類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，即利用渦旋為輔助手段加快被分析物在各相中的傳質(zhì)平衡，超分子溶劑為萃取劑對多種類固醇激素進(jìn)行萃取，是一種新型的中空纖維膜液相微萃取技術(shù)；與傳統(tǒng)的基于中空纖維膜液相微萃取技術(shù)相比，該方法萃取時間縮短，操作簡單，富集倍數(shù)高，能有效地與干擾物質(zhì)分離，適用于不同樣品中類固醇激素的檢測，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)前處理與預(yù)富集【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種有效的新型類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雌激素和腎上腺皮質(zhì)素都屬于類固醇激素，在維持生命、調(diào)節(jié)性功能，對機(jī)體發(fā)展、免疫調(diào)節(jié)、皮膚疾病治療及生育控制方面有明確的作用，具有極重要的醫(yī)藥價值。目前，中國，日本，歐盟都對雌激素和腎上腺皮質(zhì)素規(guī)定了最大殘留量，而且我國還將部分腎上腺皮質(zhì)素規(guī)定為違禁藥物。2002年3月，我國農(nóng)業(yè)部公布《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》，并將8種同化性激素(去甲雄三烯醇酮、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、醋酸甲羥孕酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚和玉米赤霉醇)列為禁用獸藥。
[0003]目前，類固醇激素檢測使用的樣品前處理和預(yù)富集技術(shù)主要有分散液-液微萃取(DLLME)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、濁點萃取(CPE)、超聲波提取(USE)等。本發(fā)明采用的中空纖維膜液相微萃取技術(shù)，集采樣、萃取、濃縮為一體，能有效地與干擾物質(zhì)分離，是一種簡便、快速、有效的分析方法。在已有技術(shù)的基礎(chǔ)上，一是采取渦旋代替攪拌作為輔助手段，操作更簡便，大大縮短了萃取時間；二是采用超分子溶劑作為萃取劑，由于氫鍵作用力和分子間作用力，有效的提高了萃取率，較傳統(tǒng)的攪拌輔助中空纖維膜液相微萃取具有更明顯的優(yōu)勢。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種新型的類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，該方法對基體復(fù)雜的樣品采用中空纖維膜液相微萃取對目標(biāo)物進(jìn)行前處理和富集，萃取多種類固醇激素，具有操作簡單，快速，富集倍數(shù)高等特點。
[0005]本發(fā)明方法按如下步驟進(jìn)行:
(1)樣品處理:將含有類固醇激素樣品加入沉淀劑，混勻，離心，取出上清液，備用；
(2)截取2-8cm的中空纖維膜，在丙酮中超聲處理5-10min，風(fēng)干備用；
(3)超分子溶劑制備:將萃取劑和輔助萃取劑加入到蒸餾水中，渦旋混合l_5min，離心分相，上層溶液即為超分子溶劑，其中萃取劑、輔助萃取劑和水的體積比為2:8:90 ；
(4)將風(fēng)干的中空纖維膜在步驟(3)所制得的超分子溶劑中浸泡0.5-1.0min ；
(5)用微量注射器向中空纖維膜空腔中注滿超分子溶劑，兩端熱封后，置于盛有步驟
(I)處理后樣品溶液中，渦旋處理l_5min ；
(6)萃取完畢后，取出纖維膜剪開兩端置于干凈容器中，用微量注射器吸取洗脫劑將萃取劑從纖維膜中沖出，定容至50 μ L，結(jié)合后續(xù)儀器進(jìn)行含量測定。
[0006]本發(fā)明方法中所述類固醇激素為雌二醇、雌酮、己烯雌酚、黃體酮、地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氫化可的松、苯丙酸諾龍、潑尼松、醋酸可的松、甲基潑尼松龍中的一種或幾種。[0007]本發(fā)明中所述沉淀劑為乙腈、硫酸鋅、氯化鈉、醋酸鉛中一種或幾種，乙腈添加量為0.2-2.5mL/mL，硫酸鋅、氯化鈉、醋酸鉛的添加量為0.02-0.5g/mL。
[0008]本發(fā)明中所述步驟(1)、(3)中離心時間為5-15min，離心速率3000-6000r / min。
[0009]本發(fā)明中所述超聲頻率30-80HZ。
[0010]本發(fā)明中所述中空纖維膜為聚丙烯材質(zhì)，壁厚200-300 ii m，孔徑0.2-0.3 y m。
[0011]本發(fā)明中所述萃取劑為正丁醇、異丁醇、戊醇、己醇、庚醇、正辛醇、異辛醇、癸醇、十一醇、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸中的一種。
[0012]本發(fā)明中所述輔助萃取劑為1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸鹽、四氫呋喃、氫氧化四丁氨基中的一種，洗脫劑為甲醇、乙醇、乙腈中的一種。
[0013]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點:
1、本方法采用超分子溶劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)醇為萃取劑對多種類固醇激素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚、黃體酮、地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氫化可的松、苯丙酸諾龍、潑尼松、醋酸可的松、甲基潑尼松龍)進(jìn)行萃取，利用氫鍵和分子間作用力，有效的提高了被分析物的萃取率；
2、本發(fā)明提供了一種新型的中空纖維膜液相微萃取體系，采用渦旋作為輔助手段，與傳統(tǒng)的攪拌輔助萃取相比，萃取時間大大縮短，操作更簡便，有機(jī)溶劑用量少，富集倍數(shù)高，集采樣、萃取、濃縮為一體；由于超分子溶劑在中空纖維膜內(nèi)部，對機(jī)體復(fù)雜的樣品凈化效果較好，是一種簡便、快速、有效的分析方法。
【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此?！揪唧w實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0016]實施例1:利用本發(fā)明方法萃取人體血液中腎上腺皮質(zhì)激素(地塞米松，丙酸倍率米松，丁酸氫化可的松，苯丙酸諾龍，醋酸可的松，甲基潑尼松龍)，具體操作如下:
(1)取0.5mL的血樣于5ml離心管中，按每個標(biāo)準(zhǔn)品100ng/mL的添加量，加入地塞米松、丙酸倍率米松、丁酸氫化可的松、苯丙酸諾龍、醋酸可的松、甲基潑尼松龍混標(biāo)后，混勻，離心，取上清液加入1.2mL乙腈、0.2g硫酸鋅,稀釋至刻度,混勻,在轉(zhuǎn)速5000r/min條件下離心分離5min,取出上清液用蒸懼水稀釋至5mL,備用；
(2)截取2cm的中空纖維膜(聚丙烯材質(zhì)，壁厚200-300u m,孔徑0.2-0.3um),置于丙酮中在80Hz超聲5min，風(fēng)干備用；
(3)超分子溶劑制備:將0.1ml正丁醇和0.4mI 1- 丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸鹽加入到4.5ml蒸懼水中，潤旋混合lmin,3000rmp下離心8min分相，上層溶液即為超分子溶劑；
(4)將風(fēng)干的中空纖維膜在步驟(3)所配超分子溶劑中浸泡0.5min，使超分子溶劑充分浸入中空纖維膜外孔壁中；
(5)用微量注射器向纖維膜空腔中注滿步驟(3)所配超分子溶劑，兩端封閉，置于盛有步驟(1)處理后樣品溶液中，渦旋混合2min ；(6 )取出纖維膜剪開兩端置于干凈離心管中，用微量注射器吸取甲醇將萃取劑沖出，定容為50 μ L，結(jié)合高效液相色譜進(jìn)行含量測定；
(7)液相色譜條件，流動相:乙腈，甲酸；梯度洗脫:0-6min,80% (v/v)乙腈,6.5_8min,90% (v/v)乙腈;流速:0.8 mL min-1 ;進(jìn)樣量:10 μ L ;柱溫:35°C;檢測波長:240 nm ；
(8)工作曲線制作:取1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液按比例配制成1.00、10.00,50.00、100.00、150.00,200.00,250.00,300.00 ng/mL等不同濃度的地塞米松，曲安奈德，丙酸倍率米松，丁酸氫化可的松，苯丙酸諾龍，醋酸可的松，甲基潑尼松龍混合標(biāo)樣，進(jìn)行色譜分析；
(9)相同色譜條件下，將步驟(6)經(jīng)中空纖維萃取后的樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表1;
表1:HPLC測定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取方法，其特征在于包括以下步驟: (1)樣品處理:將含有類固醇激素樣品加入沉淀劑，混勻，離心，取出上清液，備用； (2)截取2-8cm的中空纖維膜，在丙酮中超聲處理5-10min，風(fēng)干備用； (3)超分子溶劑制備:將萃取劑和輔助萃取劑加入到蒸餾水中，渦旋混合l-5min，離心分相，上層溶液即為超分子溶劑，其中萃取劑、輔助萃取劑和水的體積比為2:8:90 ； (4)將風(fēng)干的中空纖維膜在步驟(3)所制得的超分子溶劑中浸泡0.5-1.0min ； (5)用微量注射器向中空纖維膜空腔中注滿超分子溶劑，兩端熱封后，置于盛有步驟(I)處理后樣品溶液中，渦旋處理l-5min ； (6)萃取完畢后，取出纖維膜剪開兩端置于干凈容器中，用微量注射器吸取洗脫劑將萃取劑從纖維膜中沖出，定容至50 μ L，結(jié)合后續(xù)儀器進(jìn)行含量測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，其特征在于:其特征在于:步驟(1)類固醇激素為雌二醇、雌酮、己烯雌酚、黃體酮、地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氫化可的松、苯丙酸諾龍、潑尼松、醋酸可的松、甲基潑尼松龍中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，其特征在于:步驟(1)中沉淀劑為乙腈、硫酸鋅、氯化鈉、醋酸鉛中一種或幾種，乙腈添加量為0.2-2.5mL/mL，硫酸鋅、氯化鈉、醋酸鉛的添加量為0.02-0.5g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，其特征在于:步驟(1)、(3)中離心時間為5-151^11，離心速率3000-6000r/ min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，其特征在于:超聲頻率30-80Hz。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，其特征在于:中空纖維膜為聚丙烯材質(zhì)，壁厚200-300 μm，孔徑0.2-0.3 u m。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，其特征在于:萃取劑為正丁醇、異丁醇、戊醇、己醇、庚醇、正辛醇、異辛醇、癸醇、十一醇、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，其特征在于:輔助萃取劑為1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸鹽、四氫呋喃、氫氧化四丁氨基中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述類固醇激素的渦旋輔助中空纖維膜液相微萃取的方法，其特征在于:洗脫劑為甲醇、乙醇、乙腈中的一種。
【文檔編號】G01N30/08GK103585784SQ201310567803
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】楊亞玲, 王佩瑾 申請人:昆明理工大學(xué)