微電極芯片。該封裝好的微電極芯片與電化學平臺連接，有機磷測試樣品液注入測試樣品槽，進行有機磷檢測。上述封裝設計可以保護焊線及焊點，防止焊線和焊點在測量實驗中因多次液體沖洗而斷裂脫落。
[0076]本領域的普通技術人員可以理解，上述各實施方式是實現本發明的具體實施例，而在實際應用中，可以在形式上和細節上對其作各種改變，而不偏離本發明的精神和范圍。
【權利要求】
1.一種基于微電極芯片的有機磷檢測方法，其特征在于，包含以下步驟: 51.提供一微電極芯片；其中，所述微電極芯片包含襯底以及制作在所述襯底上的至少一組微電極；所述微電極包含工作電極； 52.將鄰苯二胺與有機磷抗體混合之后，滴到所述微電極芯片表面，在工作電極上選擇性加電，在所述加電的工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征，得到基準伏安曲線； 53. 將有機磷待測樣品液滴到所述微電極芯片表面，反應預設時間之后，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征，得到所述有機磷待測樣品液對應的測量伏安曲線； 54.將所述測量伏安曲線與所述基準伏安曲線進行比較，根據峰值電流是否有下降，確定所述有機磷待測樣品液中是否含有有機磷；根據峰值電流的下降量，確定有機磷的濃度。
2.根據權利要求1所述的基于微電極芯片的有機磷檢測方法，其特征在于，在所述步驟SI之后，所述步驟S2之前，還包含以下步驟: 采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對所述微電極芯片的工作電極進行表征，得到第一伏安曲線； 在所述步驟S2中，還包含以下子步驟: 在工作電極表面形成有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，采用循環伏安法對所述微電極芯片的工作電極進行表征，得到第二伏安曲線； 在得到第二伏安曲線之后，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對所述微電極芯片的工作電極進行表征，得到基準伏安曲線。
3.根據權利要求1所述的基于微電極芯片的有機磷檢測方法，其特征在于，在所述步驟S2中，還包含以下子步驟: 在采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征之前，在所述微電極芯片表面滴加牛血清蛋白，反應預設時間之后，用磷酸鹽緩沖液清洗所述微電極芯片表面。
4.根據權利要求1所述的基于微電極芯片的有機磷檢測方法，其特征在于，還包含以下步驟: 事先確定峰值電流的下降量與有機磷濃度之間的關系； 其中，所述峰值電流的下降量與有機磷濃度之間的關系通過以下方法確定: 在得到基準伏安曲線之后，將已知濃度的有機磷標準液滴到所述微電極芯片表面，反應預設時間之后，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法對工作電極進行表征，得到參考伏安曲線.將所述參考伏安曲線與所述基準伏安曲線進行比較，獲得峰值電流的下降量，得到一組峰值電流的下降量與有機磷濃度的對應關系； 重復上述步驟，改變有機磷標準液的濃度，直到得到有機磷濃度的預設范圍內峰值電流的下降量與有機磷濃度之間的關系。
5.根據權利要求1所述的基于微電極芯片的有機磷檢測方法，其特征在于，在所述步驟SI中提供的微電極芯片包含至少兩組微電極； 在所述步驟S2中，還包含以下子步驟: 在不同的工作電極上聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法分別對工作電極進行表征，得到各工作電極的基準伏安曲線；在所述步驟S3中，還包含以下子步驟:將至少兩份有機磷待測樣品液分別滴到所述微電極芯片表面，采用二茂鐵甲醇以循環伏安法分別對工作電極進行表征，得到各有機磷待測樣品液對應的測量伏安曲線。
6.根據權利要求1至5任一項所述的基于微電極芯片的有機磷檢測方法，其特征在于，在以下情形中，用磷酸鹽緩沖液清洗所述微電極芯片表面:在得到第一伏安曲線之后，在工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之N /.1IJ ;在工作電極表面聚合有機磷抗體和鄰苯二胺的復合膜之后，得到基準伏安曲線之前；在有機磷待測樣品液反應預設時間之后，得到測量伏安曲線之前。
7.一種微電極芯片，其特征在于，包含:襯底、制作在所述襯底上的至少一組微電極、電極引線和引線焊盤；所述微電極通過所述電極引線連接至所述引線焊盤；所述微電極包含:工作電極、對電極和參比電極；一組微電極中的工作電極和對電極的相對位置固定。
8.根據權利要求7所述的微電極芯片，其特征在于，所述工作電極和對電極為叉指電極、螺旋電極或微帶電極中的任意一種。
9.根據權利要求7所述的微電極芯片，其特征在于，所述工作電極為金電極，所述對電極為鉬電極。
10.根據權利要求7所述的微電極芯片，其特征在于，所述工作電極和所述對電極均為金電極。`
11.根據權利要求7至10中任一項所述的微電極芯片，其特征在于，所述微電極芯片的引線焊盤與印制電路PCB板上相應的焊盤用金線或鋁線連接；所述PCB板上加一鏤空蓋板，露出所述微電極部分，形成測試樣品槽，得到封裝好的微電極芯片。
12.根據權利要求11所述的微電極芯片，其特征在于，所述封裝好的微電極芯片與電化學平臺連接，有機磷測試樣品液注入所述測試樣品槽，進行有機磷檢測。
【文檔編號】G01N27/30GK103675075SQ201310617713
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】紀新明, 竇宏雁, 李潔慧 申請人:復旦大學