基于量子點的赭曲霉毒素A的sFLISA快速檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于量子點的赭曲霉毒素A的sFLISA（sandwich?fluorescence-linked?immunosorbent?assay）快速檢測方法和檢測試劑盒；方法包括下列步驟：首先用2.5μg/mL的抗OTA多克隆抗體100μL包被酶標板（黑色底透）；用1×PBST200μL洗滌后，用1×BSA?PBS封閉酶標板；用1×PBST200μL洗滌后，加入被檢測抗原樣品溶液100μL；用1×PBST200μL洗滌后，加入生物素標記的抗OTA單克隆抗體100μL；用1×PBST200μL洗滌后，加入100μL1:100稀釋的量子點標記的鏈霉親和素；用1×PBST200μL洗滌甩干后，用熒光分光光度計（390nm激發波長，605nm發射波長），測定相對熒光強度（RFU），根據樣品的RFU代入標準曲線，得出樣品的OTA含量。本發明所建立基于量子點的赭曲霉毒素AsFLISA快速檢測方法，具有準確、快速、熒光穩定性好、靈敏、特異性高的特點。
【專利說明】基于量子點的赫曲霉毒素A的sFL ISA快速檢測方法和試劑
合
Sl
[0001]【技術領域】:
本發明屬于食品安全檢測【技術領域】的方法，涉及基于量子點標記技術的赭曲霉毒素A的sFLISA檢測方法。
[0002]【背景技術】:
赭曲霉毒素(OA)是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產生的次級代謝有毒產物，屬烈性的肝臟和腎臟毒素，并具有致癌、致畸和致突變性。OA廣泛存在于各種食物中，花生、谷物及其副產品是OA的主要來源；此外，在可可、咖啡、肉類、乳汁、干果、調味品、酒類中也存在0A。這類毒素包括7種結構類似的化合物，其中毒性最大、分布最廣泛、對農作物污染最嚴重、與人類健康關系最為密切的是赭曲霉毒素A (ochratoxin, OTA), OTA被證實有致癌、致畸、致突變的作用，還具有免疫抑制性，國際癌癥研究機構LARC將OTA定位為2B類致癌物(SP可能引起人類癌癥的物質)。
[0003]OTA的產毒菌株廣泛地存在于自然界中，且能經食物鏈進入人體，在谷類和人血清等樣品中都檢出過OTA殘留，嚴重危害人類的健康。由于OTA的危害性，各國都立法對食品中OTA的殘留進行限定。至今已有多個國家制定了食品(I?50 ii g/kg)和動物飼料(100?IOOOil g/kg)的OA限量標準。因此，研究靈敏度高、檢測限低的快速檢測方法顯得尤為重要。
[0004]目前對赭曲霉毒素A的檢測方法有免疫親和柱-高效液相色譜法(IAC-HPLC)、時間分辨熒光免疫法(TRFIA)、酶聯免疫法(ELISA)、免疫親和柱-熒光光度法等。傳統的檢測方法存在樣品前處理過程中使用多種有毒、異味有機溶劑，毒害操作人員和污染環境；試劑昂貴，成本高；檢測結果重現性差，存在交叉反應而易造成假陽性等缺點。
[0005]量子點(QDs)，又稱無機半導體納米晶體，是一類由II 一 VI族(如CdSe、CdTe,CdS、ZnSe等)或III 一 V族(如InP、InAs等)元素組成的納米顆粒,是近年發展起來的一種新型熒光納米材料。與傳統有機熒光染料相比，具有很多優良的熒光性能，吸收光譜寬、發射光譜窄而對稱，斯托克斯位移(Stoke’s shift)大及較高的突光穩定性和較長的衰減壽命。現在，量子點作為一種新型的熒光標記材料和重要的納米材料之一，經常被用作生物標記及成像過程中的光學探針，在生物領域中的應用越來越受到關泛關注，特別是在臨床診斷方法取得了長足的進展。
[0006]本發明利用多克隆抗體的強富集能力，通過量子點標記的鏈霉親和素與生物素標記的OTA檢測抗體相互作用的級聯放大效應(親和素與生物素互作效應)，巧妙設計了 一種靈敏度高、特異性強的赭曲霉毒素A三明治夾心熒光免疫檢測(s an dw i c hfluorescence-linked immunosorbent assay, sFLISA)方法,為赫曲霉毒素 A 在食品安全等應用領域提供技術基礎和參考依據。
[0007]
【發明內容】
:
本發明所要解決的技術問題是提供一種赭曲霉毒素A的基于量子點標記技術的sFLISA定量檢測方法，即通過量子點熒光標記的鏈霉親和素-生物素之間的級聯放大效應，能靈敏特異地進行赭曲霉毒素A的定量檢測，以克服現有檢測技術的不足。
[0008]為解決上述技術問題，本發明利用量子點多波長激發、高強度熒光發射、發射峰窄、峰形對稱、發光穩定性好的熒光特性，提供了一種基于量子點標記的赭曲霉毒素A的檢測方法，對被測物進行定量檢測；主要原理是利用多克隆抗體的強富集能力，通過量子點標記的鏈霉親和素與生物素標記的OTA檢測抗體相互作用的級聯放大效應(親和素與生物素互作效應)，設計了一種靈敏度高、特異性強的赭曲霉毒素A的sFLISA定量檢測方法。
[0009]一種基于量子點的赭曲霉毒素A sFLISA快速檢測方法，具體包括下列步驟:
具體包括下列步驟:
(一)兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液將兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體稀釋成濃度為2.5 u g/mL包被酶標板，每孔100 U L。42°C孵育0.5 h，倒去包被液，用I XPBST洗滌3次，3min/次,甩干。
[0010](二)封閉
用IX BSA-PBS溶液封閉板上的空白位點，每孔200 iiL，37°C孵育2 h，倒去封閉液，用I XPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0011](三)加待檢樣品
各孔加倍比稀釋的標準品或待測樣品各100 u L，陰性對照孔加100 i! L的IX BSA-PBS,37°C孵育I h，用IXPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0012](四)加生物素標記的鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體
除試劑空白孔外，其余各孔加生物素化抗體IOOiiL，37°C孵育I h，用IXPBST洗滌3次，3min/次,甩干。
[0013](五)加量子點標記的鏈霉未和素
所有各孔加100 UL用TB S緩沖液稀釋的適合稀釋倍數的量子點標記的鏈霉親和素，37°C孵育I h，用IXPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0014](六)相對熒光強度檢測
在多功能熒光酶標儀上以390nm為激發波長，605nm為發射波長，選擇底讀模式，測量相對突光強度(RFU, relative fluorescence units),減去試劑空白孔的相對突光強度,得到相對熒光強度值。
[0015](七)建立標準曲線
根據赭曲霉毒素A濃度和相應的相對熒光強度建立了標準曲線，在0.39 Ug/L~125 Ug/L之間，赭曲霉毒素A濃度與相對熒光強度呈線性關系，線性回歸方程為y=0.0207x+0.196 (線性相關系數R2=0.9938，y為相對熒光強度，x為赭曲霉毒素A的濃度(u g/L));根據標準曲線回歸方程可計算出樣品的赭曲霉毒素A的濃度。
[0016]本發明所建立基于量子點的赭曲霉毒素A sFLISA快速檢測方法，能夠快速地對赭曲霉毒素A進行定量檢測，加標回收試驗結果表明，加標回收率范圍在90.1%~110%之間，變異系數均小于10%。具有較高的特異性；該方法具有快速、穩定性好、靈敏、特異高的特點，具有很好的推廣應用價值。
[0017]本發明還提供了一種基于量子點的赭曲霉毒素A的sFLISA檢測試劑盒，包括:
(I)酶標板I塊:包括12條,每條含有8個小孔,每個孔中均包被有兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體；
(2)稀釋板I塊:沒有包被的12條8孔板；
(3)6瓶赭曲霉毒素A標準品濃度分別為:0,0.39,0.79,1.56,3.125,6.25,12.5、25、50、125 u g/L，每瓶 1.5 mL ;
(4)生物素標記的赭曲霉毒素A抗體:10mL ；
(5)量子點標記的鏈霉未和素:10mL。
[0018]發明所建立的基于量子點的赭曲霉毒素A sFLISA快速檢測方法，具有準確、快速、熒光穩定性好、靈敏、特異性高的特點。
[0019]附圖或附表說明:
圖1為本發明實施例1，基于量子點的赭曲霉毒素A sFLISA快速檢測方法建立的標準曲線，圖中，橫坐標為赭曲霉毒素A的濃度(y g/L)，縱坐標為相對熒光強度(RFU)。
[0020]圖2為實施例4中樣品應用HPLC的檢測圖譜。
[0021]【具體實施方式】:
下面通過具體實施例并結合附圖或附表進一步闡述本發明。
[0022]實施例1:基于量子點的赭曲霉毒素A sFLISA快速檢測方法建立的標準曲線
(一)兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液將兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體稀釋成濃度為2.5 u g/mL包被酶標板，每孔100 U L。42°C孵育0.5 h，倒去包被液，用I XPBST洗滌3次，3min/次,甩干。
[0023](二)封閉
用IX BSA-PBS溶液封閉板上的空白位點，每孔200 iiL，37°C孵育2 h，倒去封閉液，用I XPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0024](三)加待檢樣品
各孔分別加一定稀釋倍數的標準品:0.39,0.79、1.56,3.125,6.25、12.5、25、50、125、250,500 u g/L IOOii L，陰性對照孔加 IOOiiL 的 IX BSA-PBS，37°C 孵育 I h,用 IXPBST 洗漆3次，3min/次,甩干。
[0025](四)加生物素標記的鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體
除試劑空白孔外，其余各孔加生物素標記的鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體IOOiiL，37°C孵育I h，用IXPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0026](五)加量子點標記的鏈霉未和素
所有各孔加100 UL用TBS緩沖液稀釋的適合稀釋倍數的量子點標記的鏈霉親和素，37°C孵育I h，用IXPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0027](六)相對熒光強度檢測
在多功能熒光酶標儀上以390nm為激發波長，605nm為發射波長，選擇底讀模式，測量相對突光強度(RFU, relative fluorescence units),減去試劑空白孔的相對突光強度,得到相對熒光強度值。
[0028](七)建立標準曲線
在0.39 yg/L?125 U g/L之間，赭曲霉毒素A濃度與相對熒光強度呈線性關系，推導出線性回歸方程為y=0.0207x+0.196 (線性相關系數R2=0.9938，y為相對熒光強度，x為赭曲霉毒素A的濃度(ii g/L))。在此濃度范圍內，赭曲霉毒素A濃度可進行定量分析。
[0029]實施例2:基于量子點的赭曲霉毒素A sFLISA快速檢測方法的重現性試驗 (一)兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體的包被
用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液將兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體稀釋成濃度為2.5 u g/mL包被酶標板，每孔100 U L。42°C孵育0.5 h，倒去包被液，用I XPBST洗滌3次，3min/次,甩干。
[0030](二)封閉
用IX BSA-PBS溶液封閉板上的空白位點，每孔200 iiL，37°C孵育2 h，倒去封閉液，用I XPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0031](三)加待檢樣品
各孔分別加一定稀釋倍數的標準品:6.25、25、50i!g/L 100 y L，平行重復3次，陰性對照孔加IOOuL的IX BSA-PBS，37°C孵育I h，用I XPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0032](四)加生物素標記的鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體
除試劑空白孔外，其余各孔加生物素標記的鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體IOOiiL，37°C孵育I h，用IXPBST 洗滌3次，3min/次，甩干。
[0033](五)加量子點標記的鏈霉未和素
所有各孔加100 UL用TBS緩沖液稀釋的適合稀釋倍數的量子點標記的鏈霉親和素，37°C孵育I h，用IXPBST洗滌3次，3min/次，甩干。
[0034](六)相對熒光強度檢測
在多功能熒光酶標儀上以390nm為激發波長，605nm為發射波長，選擇底讀模式，測量相對突光強度(RFU, relative fluorescence units),減去試劑空白孔的相對突光強度,得到相對熒光強度值。
[0035](七)根據標準曲線計算赭曲霉毒素A含量
選擇3個OTA濃度(6.25,25和50 u g/L)，每個濃度反復測定4次。計算相對標準差分別為5.63%、2.77%、5.65%，平均相對標準差為4.68% ;回收率分別為109.5%、100.6%,95.9%,平均回收率為102.0%，具有良好的重現性，具體結果見表1。
[0036]表1方法重現性試驗結果
【權利要求】
1.一種基于量子點的赭曲霉毒素A的sFLISA快速檢測方法，其特征在于:兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體作為捕獲抗體，生物素標記的鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體作為檢測抗體，量子點標記的鏈霉親和素作為熒光探針，通過親和素-生物素之間的級聯放大效應，能靈敏特異地進行赭曲霉毒素A的定量檢測，與黃曲霉毒素BI等無交叉反應； 具體包括下列步驟: (一)兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體的包被 用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液將兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體稀釋成濃度為.2.5ug/mL包被酶標板，每孔100uL，42°C孵育0.5 h，倒去包被液，用1XPBST洗滌3次，.3min/次,甩干； (二)封閉 用1X BSA-PBS溶液封閉板上的空白位點，每孔200 uL，37°C孵育2 h，倒去封閉液，用.1XPBST洗滌3次，3min/次，甩干； (三)加待檢樣品 相應孔加一定稀釋倍數的標準品或待測樣品100 yL，陰性對照孔加1OOuL的1XBSA-PBS，37°C孵育 1 h，用 1XPBST 洗滌 3 次，3min/次，甩干; (四)加生物素標記的鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體 除試劑空白孔外，其余各孔加生物素化抗體100 uL，37°C孵育1 h，用IXPBST洗滌.3次,3 min/次,甩干； (五)加量子點標記的鏈霉未和素 所有相應孔加100 u L用TBS緩沖液1:100稀釋的量子點標記的鏈霉親和素，37°C孵育1 h，用1XPBST洗滌3次，3min/次，甩干； (六)相對熒光強度檢測 在多功能熒光酶標儀上以390nm為激發波長，605nm為發射波長，選擇底讀模式，測量相對突光強度(RFU, relative fluorescence units),減去試劑空白孔的相對突光強度,得到相對熒光強度值； (七)建立標準曲線并計算待測樣品中的赭曲霉毒素A的濃度 根據赭曲霉毒素A濃度和相應的相對熒光強度建立了標準曲線，在0.39 ug/L~125 ug/L之間，赭曲霉毒素A濃度與相對熒光強度呈線性關系，線性回歸方程為y=0.0207x+0.196 (線性相關系數R2=0.9938，y為相對熒光強度，x為赭曲霉毒素A的濃度(u g/L)) ;根據標準曲線回歸方程可計算出樣品的赭曲霉毒素A的濃度。
2.一種基于量子點的赭曲霉毒素A的sFLISA檢測試劑盒，包括: (1)酶標板1塊:包括12條,每條含有8個小孔,每個孔中均包被有兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗體； (2)稀釋板1塊:沒有包被的12條8孔板； (3)6瓶赭曲霉毒素A標準品濃度分別為:0,0.39,0.79,1.56,3.125,6.25,12.5、25、.50、125 u g/L，每瓶 1.5 mL ; (4)生物素標記的鼠抗赭曲霉毒素A單克隆抗體:10mL ； (5)量子點標記的鏈霉未和素:10mL。
【文檔編號】G01N33/558GK103616508SQ201310597843
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月25日 優先權日:2013年11月25日
【發明者】房保海, 梁旭鋒, 賈俊濤, 姜英輝, 李正義, 于立欣, 房倩 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心