一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀的制作方法

一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，由適配體傳感器，信號檢測與處理系統，顯示與打印存儲系統，供電系統組成。用殼聚糖、戊二醛與鐵氰化鉀復合物修飾的工作電極，再用納米金膠將適配體固定到電極表面，制備適配體傳感器。檢測適配體傳感器接觸抗生素前后電流的變化來測定抗生素的濃度。信號處理電路將采集的微弱電流信號進行I/V轉換，放大，濾波，A/D轉換最終將數字量信號送入微控制器進行程序處理；該檢測儀可對檢測樣品中的抗生素殘留量是否超標及濃度值進行顯示、存儲和打印。本發明的適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀可準確快速的檢測樣品中是否含有某種抗生素等信息，非常適合對抗生素殘留進行現場快速檢測的場合。
【專利說明】一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗生素殘留快速檢測儀，尤其涉及一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，屬于農產品安全檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著我國畜牧養殖業的迅速發展，奶產量大幅度提高，新鮮牛奶和奶制品已經成為人民(尤其是老人和兒童)生活食品中的重要組成部分。然而，抗生素在現代畜牧業中的廣泛應用，不可避免地造成牛奶中抗生素殘留。若長期飲用含有抗生素的牛奶，無疑是等于長期服用小劑量的抗生素，對抗生素過敏體質的人服用殘留抗生素的牛奶后可引發過敏反應。正常飲用者，會導致體內的某些條件性致病菌易產生耐藥性，一旦患病再用同種抗生素治療很難奏效。抗生素殘留不僅危害人類健康，同時也影響牛奶的品質，造成經濟損失。由于奶牛乳腺炎發病率較高，用抗生素來治療乳腺炎等產科疾病仍較普遍，這容易導致在牛奶中四環素的殘留。過量使用抗生素不可避免會使母體代謝產物等相關抗生素殘留于動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中，進而通過食物鏈影響人體健康。可見，加強對牛奶等農產品中抗生素殘留的檢測，尤其是保障人類健康有著十分深遠的意義。
[0003]傳統的抗生素殘留檢測方法主要有:氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質譜聯用技術(GC/LC-MS)、毛細管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯免疫法(ELISA)。這些方法雖然選擇性好、靈敏度高、準確度高、檢出限低，可同時檢測多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設備，樣品前處理過程繁瑣、費時，并且對分析人員的技術水平要求很高，不適于現場快速檢測。與傳統的分析方法相比，生物傳感器具有如下特點:(1)較高的選擇性，因此不需要對被測組分進行分離，即不用對樣品進行預處理。(2)結構簡單，體積小，使用方便，特別是便攜式的免疫傳感器，非常有利于農產品安全質量的快速測定。(3)可實現連續在線檢測，使食品加工過程的質量控制變得簡便。(4)響應速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，免疫傳感器制作成本低，且可反復使用。
[0004]發明的目的在于針對現有技術的不足，設計提供一種適配體傳感器抗生素殘留檢測儀，具有攜帶方便、檢測快速準確、操作簡單、可實現抗生素殘留的在線定性定量測量等特點。
[0005]本發明一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀的基本原理是:三電極系統將適配體傳感器接觸抗生素前后由于免疫反應而導致微弱電流信號的變化通過檢測電路對信號進行采集。檢測電路將采集而來的微弱電流信號進行Ι/ν轉換，放大，濾波，A/D轉換最終將數字量信號送入單片機進行程序處理。最后，顯示與打印存儲系統將抗生素殘留的濃度、抑制度等參數顯示出來，并將數據存儲下來以便用戶及時查看和進行數據分析。本發明的檢測儀內含微型打印機，可以將數據進行相應的打印輸出。信號檢測與處理系統內部的單片機對顯示與打印存儲系統統一進行編程控制。
[0006]為實現以上功能，本發明的一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀的適配體傳感器的制備方法為:(I)殼聚糖、戊二醛與鐵氰化鉀復合物的制備:首先配置1% (I ml/100ml water)的醋酸溶液并用配好的醋酸溶液作為溶劑制備50 ml 1% (I g/100 ml)的殼聚糖溶液。把500 μ I的5 mM的Κ3 [Fe (CN) 6]與I mL的殼聚糖溶液(400 μ I 1%殼聚糖+ 600 μ I水)混勻超聲震蕩5分鐘得到清澈的黃色溶液。向上訴溶液中加入100μ I 5%的戊二醛在超聲10分鐘后靜置24h，殼聚糖、戊二醛與鐵氰化鉀復合物制備完成。
(2)納米金膠的制備采用檸檬酸三鈉熱還原氯金酸(HAuC14)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡，洗滌干凈備用。配置100 mL 0.01%的氯金酸溶液，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入2.5 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，繼續攪拌20min (此間溶液由淡黃色轉為無色，然后變灰黑色，最后成酒紅色)，除去熱源后繼續攪拌至室溫下慢慢冷卻。將冷卻后的金膠溶液置于干凈的棕色玻璃瓶中于4° C冰箱中避光保存備用，數月有效。(3)取5yL制備好的殼聚糖、戊二醛與鐵氰化鉀的復合物滴涂在預處理好的玻碳電極表面，常溫干燥，用PH7.5的磷酸銀緩沖液沖洗電極表面。(4)電極表面晾干后，取5μ L納米金膠滴涂在電極表面，常溫下靜置至干燥，然后用超純水沖洗表面物理吸附的納米金，氮氣吹干。(8)然后將5 yL 5mM的適配體滴在上述經納米材料修飾好的電極上，用橡膠帽蓋住防止水分的蒸發，4h后用超純水沖洗表面，晾干待用。(9)最后上述制備好的電極浸于用IM的巰基乙醇封閉lh，以封閉非特異性結合位點，適配體傳感器制作完成，保存在4° C條件下備用。
[0007]所述的一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，其特征在于:三電極系統電路由三電極適配體傳感器，三電極檢測電路，恒電位電路組成；三電極免疫傳感器采集電流信號由三電極檢測電路傳向信號檢測與處理系統電路。恒電位電路向反應溶液環境提供5OOmV的穩定電壓。
[0008]信號檢測與處理系統電路具有I/V轉換，放大，濾波功能，內含A/D轉換芯片將經過Ι/v轉換之后酶傳感器采集的模擬量信號轉換成數字量信號送入單片機進行程序處理。信號檢測與處理系統的單片機微控制器為STC89C52。單片機的檢測程序包含數據打印與存儲，時間顯示，使用說明和對重要步驟提示的對話框，幫助用戶快速掌握儀器的使用方法以及進行數據打印和存儲方便以后進行數據的檢查和處理。信號檢測與處理系統電路采用TLC272CP芯片多路運放電路具有I/V轉換，放大，濾波并向三電極反應環境提供500mv恒定電壓的功能。
[0009]顯示與打印存儲系統電路由顯示器電路，打印電路和存儲器電路組成。顯示器用于顯示數據通過操作按鍵進行控制作為用戶進行控制的界面。打印存儲系統電路分別與微型打印機以及存儲器相連進行數據打印和存儲。顯示屏采用了一般的3.5寸的顯示屏，微型打印機采用微型嵌入式打印機，其尺寸和功耗滿足方便攜帶和便攜式的功耗要求。
[0010]為達到以上目的，采取以下技術方案實現:供電系統電路由開關電源和電壓轉換電路組成，開關電源將交流電轉換成直流電經過電壓轉換電路分別向各系統電路和微型打印機供電。開關電源為+12V,1A,-12V,1A,+5V,5A三路輸出。電源與供電系統中的開關電源相連。
[0011]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發明一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀的結構框圖，
圖2為本發明三電極與恒電位電路及A/D轉換前期處理電路。
【具體實施方式】[0012]首先，對本發明的結構示意框圖加以說明；其次，對信號檢測及處理系統所包括的恒電位電路、A/D轉換前期處理電路加以詳細說明；最后，對整個系統的應用軟件及檢測流程加以說明。
圖1為本發明一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀的結構框圖。如圖1所示，本發明由三電極系統，信號檢測與處理系統，顯示與打印存儲系統，供電系統組成。三電極系統通過免疫傳感器采集反應溶液中的微弱電流信號；信號檢測與處理系統將三電極采集而來的微弱電流信號進行ΙΛ轉換，放大，濾波，A/D轉換最終將數字量信號送入單片機進行程序處理；顯示與打印存儲系統將殘留的抗生素濃度、抑制度等參數顯示出來，并將數據存儲下來以便用戶及時查看和進行數據分析。本發明的檢測儀內含微型打印機，可以將數據進行相應的打印輸出。信號檢測與處理系統內部的單片機對顯示與打印存儲系統統一進行編程控制。供電系統將交流電轉換成三路直流電為各系統電路以及微型打印機供電。所述的微控制器采用內核為MCS-51的STC89C52RC+微控制器，其上加載檢測程序。
[0013]本發明中，檢測電路中的恒電位電路為三電極系統電流/電壓轉化檢測電路提供穩定的工作電壓，圖2為恒電位儀電路的一個實施例，由一個雙路運算放大器UlOTLC272CP和R44, R46, R4, C35, C16, R48構成。運放B的引腳6和7相連與A的3腳相連，A的2腳與三電極體系的工作電極相連并連上了 C16，增強抗干擾能力，R48是做為反饋電阻在放大器A上，B的5管腳外接一個電位器R46，由正5V供電激勵，R44，R46, R4通過電壓分壓供給500mv電壓給與B的5管腳形成恒電位電路，初始電壓為500mv.運放A和的引腳8接+5V電源，引腳4接-5V，U9 TLC272CP的運放B引腳7與引腳6直接相連作為電壓跟隨器，ADE引腳3與B的引腳5相連接，共同接地，起到抗干擾的作用。A的引腳2直接與三電極體系的參比電極相連接，引腳I直接與三電極體系的輔助電極相連接，之間連接電容14，目的是起隔離電路的作用，同時能提高帶負載的能力，因此U9和UlO共同構成了生物傳感器的三電極體系，所用檢測端由這里引出，采集與檢測電化學反應產生的微弱電流信號。
[0014]本發明的一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀的適配體傳感器制備方法為:
(I)殼聚糖、戊二醛與鐵氰化鉀復合物的制備:首先配置1% (I ml/100 ml water)的醋酸溶液并用配好的醋酸溶液作為溶劑制備50 ml 1% (I g/100 ml)的殼聚糖溶液。把500μ I的5 mM的Κ3 [Fe (CN) 6]與I mL的殼聚糖溶液(400 μ I 1%殼聚糖+ 600 μ I水)混勻超聲震蕩5分鐘得到清澈的黃色溶液。向上訴溶液中加入100 μ I 5%的戊二醛在超聲10分鐘后靜置24h，殼聚糖、戊二醛與鐵氰化鉀復合物制備完成。(2)納米金膠的制備米用朽1檬酸三鈉熱還原氯金酸(HAuC14)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡，洗漆干凈備用。配置100 mL 0.01%的氯金酸溶液，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入2.5 mL1%檸檬酸三鈉溶液，繼續攪拌20min(此間溶液由淡黃色轉為無色，然后變灰黑色，最后成酒紅色)，除去熱源后繼續攪拌至室溫下慢慢冷卻。將冷卻后的金膠溶液置于干凈的棕色玻璃瓶中于4° C冰箱中避光保存備用，數月有效。(3)取5μ L制備好的殼聚糖、戊二醛與鐵氰化鉀的復合物滴涂在預處理好的玻碳電極表面，常溫干燥，用ΡΗ7.5的磷酸銀緩沖液沖洗電極表面。(4)電極表面晾干后，取5yL納米金膠滴涂在電極表面，常溫下靜置至干燥，然后用超純水沖洗表面物理吸附的納米金，氮氣吹干。(8)然后將5 yL5mM的適配體滴在上述經納米材料修飾好的電極上，用橡膠帽蓋住防止水分的蒸發，4h后用超純水沖洗表面，晾干待用。(9)最后上述制備好的電極浸于用IM的巰基乙醇封閉lh，以封閉非特異性結合位點，適配體傳感器制作完成，保存在4° C條件下備用。
[0015]本發明的檢測流程是:首先，將制備好的適配體傳感器放入不含抗生素的測試底液中，測得不含抗生素時的電流I1，即抑制前電流(抑制前電流也可以采用系統中設定的默認值)；之后將適配體傳感器去除，用蒸餾水沖洗后，將適配體傳感器工作電極放入待檢測樣品液孵育10分鐘，再次將適配體傳感器放入測試底液中，測得抑制后的電流I2 ;最后通過微控制器上運行的檢測程序自動計算出抑制率(1%)，計算公式如下:

I%=( I1-12)/ I1 X 100%
通常如果檢測樣品液中含有抗生素，由于適配體與抗生素發生免疫反應產生免疫復合物阻礙了測試液與電極之間的電子轉移，電流I2小于I115 I1與I2的差值愈大則抑制率愈大，表明檢測樣品液中抗生素殘留的濃度愈高；I1與I2的差值愈小則抑制率愈小，表明檢測樣品液中抗生素殘留的濃度愈低。
[0016]目前認為當抑制率大于、等于50%時，抗生素殘留超標；當抑制率小于50%時，抗生素殘留未超標。
[0017]微控制器根據得到的抑制率做出定性結論，將結果送到顯示屏顯示，并將最后結果打印輸出，數據同時一并進行存儲供相關人員以后的查找和研究。
[0018]本發明微控制器上運行的檢測程序還包含屏幕跳轉演示和對重要步驟提示的對話框、打印提示，可以幫助用戶快速掌握儀器的使用方法。
[0019]檢測程序的實施例:首先，將免疫傳感器放入底物溶液中進行檢測準備。然后，按下儀器開關鍵，系統初始化后進入首頁，顯示屏旁邊有檢測按鈕、復位和打印三個播磨按鍵。第一次點擊檢測按鈕，開始檢測并顯示讀數I1;第二次點擊檢測之后，觀察提示，顯示結果I2 ;點擊打印，打印結果并保存。打開電源鍵，屏幕顯示“START檢測”，清零。將鱷魚夾分別加緊三電極系統對應的三個柱狀電極，將固定抗體的免疫傳感器浸入到之前準備的磷酸鹽緩沖溶液中按下檢測鍵，屏幕顯示開始檢測，約1min后，基線達到穩定水平，約30s后，得到第一個完整的電流數據，記為I1。待測樣品測試:將免疫傳感器放入提取好的樣品溶液中，約lOmin，之后再將其浸入定量磷酸鹽緩沖溶液中，按測量鍵，點擊檢測鍵第二次測量，同時顯示第二個電流數據I2。通過兩個電流數據自動計算該樣品液對固定化酶的活性抑制率。選擇適當的關系曲線計算提取液的目標抗生素濃度，并折算成樣品中目標抗生素的含量，最后自動生成測定結果報告。按下打印鍵，將印有前后兩次檢測電壓、抗生素抑制率以及抗生素檢測濃度的數據進行打印輸出。
[0020]本發明的一種是適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，操作工藝簡單，檢測時間較短，可實現抗生素殘留的定性定量測量，具有靈敏度高，穩定性好、重現性好等優點，符合我國抗生素殘留快速檢測技術發展和國際化要求。
【權利要求】
1.一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，其特征在于:該檢測儀由三電極適配體傳感器，信號檢測與處理電路，顯示與打印存儲電路，恒電位供電電路，操作按鍵，數據存儲器，微型打印機，電源構成；免疫傳感器產生的電流信號由檢測電路傳向信號檢測與處理系統電路；恒電位電路向工作電極與參比電極之間提供500mV的穩定工作電壓；所述的信號檢測與處理電路具有I/V轉換，放大，濾波功能，內含A/D轉換芯片將適配體傳感器采集的模擬量信號轉換成數字量信號送入單片機進行程序處理；所述的免疫傳感器使用納米材料修飾工作電極后，將特定的抗生素適配體固定到電極表面，可特定性的測量樣品液中是否含有某種抗生素。
2.如權利要求1所述的一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，其特征在于所述的信號檢測與處理系統的單片機微控制器為STC89C52。
3.如權利要求1所述的一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，其特征在于該檢測儀使用的是免疫傳感器，在適配體傳感器工作電極表面固定了特定的抗生素適配體，因此該檢測儀可實現特定性的測定樣品中是否含有某種抗生素，實現樣品的抗生素殘留定性定量測量。
4.如權利要求1所述的一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，其特征在于所述的信號檢測與處理系統電路采用TLC272CP芯片多路運放電路具有I/V轉換，放大，濾波并向三電極反應環境提供500mv恒定電壓的功能。
5.如權利要求1所述的一種適配體傳感器抗生素殘留快速檢測儀，其特征在于用殼聚糖、戊二醛與鐵氰化鉀復合物修飾的工作電極，再用納米金膠將適配體固定到電極表面，制備了適配體傳感器。
【文檔編號】G01N27/327GK103558272SQ201310576568
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】郭業民, 王相友, 孫霞, 劉君峰, 趙國 申請人:山東理工大學