一種同時分析檢測動物組織中殘留獸藥組分的方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時分析檢測動物組織中殘留獸藥組分的方法:動物組織樣品經過50%乙腈+乙醇勻漿、超聲提取,正己烷凈化,乙腈+乙醇進一步沉淀,濃縮后用UPLC-MS/MS在負離子模式下,進行多反應監測(MRM)測定,根據標準曲線和外標法定量,檢測計算得到動物組織中46種殘留獸藥組分的含量。本發明方法可用于18種喹諾酮類藥物、22種磺胺類藥物以及氨苯砜、苯乙醇胺A、阿莫西林、金剛烷胺、金剛乙胺、乙氧基喹啉等目前常用到的獸藥,可一次性同時快速準確檢測,擴大了本方法的應用范圍。
【專利說明】—種同時分析檢測動物組織中殘留獸藥組分的方法
一、【技術領域】
[0001]本發明涉及一種動物組織中常用獸藥殘留分析檢測的方法,尤其是涉及動物組織中殘留的18種喹諾酮類藥物、22種磺胺類藥物、2種抗病毒藥、I種β內酰胺類,I種砜類抗菌藥,I種喹惡啉類,I種β -激動劑類藥物新型快速通用多組分同時分析檢測方法。
二、【背景技術】
[0002]18種喹諾酮類藥物(包括吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西諾沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹);22種磺胺類藥物(磺胺、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧芐胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧唆、磺胺間甲氧嘧唆、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧唆、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧唆、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯噠嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹惡啉);氨苯砜、苯乙醇胺Α、金剛烷胺、金剛乙胺、阿莫西林、乙氧基喹啉是目前常用到的獸藥,普遍應用于各種禽類、水產,在動物的感染性疾病預防中具有重要的地位。但是不合理的使用容易造成耐藥菌的增加,同時殘留藥物可能對人體健康造成潛在的危害,所以必須按時停藥以保證動物性產品質量安全,同時按照獸藥國家標準和專業標準的規定,對動物組織中這些獸藥進行檢測分析。但是由于各種獸藥的物理化學性質不同,差異較大,加上檢測樣品中其他成分的干擾,對動物組織中多種獸藥殘留同時快速分析檢測構成很大的困難。
[0003]這些藥物日常使用率極高,并且在日常檢測中檢出陽性比例非常高。但是很多藥物目前沒有國標方法,例如氨苯砜、苯乙醇胺、金剛烷胺、金剛乙胺等。目前現有的國家標準方法中,也需要采用多個不同的方法對這些化合物進行檢測,操作步驟復雜,需要使用固相萃取柱等,檢測成本高,因此需要開發一種通用的檢測方法用于日常樣品的檢測。
三、
【發明內容】
[0004]本發明針對現有技術、方法存在的不足,提供一種動物組織中獸藥殘留多組分同時快速分析檢測的新方法,此種方法采用UPLC-MS/MS進行多反應監測(MRM)測定,既能保證分析效果,又能簡化前處理操作流程,便于日常檢測。
[0005]本發明采用的技術方案是:
[0006]一種同時分析檢測動物組織中殘留獸藥組分的方法,所述方法為:動物組織樣品經過50%乙腈+乙醇勻漿、超聲提取,正己烷凈化,乙腈+乙醇進一步沉淀,濃縮后用UPLC-MS/MS在負離子模式下,進行多反應監測(MRM)測定,根據標準曲線和外標法定量,檢測計算得到動物組織中46種殘留獸藥組分的含量。具體包括以下步驟:
[0007](I)制備樣品溶液:每5g搗碎后的動物組織樣品按照以下方法處理得到樣品溶液:
[0008]稱取5g搗碎后的動物組織樣品于離心管中,加入6mL2.0mmol/L乙酸銨水溶液,9mL體積比4:1的乙腈+乙醇混合液,高速充分勻漿,混勻后超聲提取5min,離心,取上清液A,剩余殘渣加入15mL體積比4:1的乙腈+乙醇混合液,超聲提取5min,離心、取上清液B與上清液A合并,得提取液,加入15mL正己烷,混勻后離心,得下層清液體,取其中7.5mL,經
0.22 μ m濾膜過濾到帶刻度的離心管中,40°C水浴下氮氣吹至I?1.2mL,加入200 μ L DMSO后,用2.0mmol/L乙酸銨水溶液定容至1.5mL刻度線,得樣品溶液;
[0009](2)將步驟(I)所得的樣品溶液經超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀檢測,得樣品溶液的超高效液相色譜圖,色譜條件為:以碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,粒徑< 5 μ m ;梯度洗脫:流動相A為含體積分數0.1%的甲酸的甲醇溶液,流動相B為含體積分數
0.1%的甲酸的水溶液;色譜柱溫度為40°C;進樣量10 μ L,流速為0.3 μ L/min ;質譜條件為:ESI正負離子同時掃描模式,毛細管電壓分別為3.5kV和3.0kV,源溫145°C,去溶劑氣溫度:450°C;去溶劑氣氮氣流速:900L/h ;錐孔氣氮氣流速:50L/h ;碰撞氣體:氬氣3.3X l(T3mba ;多反應監測(MRM)模式檢測;
[0010](3)繪制標準曲線:取吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西諾沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹、磺胺、乙酰磺胺、磺胺嘧唆、磺胺二甲異嘧唆、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧芐胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯噠嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹惡啉、氨苯砜、苯乙醇胺A、金剛烷胺、金剛乙胺、阿莫西林、乙氧基喹啉的標準品,配制成不同濃度的混合的標準工作液,按照步驟(2)相同條件進行測試,得標準工作液的超高效液相色譜圖,分別對各個標準品,按照其濃度和峰面積,繪制標準曲線,分別得到上述46種標準品的標準曲線;
[0011](4)根據步驟(2)中樣品溶液的超高效液相色譜圖中各待測成分的峰面積及其對應的標準品的標準曲線,計算出樣品溶液中各待測成分的濃度,以公式(I)計算得到動物組織樣品中各待測成分的含量:
[0012]X= (1.5XC/7.5X30)/M=6XCXMX 100%,......(I)
[0013]X——動物組織樣品中待測成分的含量,單位μ g/kg
[0014]C——根據標準曲線得到樣品溶液中待測成分的濃度,單位ng/mL
[0015]M——動物組織樣品的質量,單位g。
[0016]所述步驟(2)中,所述梯度洗脫的程序優選如下表I所示:
[0017]表I
【權利要求】
1.一種同時分析檢測動物組織中殘留獸藥組分的方法,其特征在于所述方法為:動物組織樣品經過50%乙腈+乙醇勻漿、超聲提取,正己烷凈化,乙腈+乙醇進一步沉淀,濃縮后用UPLC-MS/MS在負離子模式下,進行多反應監測測定,根據標準曲線和外標法定量,檢測計算得到動物組織中46種殘留獸藥組分的含量;所述殘留獸藥組分為吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西諾沙星、惡喹酸、萘卩定酸、氟甲喹、磺胺、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧芐胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧唆、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯噠嗪、乙胺嘧唆、磺胺多辛、磺胺喹惡啉、氨苯砜、苯乙醇胺A、金剛烷胺、金剛乙胺、阿莫西林或乙氧基喹啉。
2.如權利要求1所述的方法,其特征在于所述方法包括以下步驟: (O制備樣品溶液:每5g搗碎后的動物組織樣品按照以下方法處理得到樣品溶液: 稱取5g搗碎后的動物組織樣品于離心管中,加入6mL2.0mmoI/L乙酸銨水溶液,9mL體積比4:1的乙腈+乙醇混合液,高速充分勻漿,混勻后超聲提取5min,離心,取上清液A,剩余殘渣加入15mL體積比4:1的乙腈+乙醇混合液,超聲提取5min,離心、取上清液B與上清液A合并,得提取液,加入15mL正己烷,混勻后離心,得下層清液體,取其中7.5mL,經·0.22 μ m濾膜過濾到帶刻度的離心管中,40°C水浴下氮氣吹至I~1.2mL,加入200 μ L DMSO后,用2.0mmol/L乙酸銨水溶液定容至1.5mL刻度線,得樣品溶液; (2)將步驟(1)所得的樣品溶液經超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀檢測,得樣品溶液的超高效液相色譜圖,色譜條件為:以碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,粒徑< 5μπι ;梯度洗脫:流動相A為含體積分數0.1%的甲酸的甲醇溶液,流動相B為含體積分數0.1%的甲酸的水溶液;色譜柱溫度為40°C;進樣量10 μ L,流速為0.3 μ L/min ;質譜條件為:ESI正負離子同時掃描模式,毛細管·電壓分別為3.5kV和3.0kV,源溫145°C,去溶劑氣溫度:450°C ;去溶劑氣氮氣流速:900L/h ;錐孔氣氮氣流速:50L/h ;碰撞氣體:氬氣3.3X 10_3mba ;多反應監測模式檢測; (3)繪制標準曲線:取吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西諾沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹、磺胺、乙酰磺胺、磺胺嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧芐胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯噠嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹惡啉、氨苯砜、苯乙醇胺A、金剛烷胺、金剛乙胺、阿莫西林、乙氧基喹啉的標準品,配制成不同濃度的混合的標準工作液,按照步驟(2)相同條件進行測試,得標準工作液的超高效液相色譜圖,分別對各個標準品,按照其濃度和峰面積,繪制標準曲線,分別得到上述46種標準品的標準曲線; (4)根據步驟(2)中樣品溶液的超高效液相色譜圖中各待測成分的峰面積及其對應的標準品的標準曲線,計算出樣品溶液中各待測成分的濃度,以公式(I)計算得到動物組織樣品中各待測成分的含量: X= (1.5XC/7.5X30) /M=6XCXMX 100%......(I) X——動物組織樣品中待測成分的含量,單位μ g/kgC——根據標準曲線得到樣品溶液中待測成分的濃度,單位ng/mL M-動物組織樣品的質量,單位g。
3.如權利要求2所述的方法,其特征在于所述步驟(2)中,所述梯度洗脫的程序如下表所示:
4.如權利要求2所述的方法,其特征在于所述步驟(1)中,所述高速充分勻漿通常是以20000r/min的轉速高速勻衆I~2min。
【文檔編號】G01N30/02GK103713056SQ201310607159
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年11月25日 優先權日:2013年11月25日
【發明者】倪梅林, 鐘鶯鶯, 葛曉鳴, 湛嘉, 俞雪鈞 申請人:寧波出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心