犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條及制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條及制備方法。該檢測試紙包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區、吸水區和底板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區和吸水區依次鋪設在底板上并相互部分重疊；金標探針區包被有膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體F1；固相化抗體區依次有檢測線和對照線，檢測線包被有抗犬細小病毒單克隆抗體B6；對照線包被有羊抗小鼠IgG。通過將玻璃纖維膜、包被有抗犬細小病毒單克隆抗體F1的聚酯膜、包被有檢測線和對照線的硝酸纖維素膜、和吸水濾紙組裝到聚乙烯板上得到犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條。本發明的試紙檢測快速，準確率高，特異性強，攜帶、操作簡便。
【專利說明】犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測試紙條及制備方法，具體涉及一種犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條及制備方法。
【背景技術】
[0002]犬細小病毒(Canine Parvovirus, CPV)是細小病毒屬成員，單鏈小DNA病毒。病毒粒子為等軸對稱的二十面體，外觀呈圓形或六邊形，無囊膜，病毒顆粒直徑為21nm?24nm，沉降系數為23S?27S。在1977年，首次從患有腸炎的病犬體內分離獲得CPV，病犬以嘔吐、出血性腸炎、白細胞減少為主要特征，幼犬的易感性高，可引起幼犬的心肌炎；為了與犬極小病毒(MCV)相區別而命名為CPV-2，隨后在許多國家和地區的犬科動物中相繼被發現，發病率為50%?100%，死亡率為0%?50%，對養犬業和經濟動物養殖業危害極大，并且也影響到了野生動物的生存，因此要建立快速有效的檢測方法，并針對該病進行有效治療。
[0003]我國已建立的用于檢測CPV抗體的血清學方法有血凝試驗、血凝抑制試驗、瓊脂擴散試驗等，但是由于CPV與貓泛白細胞減少癥病毒、水貂腸炎病毒三者之間能發生交叉血清學反應，因此在實際應用中這些方法常受到限制。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)可檢測CPV抗原，也可檢測CPV抗體；PCR檢測敏感性高，特異性強，可分辨野毒感染和疫苗免疫，但這兩種技術都需要特殊的儀器設備。利用膠體金標記單克隆CPV表面抗體，制成檢測CPV抗原的膠體金檢測試紙條敏感性高，特異性強，穩定性好，操作簡便快速，結果易于分析判定。王中力等，在中國預防獸醫學報上發表的文章《犬細小病毒免疫膠體金診斷技術的研究》中提到的方法是標記抗犬細小病毒單克隆抗體，包被抗犬細小病毒兔多抗。
【發明內容】
[0004]本發明的首要目的在于提供一種犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，為快速檢測犬細小病毒，為臨床診斷提供可靠依據。該檢測試紙條采用膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl做探針，包被抗犬細小病毒單克隆抗體B6和羊抗小鼠IgG的雙抗體夾心法檢測犬細小病毒，可供犬科動物及犬細小病毒易感動物的犬細小病毒檢測。
[0005]本發明的另一目的在于提供上述犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0007]—種犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區、吸水區和底板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區和吸水區依次鋪設在底板上并相互部分重疊；金標探針區包被有膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體F1，其標記量優選為I?10 μ g/mL (每mL膠體金標記I?10 μ g抗犬細小病毒單克隆抗體Fl);固相化抗體區(自金標探針區至吸水區方向)依次有檢測線和對照線，檢測線包被有抗犬細小病毒單克隆抗體B6，包被量優選為0.1?10 μ g/cm ;對照線包被有羊抗小鼠IgG，包被量優選為0.1?10 μ g/cm。所述的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和B6由抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株Fl和B6產生；(劉潔等，分泌抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立，中國獸藥雜志，2013，47 (7):9-12)，其中，抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株Fl保藏編號為CCTCC NO:C2013175，抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株B6保藏編號為:CCTCC NO:C2013176o
[0008]所述的底板的材料優選為聚乙烯板(PVC板)；所述的樣品吸收區的材料優選為玻璃纖維膜；所述的金標探針區的材料優選為聚酯膜；所述的固相化抗體區的材料優選為硝酸纖維素膜；所述的吸水區的材料優選為吸水濾紙。
[0009]上述犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟:將膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl噴涂于聚酯膜上；在硝酸纖維素膜上依次包被檢測線(包被有抗犬細小病毒單克隆抗體B6)和對照線(包被羊抗小鼠IgG);將玻璃纖維膜、包被有抗犬細小病毒單克隆抗體Fl的聚酯膜、包被有檢測線和對照線的硝酸纖維素膜、和吸水濾紙組裝到聚乙烯板上得到犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條。
[0010]優選的，所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟:
[0011](I)抗犬細小病毒單克隆抗體的制備:選8?10周齡體重20g以上的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔分別注射抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株Fl和B6，接種量為2 X IO6?4 X IO6細胞/0.5mL/只，約經過一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000rpm離心15min，取上清備用；將腹水用50%飽和度的硫酸銨鹽析2次，透析除鹽即得純化的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和抗犬細小病毒單克隆抗體B6。
[0012](2)膠體金標記抗犬細小病毒單克隆抗體Fl的方法:分別取半徑為5?40nm的膠體金20mL及抗犬細小病毒單克隆抗體F150?200 μ g，在ρΗ8.0?9.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加PEG-20000作為穩定劑，且使得PEG-20000最終質量濃度為10?20%，采用離心法除去未結合的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-Fl復合物(膠體金標記的犬細小病毒單克隆抗體Fl )。
[0013](3)將膠體金-Fl復合物噴涂于聚酯膜上:用20mL聚乙二醇洗滌膠體金-Fl復合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2mL濃度為2mmol/L、pH6.0?8.0的硼酸緩沖液溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上15μ L/cm，凍干。
[0014](4)硝酸纖維素膜的包被:檢測線包被的是抗犬細小病毒單克隆抗體B6，包被量為0.1?10 μ g/cm,對照線包被的是羊抗小鼠IgG,包被量為0.1?10 μ g/cm,每條線寬2?5mm ο
[0015](5)試紙條制備:將玻璃纖維膜、包被膠體金-Fl復合物的聚酯膜、包被檢測線和對照線的硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次粘附于聚乙烯板上，將組裝好的試紙條縱向切成4mm的條狀即為犬細小病毒膠體金免疫層析試紙條。
[0016]本發明相對于現有技術具有如下優點和效果:
[0017]檢測時，用無菌棉簽沾取待檢動物的糞便樣品，在ImL PBS緩沖液(pH7.2?7.4)中混勻，待大顆粒沉于管底后，取上清滴在該試紙條樣品吸收區，5?10分鐘后判讀結果，對比檢測線和對照線的顏色，即可判定被檢動物體內是否帶有犬細小病毒或感染犬細小病毒。[0018](I)檢測快速:檢測時間只需5?10分鐘，能夠滿足現場檢測的需要。
[0019](2)檢測準確率高、特異性好:本發明試紙條與其他犬易感病原沒有交叉反應，檢測靈敏度高于血凝試驗，與同類試紙條相比，符合率高達98%。
[0020](3)攜帶方便，操作簡便:本發明不需要借助其它儀器設備，適合各級獸醫院、動物診所和個人使用。
[0021](4)檢測試紙條在常溫下即可保存，保存期可達I年，且檢測重復性好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的結構示意圖；其中，I為樣品吸收區，2為金標探針區，3為固相化抗體區，31為檢測線，32為對照線，4為吸水區，5為底板。
[0023]圖2是試紙條敏感性試驗結果圖；其中，1:陰性對照；2?15:犬細小病毒陽性樣品從1:22開始倍比稀釋至1:215。
[0024]圖3是血凝試驗結果圖；其中，A、B:陽性參考樣品從左至右21?212倍比稀釋；C:陰性對照。
【具體實施方式】
[0025]下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0026]實施例1
[0027]犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的結構示意圖如圖1所示，試紙條水平面從右到左依次為樣品吸收區1、金標探針區2、固相化抗體區3和吸水區4鋪設在底板5上并相互部分重疊；樣品吸收區1、金標探針區2、固相化抗體區3、吸水區4和底板5的材料分別為玻璃纖維膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜、吸水濾紙和聚乙烯板。金標探針區2包被有膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl,其標記量為4 μ g/mL ;固相化抗體區3 (自金標探針區至吸水區方向)依次有檢測線31和對照線32，檢測線包被有抗犬細小病毒單克隆抗體B6，包被量為0.6 μ g/cm ;對照線32包被有羊抗小鼠IgG，包被量為0.6 μ g/cm。
[0028]上述犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條制備方法如下:
[0029](I)抗犬細小病毒單克隆抗體的制備:選8?10周齡體重20g以上的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔分別注射抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株Fl和B6，接種量為2 X IO6?4 X IO6細胞/0.5mL/只，約經過一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000rpm離心15min，取上清備用。將腹水用50%飽和度的硫酸銨鹽析2次，透析除鹽即得純化的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和抗犬細小病毒單克隆抗體B6(劉潔等，分泌抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立，中國獸藥雜志，2013，47 (7):9-12)。其中，抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株Fl和B6均于2013年11月I日保藏于中國典型培養物保藏中心(中國.武漢.武漢大學)，保藏編號分別為CCTCC NO:C2013175和CCTCCNO:C2013176o
[0030](2)膠體金標記抗犬細小病毒單克隆抗體Fl的方法:分別取半徑為25nm的膠體金20mL及抗犬細小病毒單克隆抗體F180 μ g，在ρΗ9.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加PEG-20000作為穩定劑，且使得PEG-20000最終質量濃度為20%，采用離心法除去未結合Fl和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-Fl復合物。
[0031](3)將膠體金-Fl復合物噴涂于聚酯膜上:用20mL聚乙二醇洗滌膠體金-Fl復合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2mL濃度為2mmol/L、pH6.0的硼酸緩沖液溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上15μ L/cm，凍干。
[0032](4)硝酸纖維素膜的包被:檢測線包被的是抗犬細小病毒單克隆抗體B6，對照線包被的是羊抗小鼠IgG，每條線寬2mm。
[0033](5)試紙條制備:將玻璃纖維膜、包被膠體金-Fl復合物的聚酯膜、包被檢測線和對照線的硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次粘附于聚乙烯板上，將組裝好的試紙條縱向切成4mm的條狀即為犬細小病毒膠體金免疫層析試紙條。
[0034]實施例2
[0035]除檢測線31包被抗犬細小病毒單克隆抗體B6的量為1.5 μ g/cm ;對照線32包被羊抗小鼠IgG的量為1.5 μ g/cm ;金標探針區2包被的膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl的標記量為4 μ g/mL,膠體金標記抗犬細小病毒單克隆抗體Fl方法:分別取半徑為25nm膠體金溶液20mL及抗犬細小病毒單克隆抗體F180y g，在pH9.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加PEG-20000作為穩定劑，且使得PEG-20000最終質量濃度為20%，采用離心法除去未結合抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-Fl復合物外，其余與實施例1相同。
[0036]實施例3
[0037]除檢測線31包被抗犬細小病毒單克隆抗體B6的量為4.8 μ g/cm ;對照線32包被羊抗小鼠IgG的量為4.8 μ g/cm ;金標探針區2包被的膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl的標記量為10 μ g/mL,膠體金標記抗犬細小病毒單克隆抗體Fl方法:分別取半徑為40nm膠體金溶液20mL及抗犬細小病毒單克隆抗體F1200 μ g，在pH9.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加PEG-20000作為穩定劑，且使得PEG-20000最終質量濃度為10%，采用離心法除去未結合抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-Fl復合物外，其余與實施例1相同。
[0038]實施例4
[0039]犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的使用方法:
[0040]檢測時，用無菌棉簽沾取待檢動物的糞便樣品，在ImL PBS緩沖液(pH7.2，
0.01mol/L)中混勻，待大顆粒沉于管底后，取上清滴在該試紙條上，5?10分鐘后判讀結果，對比檢測線和對照線的顏色，即可判定被檢動物體內是否帶有犬細小病毒或感染犬細小病毒。如檢測線出現紅色為陽性反應，應及時治療或密切觀察；如檢測線無此反應，即為陰性，表明樣品中沒有犬細小病毒或犬細小病毒量太低。對照線不管樣品中有沒有犬細小病毒均出現紅色的陽性反應，表明試紙條有效，如果對照線無反應，說明試紙條失效。
[0041]實施例5
[0042]將犬細小病毒F81細胞培養上清做22?215倍比稀釋，用實施例1中制備好的犬細小病毒抗原檢測試紙條進行檢測；同時將同一樣品做21?212倍比稀釋，做病毒血凝試驗(HA)作為對照，評價試紙條的敏感性。結果如圖2和圖3所示，試紙條檢測陽性參考樣品最低稀釋度為211，而血凝試驗檢測到陽性參考樣品的血凝價為21(1，兩種檢測結果表明犬細小病毒檢測試紙條比血凝試驗敏感性高一倍，可以檢測到血凝試驗檢測不到的犬細小病毒陽性樣品。
[0043]實施例6
[0044]用實施例1中制備好的犬細小病毒抗原檢測試紙檢測10份健康犬糞便樣品、犬瘟熱病毒細胞毒樣品、狂犬病毒滅活疫苗樣品、犬腺病毒細胞毒樣品、犬冠狀病毒細胞毒樣品、犬副流感病毒細胞毒樣品各1份，檢測結果均為陰性。
[0045]實施例7
[0046]分別用實施例1制備的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條與韓國進口犬細小病毒檢測試紙條(韓國安捷公司)對臨床60份樣品進行檢測，同時對比臨床癥狀。
[0047]結果表明(表1)，兩試紙條對待檢樣品的陽性符合率為100%，陰性符合率為97.5%，總符合率為98%，不符合的一例經對比臨床癥狀進行進一步驗證為犬細小病毒陽性，因此本發明試紙條優于其它商品試紙條。
[0048]表1兩種試紙條檢測樣品對比結果
[0049]
【權利要求】
1.一種犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，其特征在于:包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區、吸水區和底板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區和吸水區依次鋪設在底板上并相互部分重疊；金標探針區包被有膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl ;固相化抗體區依次有檢測線和對照線，檢測線包被有抗犬細小病毒單克隆抗體B6 ；對照線包被有羊抗小鼠IgG ;所述的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和B6由抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株Fl和B6產生，抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株Fl和B6保藏編號分別為 CCTCC NO:C2013175 和 CCTCC NO:C2013176。
2.根據權利要求1所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，其特征在于:所述的膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl的標記量為I~10 μ g/mL ;所述的抗犬細小病毒單克隆抗體B6的包被量為0.1~10 μ g/cm ;所述的羊抗小鼠IgG的為0.1~10 μ g/cm。
3.根據權利要求1所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，其特征在于:所述的底板的材料為聚乙烯板；所述的樣品吸收區的材料為玻璃纖維膜；所述的金標探針區的材料為聚酯膜；所述的固相化抗體區的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區的材料為吸水濾紙。
4.權利要求1-3任一項所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于包括如下步驟:將膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl噴涂于聚酯膜上；在硝酸纖維素膜上依次包被檢測線和對照線；將玻璃纖維膜、包被有抗犬細小病毒單克隆抗體Fl的聚酯膜、包被有檢測線和對照線的硝酸纖維素膜、和吸水濾紙組裝到聚乙烯板上得到犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條。
5.根據權利要求4所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)抗犬細小病毒單克隆抗體的制備:選8~10周齡體重20g以上的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔分別注射抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株Fl和B6，接種量為2 X IO6~4 X IO6細胞/0.5mL/只，經過一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000rpm離心15min，取上清備用；將腹水用50%飽和度的硫酸銨鹽析2次，透析除鹽即得純化的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和抗犬細小病毒單克隆抗體B6 ； (2)膠體金標記抗犬細小病毒單克隆抗體Fl的方法:分別取半徑為5~40nm的膠體金20mL及抗犬細小病毒單克隆抗體Fl 50~200 μ g，在pH 8.0~9.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加PEG-20000作為穩定劑，且使得PEG-20000最終質量濃度為10~20%，采用離心法除去未結合的抗犬細小病毒單克隆抗體Fl和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-Fl復合物； (3)將膠體金-Fl復合物噴涂于聚酯膜上:用20mL聚乙二醇洗滌膠體金-Fl復合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2mL濃度為2mmol/L、pH 6.0~8.0的硼酸緩沖液溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上15μ L/cm，凍干； (4)硝酸纖維素膜的包被:檢測線包被的是抗犬細小病毒單克隆抗體B6，包被量為.0.1~10 μ g/cm,對照線包被的是羊抗小鼠IgG,包被量為0.1~10 μ g/cm,每條線寬2~.5mm ； (5)試紙條制備:將玻璃纖維膜、包被膠體金-Fl復合物的聚酯膜、包被檢測線和對照線的硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次粘附于聚乙烯板上，將組裝好的試紙條縱向切成4mm的條狀即為犬細小病毒膠體金免疫層析試紙條。
6.權利要求1-3任一項所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的使用方法，其特征在于包括如下步驟:檢測時，用無菌棉簽沾取待檢動物的糞便樣品，在PBS緩沖液中混勻，待大顆粒沉于管底后，取上清滴在該試紙條樣品吸收區，5~10分鐘后判讀結果，對比檢測線和對照線的顏色，即可 判定被檢動物體內是否帶有犬細小病毒或感染犬細小病毒。
【文檔編號】G01N33/577GK103604924SQ201310600672
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月22日 優先權日:2013年11月22日
【發明者】劉潔, 牟林琳, 廖園園, 何文輝, 王威, 漆世華, 朱薇, 溫文生, 謝紅玲, 馮釗 申請人:武漢中博生物股份有限公司