全血的標記免疫分析方法和即時檢測系統的制作方法
【專利摘要】本發明具體涉及從全血中通過特異性結合反應快速采集目標物并通過標記技術對目標物進行標記和監測的全血的標記免疫分析方法，以及一種即時檢測系統。所述方法包括以下步驟：1）磁珠捕獲；2）血液洗脫；3）檢測抗體的標記；4）檢測抗體的洗脫；和5）檢測。所述系統包括微流控芯片、設置在微流控芯片上下一方或兩方的磁場產生裝置以及檢測裝置，所述微流控芯片包括微通道、設置在微通道內的磁珠、廢液出口和洗脫液貯液池，所述微通道通過隔斷機構階段性隔離為第一反應區域、第二反應區域和檢測區。本發明提供的技術方案具有靈敏度高、重復性好、系統結構簡單、成本低等特點，可以快速的從微量血液樣本中定量檢測出目標物。
【專利說明】全血的標記免疫分析方法和即時檢測系統【技術領域】
[0001]本發明屬于快速標記免疫分析技術，具體涉及從全血中通過特異性結合反應快速采集目標物并通過標記技術對目標物進行標記和監測的方法，以及ー種即時檢測系統。
【背景技術】
[0002]標記免疫技術具有選擇性高、靈敏度高、普適性好等優點，主要包括放射免疫技術、酶免疫技術、熒光免疫技術、化學發光免疫技木，采用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體(或抗原)進行抗原-抗體反應，通過對免疫復合物中的標記物的測定，達到對免疫反應進行監測的目的。[0003]即時檢測(Point-of-care testing, P0CT)是指在采樣現場即刻進行分析,省去標本在實驗室檢驗時的復雜處理程序，快速得到檢驗結果的ー類方法。POCT中免疫分析方法目前已廣泛用于醫療衛生、環境監測、反恐等領域的快速檢測，POCT檢測常用的對象是全血樣本，并且樣品量極少，其較常用的方法是通過毛細管作用驅動血液透過多孔膜實現血細胞與血漿的分離，分離得到的血漿進一歩在毛細管作用下進入反應裝置，完成免疫檢測。
[0004]按照慣例，血漿可以通過離心法從全血中分離出來，但離心法很耗時，需要特種設備，不適合用于即時測試中。為了避免這個問題，一般采用具有微孔濾質的機械式過濾器分離血漿和紅細胞，文獻CNl01918137A中公開了ー種類似的采用過濾材料的分離裝置，但由于微孔阻塞的問題，該分離方法會造成檢測樣品的損失，因此對于只有極少量樣品的POCT并不適用。
[0005]POCT裝置由于受到小體積、低成本和使用便捷等要求的限制，在極少的樣品量的情況下，無法準確控制檢測過程和剔除背景干擾，檢測的可靠性與精度大大降低。例如，在用吸收膜做為樣品和反應試劑載體的方法中難以準確控制控制反應試劑進入檢測裝置的流速以及在各個特定反應腔中停留的時間，并且常缺乏充分的洗脫以消除非特異性吸附造成的背景干擾。在基于微流控芯片的檢測中，為了充分洗脫、準確控制樣品及反應試劑的流速和反應時間常需要復雜的閥控結構，増加了裝置的體積、成本和復雜度，同時降低了檢測系統的可靠性。
[0006]因此只有中心實驗室的大型儀器才具有高靈敏度、高重復性以及準確定量的能力，可以獲得準確的實驗數據，但其與快速檢測方法相比，設備體積大，成本高，檢測時間長。
[0007]超順磁性納米微球(superparamagneticsnano spheres/particles/beads)簡稱磁珠，是由Senyei A E在1978年首先研制出來的ー種新型的功能性材料。它的內部是ー個磁核，因而在外部磁場的作用下，微球可以定向移動；而微球外部是ー層包覆層，表面分布著許多活性基團，可以和細胞、蛋白質、核酸、酶等生化試劑發生偶聯。用于生化分析的磁珠具有以下特點:1)超強的順磁性，就是指在磁場的存在下能迅速聚集，離開磁場能夠均勻分散，不出現聚集顯現現象，文獻CN102333595A中即公開一種使多個順磁顆粒在小體積液體中團聚井隨后均勻分布的方法；2)合適的粒徑且粒徑分布范圍窄，使微球有足夠強的磁響應性，又不會因粒徑太大而發生沉降；3)具有豐富的表面活性基團，以便微球可以和生化物質偶聯，并在外磁場的作用下實現與被待測樣品的分離。
【發明內容】
[0008]本發明所要解決的技術問題是目前的即時檢索方法靈敏度、穩定性和可重復性低，為了克服以上不足，提供了一種全血的快速免疫分析方法和即時檢測系統。
[0009]為了解決上述技術問題，本發明的技術方案是:所述全血的快速標記免疫分析方法，包括以下步驟:
[0010]I)磁珠捕獲:抗凝劑處理的全血樣本與負載捕獲抗體的磁珠在第一反應區域混合，所述捕獲抗體與全血樣本中待測抗原結合形成ー抗免疫復合物；
[0011]2)血液洗脫:施加磁場將ー抗免疫復合物聚集、洗脫液替換掉流體；
[0012]3)檢測抗體的標記:施加磁場將磁珠轉移至第二反應區域，采用標記免疫技術，檢測抗體與ー抗免疫復合物的待測抗原反應形成ニ抗免疫復合物；
[0013]4)檢測抗體的洗脫:施加磁場將ニ抗免疫復合物聚集，加入洗脫液將未結合的檢測抗體洗脫；和
[0014]5)檢測:施加磁場將步驟4)清洗后的ニ抗免疫復合物移入檢測區并進行檢測。
[0015]本發明的分析方法中摒棄了血液的機械式過濾器分離方法，比如通過多孔過濾膜。雖然多孔過濾膜與離心分離技術相比更適合POCT的需求，但分離后的血漿一般不到初始血液體積的15%，大類目標物損失在分離過程中，因而降低了檢測系統的靈敏度，并且多孔過濾膜的使用増加了系統的復雜度，降低了檢測的可重復性。而本發明直接將負載捕獲抗體的磁珠與抗凝血液混合，捕獲抗體與血液中目標物相結合，然后通過磁場將其聚集固定，通過洗脫液將其從血液中分離出來，減少了分離過程中的目標物損失，大大提高了檢測靈敏度。
[0016]優選地是，在步驟I)和/或步驟3)中，通過磁力變化使磁珠快速運動，促進捕獲抗體與待測抗原之間和/或檢測抗體與待測抗原之間的結合。通過磁力的變化，比如磁極的變化、磁場的施加與撤銷等，從而磁珠在體系內快速運動。
[0017]優選地是，所述標記免疫技術選自酶免疫標記技術(ELISA)或化學發光免疫技術(CLIA)0所述酶免疫標記技術或化學發光免疫技術均可用于定量測定。
[0018]所述酶免疫標記技術是指酶標記抗體或酶標記抗體進行的抗原抗體反應，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。
[0019]所述化學發光免疫技術是利用化學或生物發光系統作為抗原抗體反應的指示系統，借以定量檢測抗原或抗體的方法，發光物質可直接作為抗原抗體的標記物，也可以游離形式用于催化劑(酶)和輔助劑標記的抗原或抗體的發光反應中。
[0020]優選地是，所述全血樣本的體積為2?20微升。由于采用了新的全血分離方法，使得全血樣本的體積大大減少，非常有利于小型化的POCT檢測。
[0021]本發明還提供了ー種即時檢測系統，包括微流控芯片、設置在微流控芯片上下一方或兩方的磁場產生裝置以及檢測裝置，所述微流控芯片包括微通道、設置在微通道內的負載捕獲抗體的磁珠、設置在微通道一端的廢液出口和設置在微通道另一端的洗脫液貯液池，所述微通道通過隔斷機構階段性隔離為第一反應區域、第二反應區域和檢測區，所述第一反應區域設置血液進樣ロ，所述第二反應區域與標記所需物質相關的貯液池相連，所述檢測裝置對檢測區內物質進行檢測。
[0022]本發明提供的檢測系統不再依賴毛細管作用力驅動樣本的流動。依賴毛細管驅動需對微通道進行表面處理，而這種表面處理往往難以準確控制樣品流速及在各個特定位置的停留時間，并且這種表面改性難以長久保持，因而造成檢測的可重復性和穩定性低。本發明通過磁場的控制來準確引導樣本的移動和定位，通過隔斷機構保證樣本在特定位置的停留時間，避免了交叉干擾，系統簡單且控制簡便，系統穩定性和重復性好。
[0023]優選地是，所述隔斷機構為閥或插片。隔斷方法簡單易行，效果顯著。
[0024]優選地是，所述廢液出口設置在微通道上第一反應區域所處一端，所述洗脫液貯液池設置在微通道上檢測區所處一端。
[0025]優選地是，所述微通道內第一反應區域與第二反應區域之間還設置有物理斜坡，所述物理斜坡的垂直障礙高度為0.l-2mm。所述物理斜坡防止剰余的滯留物從第一反應區域的下部部分流入第二反應區域，只有通過磁場轉移的磁珠可以順利從第一反應區域進入第二反應區域，進ー步降低了系統的背景噪音。
[0026]優選地是，所述第一反應區域部分的所述第一反應區域部分的體積為2-40微升。
[0027]優選地是，所述磁場產生裝置的磁場由永磁鐵或電磁鐵提供。
[0028]需要指出的是，雖然全血檢測采用發明的技術方案的技術效果最為顯著，但本領域技術人員可以了解，血清或血漿來源的樣品同樣適合本發明提供的技術方案。
[0029]本發明提供的技術方案具有靈敏度高、重復性好、成本低等特點，可以快速的從微量血液樣本中定量檢測出目標物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1是本發明所述即時檢測系統一【具體實施方式】的結構示意圖；
[0031]圖2是本發明所述微通道一【具體實施方式】的結構示意圖；
[0032]圖3是本發明所述全血的標記免疫分析方法一【具體實施方式】中步驟I)的過程示意圖；
[0033]圖4是本發明所述全血的標記免疫分析方法一【具體實施方式】中步驟2)的過程示意圖；
[0034]圖5是本發明所述全血的標記免疫分析方法一【具體實施方式】中步驟3)的過程示意圖；
[0035]圖6是本發明所述全血的標記免疫分析方法一【具體實施方式】中步驟4)的過程示意圖；
[0036]圖7是本發明所述全血的標記免疫分析方法一【具體實施方式】中步驟5)的過程示意圖。
[0037]圖中所示:11_微通道，111-隔斷機構，112-第一反應區域，113-第二反應區域，114-檢測區，115-物理斜坡，116-檢測抗體貯液池，117-發色底物貯液池，118-檢測窗ロ，12-負載捕獲抗體的磁珠，13-廢液出口，14-洗脫液貯液池，15-血液進樣ロ，21-上電磁鐵，22-下電磁鐵，31-全血樣本，32-待測抗原，33-檢測抗體，34- ニ抗免疫復合物，35- ー抗免疫復合物。【具體實施方式】
[0038]下面結合附圖和實施例對本發明作詳細描述:
[0039]實施例中樣品、反應試劑及檢測儀器的來源如下:
[0040]全血樣本:30份帶有前列腺特異性抗原(PSA)的血液，抗原濃度分別為Opg/ml，5pg/mi,10pg/ml,50pg/ml,150pg/ml,500pg/ml,1.5ng/ml,5ng/ml,50ng/ml 和 150ng/ml，每種濃度3個樣本，全血樣本由不同量的前列腺特異性抗原(PSA)標準品(美國R&DSystems公司)加入到經こニ胺四こ酸(EDTA)抗凝處理后的健康人的血液中獲得。可用的抗凝處理劑還包括檸檬酸、肝素等。
[0041]方法或系統中采用的負載捕獲抗體的磁珠為美國solulink公司的NanoLink?Streptavidin Magnetic Beads (直徑約 0.8 y m)與 MagnaLink? Streptavidin MagneticBeads(直徑約2.8 ii m),生物素化的針對PSA的捕獲抗體(購自美國R&D Systems公司)通過與磁珠直接混合實現捕獲抗體在磁珠上的負載，酶標檢測抗體為辣根過氧化物酶標記的針對PSA的抗體同樣購自美國R&D Systems公司，辣根過氧化物酶的發色底物(SuperSignalELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate)購自美國 Pierce 公司。
[0042]光電倍增管(PMT)購自日本濱松公司。
[0043]如圖1和2所示，本發明所述ー種即時檢測系統包括微流控芯片、設置在微流控芯片上下兩方的磁場產生裝置以及檢測裝置(圖中未示)。
[0044]所述微流控芯片包括微通道11、設置在微通道11內的負載捕獲抗體的磁珠12、廢液出ロ 13和洗脫液貯液池14，所述微通道11從左到右通過隔斷機構111階段性隔離為第一反應區域112、第二反應區域113和檢測區114，所述廢液出ロ 13設置在微通道11上第一反應區域112所處的左端，所述洗脫液貯液池14設置在微通道11上檢測區114所處的右端，所述第一反應區域112與第二反應區域113之間設置了物理斜坡115。
[0045]所述第一反應區域112部分的微通道內寬Imm,內高0.5mm,長度20mm,物理斜坡115的垂直障礙高度為0.2mm，承載的血液量為10微升；另一個實施例中第一反應區域112部分的微通道內寬1mm，內高4mm,長度IOmm,物理斜坡115的垂直障礙高度為2mm,承載的血液量為40微升；另ー實施例中第一反應區域112部分的微通道內寬1mm，內高0.2mm,長度10mm，物理斜坡115的垂直障礙高度為0.1mm，承載的血液量為2微升。
[0046]所述第一反應區域112設置血液進樣ロ 15，所述第二反應區域113設置了檢測抗體貯液池116和發色底物貯液池117，所述檢測區114設置了檢測窗ロ 118。需要指出的是，檢測抗體貯液池116和發色底物貯液池117均屬于與標記所需物質相關的貯液池，該貯液池可以根據情況增加或者減少，比如化學發光免疫技術或熒光免疫技術時，可能僅需要發光物質標記或熒光標記的檢測抗體貯液池，另外，發色底物貯液池117也可以設置在檢測區114，當免疫復合物移入檢測區114內再加入發色底物，顯色后檢測。
[0047]本領域技術人員都很清楚，廢液出口 13、洗脫液貯液池14、血液進樣ロ 15、檢測抗體貯液池116和發色底物貯液池117均通過單向閥結構與微通道11相通，可實現單向液體的流動。
[0048]所述隔斷機構111為插片，插片根據需要插入微通道11阻隔相鄰的兩個區域，防止相互干擾，當樣品和反應試劑轉移需要相鄰區域相通時，只需將插片抽出。相鄰區域設置閥結構也可以實現相似的作用，插片結構更簡單，成本更低。
[0049]所述磁場產生裝置的磁場由電磁鐵提供，其包括設置在微通道11上方的上電磁鐵21和設置在微通道11下方的下電磁鐵22,上電磁鐵21對磁珠施加第一磁場,下電磁鐵22對磁珠施加第二磁場,所述第一磁場的極軸與微通道平行或者垂直，第二磁場的極軸與微通道的夾角可在0?90°之間變化，所述上電磁鐵21和下電磁鐵22可延微通道11方向移動，從而驅動和控制磁珠在微通道11內按要求移動和定位。電磁鐵可通過電流的控制快速的施加和撤銷磁場，效果較好，但永磁鐵也可以通過移動與微通道的相對位置，使磁珠處于或脫離永磁鐵的磁場實現相似的技術效果。
[0050]所述檢測裝置包括光電倍增管(PMT)、熒光分光光度計、電荷耦合器件(CXD)圖像傳感器和CMOS圖像傳感器。
[0051]結合上述即時檢測系統說明本發明所述全血的標記免疫分析方法過程:
[0052]步驟1)，如圖3所示，插入插片111，將第一反應區域112和第二反應區域隔離113，全血樣本31加入到微通道11內，全血樣本31中的待測抗原32(即PSA)與負載捕獲抗體的磁珠12上的捕獲抗體結合形成ー抗免疫復合物35 ;通過上電磁鐵21和下電磁鐵22對磁珠12交替施加第一磁場和第二磁場,磁珠在微通道11內快速上下運動，加速了與待測抗原32的結合，圖中所示，第一磁場的極軸與微通道11平行，第二磁場的極軸與微通道11平行。
[0053]步驟2)，如圖4所示，待測抗原32 (即PSA)與負載捕獲抗體的磁珠12上的捕獲抗體結合完全后，施加第一磁場，ー抗免疫復合物35被吸附聚集在微通道11的上側，抽出插片111，從右到左通入洗脫液，所述洗脫液為TBS+0.05% Tween-20+0.05% BSA，洗脫液替換了全血樣本中的流體，待測抗原32被保留下來。需要指出的，也可以施加第二磁場將ー抗免疫復合物35聚集在下側進行洗脫。
[0054]步驟3)，如圖5所示，下電磁鐵22對磁珠施加第二磁場，ー抗免疫復合物35吸附聚集到微通道11的下側，移動下電磁鐵22沿微通道11從左到右移動，ー抗免疫復合物35經過一段向上的物理斜坡115到達第二反應區域113，第二磁場的極軸與微通道11的夾角變為30° ;進一歩，插入插片111，將第一反應區域112和第二反應區域113，以及第ニ反應區域113和檢測區114之間進行隔斷，通入酶標記的檢測抗體33，檢測抗體33與ー抗免疫復合物35的待測抗原反應形成ニ抗免疫復合物34，移動上磁鐵21和下電磁鐵22到第二反應區域113,對磁珠交替施加第一磁場和第二磁場,磁珠在微通道11內快速上下運動，加速ニ抗免疫復合物34的形成。
[0055]步驟4)，如圖6所示，施加第二磁場，ニ抗免疫復合物34被吸附聚集在微通道11的下側，抽出插片111，通入洗脫液將未反應的檢測抗體33從體系中脫除，經過反復洗脫后，通入發色底物，與酶作用顯色。
[0056]步驟5),如圖7所示,移動下電磁鐵22沿微通道11從左到右移動,ニ抗免疫復合物34到達檢測區114，第二磁場的極軸與微通道11的夾角變為30°，檢測裝置通過檢測窗ロ 118進行化學發光檢測，完成整個分析過程。
[0057]采用本發明所述分析方法和即時檢測系統對35份全血樣本進行檢測，每種濃度的全血樣本的樣品量均為20微升。
[0058]在全血樣本中PSA的結果如下表I所示。檢測靈敏度可低至10pg/ml，檢測的動態范圍為10pg/ml至150ng/ml，在50pg/ml以上的范圍內檢測CV值低于15%，在500pg/ml以上的的范圍內檢測CV值低于10%。
[0059]表1
[0060]
【權利要求】
1.一種全血的快速標記免疫分析方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)磁珠捕獲:抗凝劑處理的全血樣本與負載捕獲抗體的磁珠在第一反應區域混合，所述捕獲抗體與全血樣本中待測抗原結合形成ー抗免疫復合物； 2)血液洗脫:施加磁場將ー抗免疫復合物聚集、洗脫液替換掉流體； 3)檢測抗體的標記:施加磁場將磁珠轉移至第二反應區域，采用標記免疫技木，檢測抗體與ー抗免疫復合物的待測抗原反應形成ニ抗免疫復合物； 4)檢測抗體的洗脫:施加磁場將ニ抗免疫復合物聚集，加入洗脫液將未結合的檢測抗體洗脫；和 5)檢測:施加磁場將步驟4)清洗后的ニ抗免疫復合物移入檢測區并進行檢測。
2.根據權利要求1所述ー種全血的快速標記免疫分析方法，其特征在于，在步驟I)和/或步驟3)中，通過磁力變化使磁珠快速運動，促進捕獲抗體與待測抗原之間和/或檢測抗體與待測抗原之間的結合。
3.根據權利要求1或2所述ー種全血的快速標記免疫分析方法，其特征在于，所述標記免疫技術選自酶免疫標記技術(ELISA)或化學發光免疫技術(CLIA)。
4.根據權利要求1-3任一所述ー種全血的快速標記免疫分析方法，其特征在于，所述全血樣本的體積為2?20微升。
5.ー種即時檢測系統，其特征在于，包括微流控芯片、設置在微流控芯片上下一方或兩方的磁場產生裝置以及檢測裝置，所述微流控芯片包括微通道、設置在微通道內的負載捕獲抗體的磁珠、設置在微通道一端的廢液出口和設置在微通道另一端的洗脫液貯液池，所述微通道通過隔斷機構階段性隔離為第一反應區域、第二反應區域和檢測區，所述第一反應區域設置血液進樣ロ，所述第二反應區域與標記所需物質相關的貯液池相連，所述檢測裝置對檢測區內物質進行檢測。
6.根據權利要求5所述ー種即時檢測系統，其特征在于，所述隔斷機構為閥或插片。
7.根據權利要求5或6所述ー種即時檢測系統，其特征在于，所述微通道內第一反應區域與第二反應區域之間還設置有物理斜坡，所述物理斜坡的垂直障礙高度為0.l-2mm。
8.根據權利要求7所述ー種即時檢測系統，其特征在于，所述第一反應區域部分的體積為2-40微升。
9.根據權利要求5-8任一所述ー種即時檢測系統，其特征在于，所述廢液出口設置在微通道上第一反應區域所處一端，所述洗脫液貯液池設置在微通道上檢測區所處一端。
10.根據權利要求5-9任一所述ー種即時檢測系統，其特征在于，所述磁場產生裝置的磁場由永磁鐵或電磁鐵提供。
【文檔編號】G01N33/558GK103575882SQ201310573304
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】施奇惠, 司珂 申請人:司珂, 施奇惠