一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于免疫學檢測領域，具體涉及一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒。所述試劑盒由發光板、辣根過氧化酶標記的玉米赤霉烯酮多克隆抗體、玉米赤酶烯酮標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光底物液和包被抗原組成。采用本發明進行檢測的靈敏度高，本發明的靈敏度可達5-500ng/mL，能夠檢出放射免疫分析和酶聯免疫分析等方法無法檢出的物質，對抗生素殘留的檢測具有十分重要的意義。本發明發光強度在4-6個量級之間與測定物質濃度間呈線性關系。本發明的光信號持續時間長，分析方法簡便快速。
【專利說明】一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫學檢測領域，具體涉及一種玉米赤霉烯酮化學發光檢測試劑盒。【背景技術】
[0002]目前檢測谷物中真菌毒素殘留的技術主要有以下幾種方法:
(I)理化檢測法:20世紀90年代以后，絕大多數測定谷物中真菌毒素殘留的理化檢測法主要依靠液相色譜技術進行分離，其次是色/質譜聯用技術，氣相色譜法、高效薄層色譜法等檢測法，因其各自特有的性能，在真菌毒素檢測方面稍有應用。色譜法檢測谷物中真菌毒素殘留要經過樣品處理(包括樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟)、殘留藥物的分離和殘留藥物的檢測。理化檢測法利用毒素分子中的基團所具有的特殊反應或性質來測定其含量，能進行定性、定量分析和藥物鑒定，可作為谷物中真菌毒素殘留檢測的確證方法。該法檢測敏感性較高，但儀器及檢測費用高、檢測程序復雜、較耗時間等。
[0003](2)免疫學分析法:免疫學分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的分析方法，目前真菌毒素殘留免疫分析技術主要分三大類:相對獨立的分析方法、免疫分析技術與常規理化分析技術聯用的方法、免疫受體法。1973年荷蘭van weeman、schurrs及瑞典Engvall、Perlmann分別提出酶聯免疫吸附法，30多年來國內外學者對免疫學方法檢測谷物中真菌毒素殘留進行了大量研究。但由于毒素是半抗原，抗原構建技術難度大、免疫特異性強、檢測成本高，目前IDEXX實驗室公司等在免疫分析法方面的研究較為成熟，國內該技術仍處于研究發展中。但是酶聯免疫吸附法與發光法相比，酶聯免疫吸附法靈敏度較低，檢測結果不精確，影響進一步研究。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒，不僅靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速、無毒無污染，而且所用器材、價格低廉，易于普及使用。
[0005]本發明所采用的技術方案是，一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒，由發光板、試劑和盒體構成，試劑放置在盒體中，所述試劑由辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體、玉米赤酶烯酮標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光底物液和包被抗原組成，所述辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體為以玉米赤酶烯酮與卵清蛋白偶聯作為免疫原的大白兔抗體；
所述玉米赤酶烯酮與卵清蛋白偶聯的免疫原制備方法，包括以下步驟:
(1)稱取IOmg的對氨基苯甲酸加入到體積為1.1mL的氯化銨溶液中，制得對氨基苯甲酸溶液；之后稱取6mg的NaNO2加入到體積為0.35mL的蒸餾水中，在溫度為0_4°C的條件下攪拌均勻，制得NaNO2溶液；將NaNO2溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應I小時，得溶液A ;
(2)量取2.4μ L玉米赤酶烯酮溶液加入到體積為IOmL的硼砂緩沖液中，并在溫度為0-4°C下攪拌均勻，之后向該溶液中逐滴加入0.9mL的溶液A，避光反應2小時，得到桔黃色溶液B ;所述硼砂緩沖液的濃度為0.05mol/L, pH值為8.5，硼砂緩沖液中含有濃度為0.15mol/L 的 NaCl ；
(3)向溶液B中加入H3BO3晶體直至溶液B的pH值為7.4，之后向調過pH值的溶液B中加入94mgBSA，80mgEDC, 24mgNHS,在室溫條件下攪拌2小時，得桔黃色溶液C ；
(4)將溶液C轉移到透析袋中，之后用PBS緩沖液在溫度為0-4°C的條件下透析五天，每12小時更換一次PBS緩沖液，將透析后的溶液凍干，得到淡黃色固體粉末即為免疫原，將免疫原放置在溫度為_20°C的條件下保存，備用；所述PBS緩沖液的pH值為7.4，濃度為
0.01mol/L ；
所述包被抗原的制備方法，包括以下步驟:
(1)稱取9mg的NaNO2加入到體積為3mL的蒸餾水中，制得NaN02溶液，然后稱取IOmg的玉米赤酶烯酮加入到體積為1.6mL、濃度為0.2mol/L的鹽酸溶液中，在溫度為0_4°C的條件下攪拌均勻，制得赤酶烯酮溶液，將NaNO2溶液逐滴加入赤酶烯酮溶液中，避光反應0.5小時，之后向該溶液中加入25mg硫酸銨直至無氮氣放出，制得溶液D ；
(2)稱取70mg卵清蛋白加入到4mL的PBS緩沖溶液中，所述PBS緩沖溶液的濃度為
0.lmol/L, pH值為7.5，然后將溶液D逐滴加入到該溶液中，制得混合液，然后用濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液將混合 液的pH值調至7.5，并在溫度為0_4°C的條件下避光反應18小時，制得溶液E ;
(3)將溶液E轉移到透析袋中，并在溫度為0-4°C的條件下，用濃度為0.01mol/L, pH值為7.4的PBS緩沖液透析五天,每12小時更換一次PBS緩沖液,之后將透析液置于轉速為3000r/min的離心機中離心15分鐘，提取上清液并凍干，得到淡黃色固體粉末即為包被抗原，之后將包被抗原置于溫度為-20°C的條件下保存，備用。
[0006]所述化學發光底物液，包括A液和B液，所述A液的制備方法是:將濃度為
0.01mol/L的魯米諾溶解到濃度為0.01M、pH為8.8的Tris緩沖液中制得；所述B液的制備方法是:先將濃度為0.001mol/L的對碘苯酚溶解到濃度為0.01mol/L、pH為8.8的Tris緩沖液中，之后再向緩沖液中加入雙氧水與水比例為3:10000的無菌水。
[0007]所述玉米赤酶烯酮標準液的濃度分別為30ng/ml、60ng/ml、200ng/ml、500ng/ml。
[0008]所述的濃縮洗滌液由NaCl 80g,KH2PO4 2.0g^Na2HPO4.12H20 229.0g,KCl 2.0g 和吐溫-20溶于1000mL蒸餾水中攪拌均勻后制得，制得的濃縮洗滌液中吐溫-20質量百分比濃度為0.5%。
[0009]所述的濃縮洗滌液:在使用前，將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍。
[0010]本發明的有益效果有以下五個方面:
一、本發明的試劑中通過采用多克隆抗體，不僅利于檢測結果的沉淀和凝集，而且檢測時反應強度大、易于觀察。且本發明由于采用多克隆抗體，不僅制備方法簡單，而且價格低廉,大大降低了生產成本。
[0011]二、本發明的靈敏度高，靈敏度是化學發光免疫分析的關鍵，本發明通過采用玉米赤酶烯酮與卵清蛋白的偶聯物作為包被抗原、辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體作為抗體，靈敏度可達5-500 ng/mL，能夠檢出放射免疫分析和酶聯免疫分析等方法無法檢出的物質，對抗生素殘留的檢測具有重要意義。[0012]三、寬的線性動力學范圍，本發明的發光強度在4-6個量級之間，且與測定物質濃度間呈線性關系。與顯色的酶免疫分析吸光度(0D值)為2.0的范圍相比，優勢明顯。
[0013]四、本產品發光底物穩定好，光信號持續時間長。
[0014]五、安全性好、保存期長，本發明避免了放射性物質的使用，未發現危害性，且本發明的試劑穩定，保存期可達一年。
【具體實施方式】
[0015]一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒，由發光板、試劑和盒體構成，試劑放置在盒體中，所述試劑由辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體、玉米赤酶烯酮標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光底物液和包被抗原組成，所述辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體為以玉米赤酶烯酮與卵清蛋白偶聯作為免疫原的大白兔抗體；
所述玉米赤酶烯酮與卵清蛋白偶聯的免疫原制備方法，包括以下步驟:
(1)稱取IOmg的對氨基苯甲酸加入到體積為1.1mL的氯化銨溶液中，制得對氨基苯甲酸溶液；之后稱取6mg的NaNO2加入到體積為0.35mL的蒸餾水中，在溫度為0_4°C的條件下攪拌均勻，制得NaNO2溶液；將NaNO2溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應I小時，得溶液A ;
(2)量取2.4μ L玉米赤酶烯酮溶液加入到體積為IOmL的硼砂緩沖液中，并在溫度為0-4°C下攪拌均勻，之后向該溶液中逐滴加入0.9mL的溶液A，避光反應2小時，得到桔黃色溶液B ;所述硼砂緩沖液的濃度為0.05mol/L, pH值為8.5，硼砂緩沖液中含有濃度為0.15mol/L 的 NaCl ；
(3)向溶液B中加入H3BO3晶體直至溶液B的pH值為7.4，之后向調過pH值的溶液B中加入94mgBSA，80mgEDC, 24mgNHS,在室溫條件下攪拌2小時，得桔黃色溶液C ；
(4)將溶液C轉移到透析袋中，之后用PBS緩沖液在溫度為0-4°C的條件下透析五天，每12小時更換一次PBS緩沖液，將透析后的溶液凍干，得到淡黃色固體粉末即為免疫原，將免疫原放置在溫度為_20°C的條件下保存，備用；所述PBS緩沖液的pH值為7.4，濃度為0.01mol/L ；
所述包被抗原的制備方法，包括以下步驟:
(1)稱取9mg的NaNO2加入到體積為3mL的蒸餾水中，制得NaN02溶液，然后稱取IOmg的玉米赤酶烯酮加入到體積為1.6mL、濃度為0.2mol/L的鹽酸溶液中，在溫度為0_4°C的條件下攪拌均勻，制得赤酶烯酮溶液，將NaNO2溶液逐滴加入赤酶烯酮溶液中，避光反應0.5小時，之后向該溶液中加入25mg硫酸銨直至無氮氣放出，制得溶液D ；
(2)稱取70mg卵清蛋白加入到4mL的PBS緩沖溶液中，所述PBS緩沖溶液的濃度為
0.lmol/L, pH值為7.5，然后將溶液D逐滴加入到該溶液中，制得混合液，然后用濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液將混合液的pH值調至7.5，并在溫度為0_4°C的條件下避光反應18小時，制得溶液E ;
(3)將溶液E轉移到透析袋中，并在溫度為0-4°C的條件下，用濃度為0.01mol/L，pH值為7.4的PBS緩沖液透析五天,每12小時更換一次PBS緩沖液,之后將透析液置于轉速為3000r/min的離心機中離心15分鐘，提取上清液并凍干，得到淡黃色固體粉末即為包被抗原，之后將包被抗原置于溫度為-20°C的條件下保存，備用。
[0016]所述化學發光底物液，包括A液和B液，所述A液的制備方法是:將濃度為
0.01mol/L的魯米諾溶解到濃度為0.01M、pH為8.8的Tris緩沖液中制得；所述B液的制備方法是:先將濃度為0.001mol/L的對碘苯酚溶解到濃度為0.01mol/L、pH為8.8的Tris緩沖液中，之后再向緩沖液中加入雙氧水與水比例為3:10000的無菌水。
[0017]所述玉米赤酶烯酮標準液的濃度分別為30ng/ml、60ng/ml、200ng/ml、500ng/ml。
[0018]所述的濃縮洗滌液由NaCl 80g,KH2PO4 2.0g^Na2HPO4.12H20 229.0g,KCl 2.0g 和吐溫-20溶于1000mL蒸餾水中攪拌均勻后制得，制得的濃縮洗滌液中吐溫-20質量百分比濃度為0.5%。
[0019]實施例1
一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒，由發光板、試劑和盒體構成，試劑放置在盒體中，所述試劑由辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體、玉米赤酶烯酮標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光底物液和包被抗原組成，所述辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體為以玉米赤酶烯酮與卵清蛋白偶聯作為免疫原的大白兔抗體；所述玉米赤酶烯酮與卵清蛋白偶聯的免疫原制備方法，包括以下步驟:
(1)稱取IOmg的對氨基苯甲酸加入到體積為1.1mL的氯化銨溶液中，制得對氨基苯甲酸溶液；之后稱取6mg的NaNO2加入到體積為0.35mL的蒸餾水中，在溫度為0_4°C的條件下攪拌均勻，制得NaNO2溶液；將NaNO2溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應I小時，得溶液A ;
(2)量取2.4μ L玉米赤酶烯酮溶液加入到體積為IOmL的硼砂緩沖液中，并在溫度為0-4°C下攪拌均勻，之后向該溶液中逐滴加入0.9mL的溶液A，避光反應2小時，得到桔黃色溶液B ;所述硼砂緩沖液的濃度為0.05mol/L, pH值為8.5，硼砂緩沖液中含有濃度為
0.15mol/L 的 NaCl ；
(3)向溶液B中加入H3BO3晶體直至溶液B的pH值為7.4，之后向調過pH值的溶液B中加入94mgBSA，80mgEDC, 24mgNHS,在室溫條件下攪拌2小時，得桔黃色溶液C ；
(4)將溶液C轉移到透析袋中，之后用PBS緩沖液在溫度為0-4°C的條件下透析五天，每12小時更換一次PBS緩沖液，將透析后的溶液凍干，得到淡黃色固體粉末即為免疫原，將免疫原放置在溫度為_20°C的條件下保存，備用；所述PBS緩沖液的pH值為7.4，濃度為
0.01mol/L ；
所述包被抗原的制備方法，包括以下步驟:
(1)稱取9mg的NaNO2加入到體積為3mL的蒸餾水中，制得NaN02溶液，然后稱取IOmg的玉米赤酶烯酮加入到體積為1.6mL、濃度為0.2mol/L的鹽酸溶液中，在溫度為0_4°C的條件下攪拌均勻，制得赤酶烯酮溶液，將NaNO2溶液逐滴加入赤酶烯酮溶液中，避光反應0.5小時，之后向該溶液中加入25mg硫酸銨直至無氮氣放出，制得溶液D ；
(2)稱取70mg卵清蛋白加入到4mL的PBS緩沖溶液中，所述PBS緩沖溶液的濃度為
0.lmol/L, pH值為7.5，然后將溶液D逐滴加入到該溶液中，制得混合液，然后用濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液將混合液的pH值調至7.5， 并在溫度為0_4°C的條件下避光反應18小時，制得溶液E ;
(3)將溶液E轉移到透析袋中，并在溫度為0-4°C的條件下，用濃度為0.01mol/L, pH值為7.4的PBS緩沖液透析五天,每12小時更換一次PBS緩沖液,之后將透析液置于轉速為3000r/min的離心機中離心15分鐘，提取上清液并凍干，得到淡黃色固體粉末即為包被抗原，之后將包被抗原置于溫度為-20°C的條件下保存，備用。
[0020]所述化學發光底物液，包括A液和B液，所述A液的制備方法是:將濃度為
.0.01mol/L的魯米諾溶解到濃度為0.01M、pH為8.8的Tris緩沖液中制得；所述B液的制備方法是:先將濃度為0.001mol/L的對碘苯酚溶解到濃度為0.01mol/L、pH為8.8的Tris緩沖液中，之后再向緩沖液中加入雙氧水與水比例為3:10000的無菌水。
[0021 ] 所述玉米赤酶烯酮標準液的濃度分別為30ng/ml、60ng/ml、200ng/ml、500ng/ml。
[0022]所述的濃縮洗滌液由NaCl 80g,KH2PO4 2.0g^Na2HPO4.12H20 229.0g,KCl 2.0g 和吐溫-20溶于1000mL蒸餾水中攪拌均勻后制得，制得的濃縮洗滌液中吐溫-20質量百分比濃度為0.5%。
[0023]樣品的前期處理:
(1)實驗準備:配制體積百分比濃度為60%的甲醇水溶液和體積百分比濃度為20%的甲醇水溶液。
[0024](2)稱取5 g待測樣品粉碎后置于IOOmL的帶塞三角瓶內，之后向三角瓶內加入25 mL體積百分比濃度60%甲醇水溶液。
[0025](3)將步驟(2)處理的樣品放入振蕩器內，充分振蕩3分鐘后，用Whatman I號濾紙過濾,收集濾液。
[0026](4)取步驟(3)的濾液2mL，并加入6 mL體積百分比濃度為20%的甲醇水溶液，攪拌混勻后，用whatman I號濾紙過濾,此為樣品待檢液。
[0027]2、檢測過程:
選擇并將辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體稀釋8000倍，包被抗原濃度為1.5 μ g/mL進行試劑盒參數的測定。
[0028](1)包被:用濃度為0.05M，pH值為9.6的碳酸鹽包被溶液將包被抗原配成
.1.5 μ g/mL的溶液，每個聚苯乙烯板的反應孔中加100 μ L，在溫度為4°C的條件下過夜保存。次日，除去反應孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，300 μ L/孔，每次5分鐘，拍干。
[0029](2)封閉:用封閉溶液封閉上述已包被的酶標板，250 μ L/孔，在溫度為37°C的條件下孵育I小時，然后用洗滌緩沖液洗3次，300 μ L/孔，每次5分鐘。
(3)加樣:向步驟(2)中已封閉的反應孔中加入50μ L質量濃度分別為30ng/ml，60ng/ml, 200ng/ml, 500ng/ml的赤酶烯酮標準溶液。然后向各反應孔中加入稀釋8000倍后的辣根過氧化酶標記的赤酶烯酮抗體，100 μ L/孔，在溫度為37°C的條件下反應0.5小時，然后用洗滌緩沖液洗3次，300 μ L/孔，每次5分鐘。
(4)發光:向各反應孔中加入臨時配制的化學發光底物液100μ L/孔，并立即用化學發光免疫分析儀進行檢測。
[0030](5)檢測結果:取標準品濃度對數作橫坐標，標準品檢測發光值對數作縱坐標，做標準曲線，每一個樣品的濃度可以從標準曲線上計算出來。
[0031]檢測結果如下表所示:
【權利要求】
1.一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒，由發光板、試劑和盒體構成，試劑放置在盒體中，其特征在于:所述試劑由辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體、玉米赤酶烯酮標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光底物液和包被抗原組成，所述辣根過氧化酶標記的玉米赤酶烯酮多克隆抗體為以玉米赤酶烯酮與卵清蛋白偶聯作為免疫原的大白兔抗體； 所述玉米赤酶烯酮與卵清蛋白偶聯的免疫原制備方法，包括以下步驟: (1)稱取IOmg的對氨基苯甲酸加入到體積為1.1mL的氯化銨溶液中，制得對氨基苯甲酸溶液；之后稱取6mg的NaNO2加入到體積為0.35mL的蒸餾水中，在溫度為0_4°C的條件下攪拌均勻，制得NaNO2溶液；將NaNO2溶液逐滴加入到對氨基苯甲酸溶液中，避光反應I小時，得溶液A ; (2)量取2.4μ L玉米赤酶烯酮溶液加入到體積為IOmL的硼砂緩沖液中，并在溫度為0-4°C下攪拌均勻，之后向該溶液中逐滴加入0.9mL的溶液A，避光反應2小時，得到桔黃色溶液B ;所述硼砂緩沖液的濃度為0.05mol/L, pH值為8.5，硼砂緩沖液中含有濃度為0.15mol/L 的 NaCl ； (3)向溶液B中加入H3BO3晶體直至溶液B的pH值為7.4，之后向調過pH值的溶液B中加入94mgBSA，80mgEDC, 24mgNHS,在室溫條件下攪拌2小時，得桔黃色溶液C ； (4)將溶液C轉移到透析袋中，之后用PBS緩沖液在溫度為0-4°C的條件下透析五天，每12小時更換一次PBS緩沖液，將透析后的溶液凍干，得到淡黃色固體粉末即為免疫原，將免疫原放置在溫度為_20°C的條件下保存，備用；所述PBS緩沖液的pH值為7.4，濃度為0.01mol/L ； 所述包被抗原的制備方法，包括以下步驟: (1)稱取9mg的NaNO2加入到體積為3mL的蒸餾水中，制得NaN02溶液，然后稱取IOmg的玉米赤酶烯酮加入到體積為1.6mL、濃度為0.2mol/L的鹽酸溶液中，在溫度為0_4°C的條件下攪拌均勻，制得赤酶烯酮溶液，將NaNO2溶液逐滴加入赤酶烯酮溶液中，避光反應0.5小時，之后向該溶液中加入25mg硫酸銨直至無氮氣放出，制得溶液D ； (2)稱取70mg卵清蛋白加入到4mL的PBS緩沖溶液中，所述PBS緩沖溶液的濃度為0.lmol/L, pH值為7.5，然后將溶液D逐滴加入到該溶液中，制得混合液，然后用濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液將混合液的pH值調至7.5，并在溫度為0_4°C的條件下避光反應18小時，制得溶液E ; (3)將溶液E轉移到透析袋中，并在溫度為0-4°C的條件下，用濃度為0.01mol/L, pH值為7.4的PBS緩沖液透析五天,每12小時更換一次PBS緩沖液,之后將透析液置于轉速為3000r/min的離心機中離心15分鐘，提取上清液并凍干，得到淡黃色固體粉末即為包被抗原，之后將包被抗原置于溫度為-20°C的條件下保存，備用。
2.根據權利要求1所述的一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒，其特征在于:所述化學發光底物液，包括A液和B液，所述A液的制備方法是:將濃度為0.01mol/L的魯米諾溶解到濃度為0.01M、pH為8.8的Tris緩沖液中制得；所述B液的制備方法是:先將濃度為0.001mol/L的對碘苯酚溶解到濃度為0.01mol/L、pH為8.8的Tris緩沖液中，之后再向緩沖液中加入雙氧水與水比例為3:10000的無菌水。
3.根據權利要求1所述的一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒，其特征在于:所述玉米赤酶烯酮標準液的濃度分別為30ng/ml、60ng/ml、200ng/ml、500ng/ml。
4.根據權利要求1所述的一種玉米赤酶烯酮化學發光檢測試劑盒，其特征在于:所述的濃縮洗滌液由 NaCl 80g,KH2PO4 2.0g^Na2HPO4.Iffi2O 229.0g,KCl 2.0g 和吐溫-20 溶于1000mL蒸餾水中攪拌均勻后制得，制得的濃縮洗滌液中吐溫-20質量百分比濃度為0.5%。
【文檔編號】G01N33/64GK103616515SQ201310601069
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月25日 優先權日:2013年11月25日
【發明者】王善普, 張江宏, 智雪玲, 王慶利, 張興偉 申請人:洛陽萊普生信息科技有限公司