用于高靈敏度熒光分析的檢測系統和方法

用于高靈敏度熒光分析的檢測系統和方法
【專利摘要】本發明涉及在熒光分析中用于測量熒光信號的檢測系統。該系統包括探針，其具有結合有熒光標記的傳感表面，以及安裝在襯底傳感表面的近側的光源和檢測器。本發明還涉及用于在液體樣品中檢測被分析物的方法，其使用具有小表面面積(≤5毫米)和具有多個結合分子和多個熒光標記的探針梢端。通過水平流動反應溶液并且在反應容器中上下移動該探針梢端加速該結合反應。本發明還涉及一種熒光標記組合物，其包括具有多個結合分子和多個熒光標記的交聯Ficoll分子。
【專利說明】用于高靈敏度熒光分析的檢測系統和方法
[0001]分案聲明
[0002]本申請是2010年3月2日提交的申請號為201080010177.X、發明名稱為“用于高靈敏度熒光分析的檢測系統和方法”的中國專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0003]本發明涉及在熒光分析中用于測量熒光信號的檢測系統。該系統包括探針，其具有結合有熒光標記的傳感表面，以及安裝在襯底傳感表面的近側的光源和檢測器。本發明還涉及用于在液體樣品中檢測被分析物的方法，其使用具有小表面的探針和具有多個結合分子及多個熒光標記的聚合物。本發明還涉及一種熒光標記組合物，其包括具有多個結合分子和多個突光標記的交聯多糖主鏈分子。
【背景技術】
[0004]在免疫分析系統的研制中，需要滿足許多性能要求。分析需要足夠靈敏，以在亞皮克毫微克范圍的極低水平下檢測被分析物。總的分析時間需要為15分鐘或更少，以在護理情形下提供及時的結果用于病人管理，或滿足批量分析者的處理量需要。在一些情況下，同時用相同的樣品進行多重分析的被分析物面板是有利的，以最小化結果的周轉時間和測試成本。
[0005]許多免疫分析使用熒光標記，因為這類標記有許多實用性的優點。和酶相比，熒光標記穩定得多，并且不需要其它底物試劑。對于多重分析面板，由于每個結合區域可以依次經受熒光激發和放射測量，不受相鄰的結合區域干擾，熒光標記可以在同一反應室中使用離散的結合區域。然而，采用熒光標記的分析靈敏度低于基于酶的分析，這主要是由于酶能夠催化轉化底物，以隨著時間的推移積聚大量的產物分子。
[0006]芳基磺酸酯花青突光染料被描述于Mujumdar等(1993) BioconjugateChemistry,4: 105-111 ；Southwick 等(1990)Cytometry, 11: 418-430 ;和美國專利號5，268，486。每一篇參考文獻都描述了 Cy5，并且其可以從賓夕法尼亞州匹茲堡的Biological Detection Systems公司買到，商品名為Fluorolink? Cy5?。該芳基橫酸酷花青熒光染料具有高消光系數(通常為130，000升/摩爾至250，000升/摩爾)，優良的量子產率，在大多數生物材料和塑料的自體熒光波長范圍以外(500納米至750納米)的熒光發射譜，優良的溶解性，以及低非特異性結合特性。
[0007]盡管有這些優異性能，芳基磺酸酯花青熒光染料也存在某些限制。特別是，這些染料的斯托克斯頻移相對較窄，其導致該染料的激發和發射譜之間的明顯重疊。當這些染料分子在受激發時彼此位置接近時，該激發和發射譜的重疊可以引起熒光的自熄滅。這種自熄滅限制了可以結合至單個抗體分子用于免疫分析的芳基磺酸酯染料分子的數目。在示范性的芳基磺酸酯花青熒光染料Cy5的情況下，斯托克斯頻移是17納米(其為650納米的激發波長和667納米的發射波長之差)。當兩至四個Cy5分子被結合至單個抗體分子時，獲得最佳的熒光產率。當超過四個染料分子被結合至單一抗體分子時，該熒光信號輸出迅速下降。這種不能結合超過四個染料分子至單一的抗體分子的特性明顯限制了使用Cy5-標記的抗體及其它結合物質的免疫分析的靈敏度。
[0008]需要有改善的光學探測系統和改善的方法，用于通過熒光免疫分析以高靈敏度檢測被分析物。該系統和方法應易于由用戶操作，并提供高特異性的信號和最小的背景噪聲。

【發明內容】

[0009]概述
[0010]本發明涉及一種熒光檢測系統，其用于測量探針梢端上的熒光信號。該系統包括:(a)長度比寬度的縱橫比至少為5比I的探針，該探針具有遠端和近端，該近端具有和熒光標記結合的傳感表面；(b)用于直接發射激發光至該探針的傳感表面的光源；(c)指向該傳感表面的會聚透鏡；和(d)用于檢測該發射熒光的光學探測器；其中該會聚透鏡會聚該發射熒光并將其引導至該光學探測器。
[0011]本發明還涉及用于通過熒光免疫分析檢測被分析物的方法。在一個實施方式中(三步結合)，該方法包括步驟:(a)獲得一探針，其具有被固定在該探針梢端上的第一抗體，其中該梢端表面的直徑< 5毫米；(b)將該探針梢端浸入包含具有被分析物的樣品溶液的樣品容器中，在該樣品容器中上下移動該探針梢端并水平流動該樣品溶液；(C)將該探針梢端浸入包含試劑溶液的試劑容器，該試劑溶液包括和一結合配對的第一成員結合的第二抗體分子，在該試劑容器中上下移動該探針梢端并水平流動該試劑溶液；(d)將該探針梢端浸入含洗液的洗滌容器中；(e)將該探針梢端浸入含有擴增溶液的擴增容器中，該擴增溶液包括分子量至少為約一百萬道爾頓，并且和該結合配對的第二成員的至少5個分子和至少25個熒光標記結合的聚合物，在該擴增容器中上下移動該探針梢端并水平流動該擴增溶液，以在該探針梢端上形成該被分析物，該第一抗體，該第二抗體，以及該結合配對的第一和第二成員間的免疫復合體；(f)將該探針梢端浸入含第二洗液的第二洗滌容器；和(g)通過檢測該探針梢端上的熒光信號檢測所形成的免疫復合體；其中該第一抗體和該第二抗體是針對該被分析物的抗體。
[0012]本發明的方法實現了高靈敏度，這是由于獨特地組合了(i)采用具有小傳感表面面積的用于結合被分析物分子的探針，(ii)在反應容器中上下移動該探針梢端并水平流動該反應溶液，和(iii)采用和多重結合分子和多重熒光標記結合的高分子量聚合物。
[0013]本發明還涉及熒光標記組合物，其包括:(a)分子量至少一百萬道爾頓的交聯Ficoll, (b)至少5個結合分子，和(c)至少25個熒光染料分子，其中這些結合分子和熒光染料分子附著于該交聯Ficoll。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1顯示了該光學探測系統的第一實施方式。
[0015]圖2顯示了該光學探測系統的第二實施方式。
[0016]圖3顯示了該光學探測系統的第三實施方式。
[0017]圖4顯示了該光學探測系統的第四實施方式。
[0018]圖5顯示了該光學探測系統的第五實施方式。
[0019]圖6顯示了該光學探測系統的第六實施方式。[0020]圖7顯示了用于檢測被分析物的兩步結合方法。
[0021]圖8顯示了一光學檢測系統，其中光源和檢測器兩者均被安裝在該探針的傳感表面的相對側。
[0022]圖9顯示了該光學檢測系統的另一視圖，其中該探針被浸入被分析物溶液。
[0023]圖10顯示了制備交聯Ficoll400的流程圖。
[0024]圖11顯示了制備Cy5_抗體-交聯Ficoll400的流程圖。
[0025]圖12顯示了通過Sepharose4B CL色層分離法進行的SPDP標記的交聯Ficoll400的洗脫圖形。
[0026]圖13顯示了用于檢測A蛋白的免疫分析形式。Ab:抗體，Ag:抗原(A蛋白)，Sa:鏈霉親和素，B:生物素，F:突光標記。
[0027]詳細說明
[0028]定義
[0029]除非在下文定義，權利要求和說明書中使用的術語將根據本領域技術人員所理解的通常含義進行解釋。
[0030]此處使用的“約”指在所列舉值的±15%以內。
[0031]此處使用的“被分析物結合”分子指能參與和被分析物分子的特異性結合反應的任何分子。其實例包括，但不限于，(i)抗原分子，其用于檢測特異性針對該抗原的抗體的存在；(ii)抗體分子，其用于檢測抗原的存在；(iii)蛋白質分子，其用于檢測該蛋白質的結合配偶體的存在；(iv)配位體，其用于檢測結合配偶體的存在；或(V)單鏈核酸分子，其用于檢測核酸結合分子的存在。
[0032]形狀的的“縱橫比”指其較長尺寸與其較短尺寸的比率。
[0033]“結合分子”指能夠結合另一個感興趣的分子的分子。
[0034]此處使用的“結合配對”指彼此吸引并特異性結合的兩個分子。結合配對的例子包括，但不限于，抗原和針對該抗原的抗體，配位體及其受體，核酸的互補鏈，生物素和抗生物素蛋白，生物素和鏈霉親和素，凝集素和糖類。優選的結合配對是生物素和鏈霉親和素，生物素和抗生物素蛋白，熒光素和抗熒光素，洋地黃毒苷/抗洋地黃毒苷(digioxigenin/ant1-digioxigenin)。生物素和抗生物素蛋白包括生物素衍生物和抗生物素蛋白衍生物，如鏈霉親和素，其可在使用復合物結合序列的分析規程被用作中間結合物質。例如，抗體可以用生物素標記(“生物素酰化”)，并被用于和預先固定在固相表面上的目標物質結合。根據本發明的利用抗生物素蛋白或鏈霉親和素的熒光組合物即可被用于引入該熒光標記。
[0035]此處使用的“被固定”指試劑被固定在固體表面上。當試劑被固定至固體表面時，其可以被非共價或共價地結合至該表面。
[0036]此處使用的“整體式襯底”指具有一個折射指數的單塊固體材料，如玻璃，石英，或塑料。
[0037]此處使用的“數值孔徑”指表征角度范圍的無量綱數，該系統可以在該范圍上接收或發出光。
[0038]此處使用的“光學纖維”是可沿著其長度傳送光的玻璃或塑料纖維。光學纖維通常為圓形橫截面的絕緣波導管，其由絕緣材料(芯材)及圍繞該絕緣材料的另一種具有更低折射指數的絕緣材料(包層)組成。[0039]此處使用的“探針”指在傳感側包覆有被分析物結合分子的薄膜層的襯底。探針具有遠端和近端。該近端(在此申請中也稱為探針梢端)具有用被分析物結合分子的薄層包覆的傳感表面。
[0040]熒光檢測系統
[0041]本發明涉及一種熒光檢測系統，其用于測量探針梢端上的熒光信號。發明人已經發現，通過將光源和檢測器兩者都安裝在該探針的傳感表面的近側，進入檢測光學器件的不希望的反射被降低，探測效率被提高。
[0042]該系統包括:(a)長度比寬度的縱橫比至少為5比I的探針，該探針具有第一端和第二端，該第二端具有和熒光標記結合的傳感表面；(b)用于直接發射激發光至該探針的傳感表面的光源；(C)指向該傳感表面的會聚透鏡；和(d)用于檢測該發射熒光的光學探測器；其中該會聚透鏡會聚該發射熒光并將其引導至該光學探測器。
[0043]該探針可以為整體式襯底或光學纖維。該探針可以為任何形狀，如桿形，圓柱形，圓形，正方形，三角形等，其長度比寬度的縱橫比至少為5比1，優選為10比I。因為在免疫分析期間該探針被浸在樣品溶液和一種或多種分析溶液中，需要有縱橫比至少為5比I的長探針，使該探針的梢端能夠浸入該溶液。在該長探針被轉移至不同的反應室時也可以進行多相分析。避免了該分析期間分配和吸取試劑和樣品。該探針的傳感表面被包覆以被分析物結合分子，并與突光標記結合。
[0044]任何可以發射適當的該熒光標記的激發光的光源均適用于本發明。優選的光源是可以發出適于突光標記的波長的光的激光器。例如，該激光器中心波長對于Cy5突光染料優選為649納米。適宜的用于檢測發射光的光學探測器是光電倍增管(PMT)，電荷耦合裝置(CCD)，或光電二極管。
[0045]包括會聚透鏡的該光源和該光學探測器被安裝在該探針梢端表面(傳感表面)的同一側。如果該傳感表面朝下，它們都被安裝在該梢端表面以下。如果該傳感表面朝上，它們都被安裝在該梢端表面以上。它們離該傳感表面比該探針的另一端更近。該傳感表面始終在該會聚透鏡的數值孔徑之內。該探針可以是，但不一定是以這些會聚透鏡中央對準。
[0046]圖1顯示了第一實施方式。光學透明的桿(探針)由玻璃或石英制成。該桿的下端被用作傳感表面。突光標記被結合至該傳感表面。為檢測該突光，該桿的傳感端被浸入具有透明底部的容器中，其含有為了熒光發射已優化的緩沖溶液。該透明底部的材料可以選自塑料，玻璃或石英。光學探測器和激發激光器被安裝在該容器的同一側，并且這些會聚透鏡在該傳感表面下。該激光器經過對準，以使該激光束以入射角a投射在該桿遠端的表面上，a大于該桿的數值孔徑的角度0。因為該桿的折射指數比空氣大得多，更接近該緩沖溶液，大部分入射激光將透過該桿。較少量的激光在該傳感表面被反射。一些激光被結合入該桿，然后從該桿的另一端反射回來。當a>0時，該反射光離開該桿的傳感表面以形成環形的光帶。此環的中間光強低得多。由于這些會聚透鏡被置于該環中央，進入該檢測光學器件的不希望的反射被降低。為進一步減少此種反射，該桿的上端可以為錐形并砂磨至一定粗糙度。為了檢測在該傳感表面上的該發射光，可以用光電倍增管或CCD。該桿的傳感表面和這些會聚透鏡之間的距離是可調節的，以實現最佳探測效率。
[0047]圖2顯示了第二實施方式，其中該桿在容器中包含的空氣中測量，而非在緩沖溶液中測量。該激光器和該檢測器的結構類似于第一實施方式，其中光學探測系統和激發激光器被安裝在該桿的同一側，并且這些會聚透鏡在該傳感表面下。該激光器經過對準，以使該激光束以入射角a投射在該桿的傳感表面上，a被設定為大于該桿的數值孔徑的角度
6。一些入射的激光將透過該桿。大部分激光在該傳感表面被反射。剩余的激光被結合入該桿，然后從該桿的上端被反射回來。當a>0時，該反射光離開該桿的傳感表面以形成環形的光帶。該環中間的光強低得多。由于這些會聚透鏡被置于該環中央，避免了進入該檢測光學器件的不希望的反射。為進一步減少此種反射，該桿的上端可以為錐形并砂磨至一定粗糙度。為了檢測在該傳感表面上的該發射光，可以用光電倍增管或CCD。該桿的傳感表面和這些會聚透鏡之間的距離是可調節的，以實現最佳探測效率。
[0048]圖3顯示了第三實施方式，用非透明的桿替換圖1的實施方式中的透明桿。該非透明桿的材料可能是塑料，陶瓷，和金屬。該桿的下端被用作傳感表面。為了檢測該熒光，該桿的傳感表面被浸入具有透明底部的容器中，該容器包含為了熒光性能已經優化的緩沖溶液。該透明底部的材料可以選自塑料，玻璃或石英。光學探測系統和激發激光器被安裝在該桿和該容器的同一側，并且這些會聚透鏡在該傳感表面下。該激光器經過對準，以使該激光束以入射角a投射在該桿的傳感表面上。因為該桿是非透明的，該激光束在該傳感表面被反射和吸收。優選該桿的材料對于該激發激光發射最小限度的熒光。為了檢測在該傳感表面上的該發射光，可以使用光電倍增管或CCD。在該桿的傳感表面和這些會聚透鏡之間的距離是可調節的，以實現最佳探測效率。
[0049]圖4顯示了第四實施方式，其具有非透明的桿，其在容器中所含空氣中而非緩沖溶液中進行測量。該非透明桿的材料可能是塑料，陶瓷，和金屬。該桿的下端被用作傳感表面。光學探測系統和激發激光器被安裝在該容器的同一側，并且這些會聚透鏡在該傳感表面下。該激光器經過對準，以使該激光束以入射角a投射在該桿的傳感表面上。因為該桿是非透明的，該激光束在該傳感表面被反射和吸收。優選該桿的材料對于該激發激光發射最小限度的熒光。為了檢測在該傳感表面上的該發射光，可以使用光電倍增管或CCD。在該桿的傳感表面和這些會聚透鏡之間的距離是可調節的，以實現最佳探測效率。
[0050]圖5顯示了第五實施方式，其具有涂覆在該桿的傳感表面上的鏡狀薄膜。該桿可以是透明的或非透明的。該鏡狀薄膜涂層被用于反射光，既可以是激發光也可以是發射光。該鏡涂層可以采用鋁，金或銀。SiO2的第二薄膜被任選地涂覆在該第一薄膜上。該非透明桿的材料可以是塑料，陶瓷，或金屬。該透明桿的材料選自玻璃，石英，或塑料。熒光標記被結合至該傳感表面。為了檢測熒光，該桿的傳感端被浸入具有透明底部的容器中，該容器包含為了熒光性能已經優化的緩沖溶液。該透明底部的材料可以選自塑料，玻璃或石英。光學探測系統和激發激光器被安裝在該容器的同一側，并且這些會聚透鏡在該傳感表面下。該激光器經過對準，以使該激光束以入射角a投射在該桿的傳感表面上。因為該桿的傳感表面被第一鏡狀薄膜覆蓋，該激光束以反射角a被反射。為了檢測在該傳感表面上的該發射光，可以使用光電倍增管或CCD。在該桿的傳感表面和這些會聚透鏡之間的距離是可調節的，以實現最佳探測效率。
[0051]圖6顯示了第六實施方式，其在該桿的傳感表面上使用鏡狀薄膜涂層，但是測量在空氣中完成。該桿可以是透明的或非透明的。該鏡狀薄膜涂層被用于反射光，既可以是激發光也可以是發射光。該鏡涂層可以使用鋁，金或銀。另一 SiO2的薄層被任選地涂覆在該第一鏡狀薄膜上。該非透明桿的材料可以是塑料，陶瓷，和金屬。該透明桿的材料選自玻璃，石英，或塑料。熒光標記被結合至該傳感表面。為了檢測該熒光，該桿的傳感端，光學探測系統和激發激光器被安裝在該桿的傳感表面的同一側，并且這些會聚透鏡在該傳感表面下。該激光器經過對準，以使該激光束以入射角a投射在該桿的傳感表面上。因為該桿的傳感表面被鏡狀薄膜覆蓋，該激光束被反射。為了檢測在該傳感表面上的該發射光，可以用光電倍增管或CCD。該桿的傳感表面和這些會聚透鏡之間的距離是可調節的，以實現最佳探測效率。
[0052]盡管圖2，4，和6示范了把激光器和光學探測器安裝在探針梢端以下的方式，應當理解該探針可以被上下倒轉，且該激光器和該光學探測器可以被安裝在該傳感表面以上，以檢測該熒光信號。
[0053]用熒光免疫分析檢測被分析物
[0054]本發明還涉及用于在液體樣品中通過熒光免疫分析檢測被分析物的方法。發明人已經發現以下步驟的組合使檢測的靈敏度水平增加至皮克/毫升:a)使用具有小傳感表面面積的用于結合被分析物分子的探針，(ii)在反應容器中上下移動該探針梢端并水平流動該反應溶液，和(iii)使用結合了至少5個結合分子和至少25個熒光標記的高分子量聚合物。
[0055]圖7示范了該方法的一個實施方式。在此實施方式中(兩步結合)，該方法包括步驟:(a)獲得一探針，其具有被固定在該探針梢端(傳感表面)上的第一抗體，其中該梢端表面的直徑< 5毫米；(b)將該探針梢端浸入包含具有被分析物的樣品溶液的樣品容器中；(C)在該樣品容器中上下移動該探針梢端并水平流動該樣品溶液，以使該被分析物和該第一抗體結合；(d)將該探針梢端浸入包含試劑溶液的試劑容器，該試劑溶液包括分子量至少一百萬道爾頓，和至少5個第二抗體分子以及至少25個熒光標記結合的聚合物；(e)在該試劑容器中上下移動該探針梢端并水平流動該試劑溶液，以在該探針梢端上形成該被分析物，該第一抗體，該第二抗體的免疫復合體；(f)將該探針梢端浸入含洗液的洗滌容器中，并通過檢測該探針梢端上的熒光信號檢測所形成的免疫復合體；其中該第一抗體和該第二抗體是針對該被分析物的抗體；在上述方法中，可以在結合步驟(C)之后加入任選的洗滌步驟。因為由于結合表面面積小，攜帶溶液的量極少，可能不需要此額外的洗滌步驟。
[0056]在另一個實施方式中(兩步結合)，該方法包括步驟:a)獲得一探針，其具有被固定在該探針的梢端上的第一抗體，其中該梢端表面的直徑< 5毫米；(b)將該探針梢端浸入一樣品容器中，該樣品容器含有(i)具有被分析物的液體樣品和(ii)包括分子量至少為約一百萬道爾頓，并與至少5個第二抗體分子以及至少25個熒光標記結合的聚合物的試劑溶液；(c)在該樣品容器中上下移動該探針梢端并水平流動該試劑溶液，以在該探針梢端形成該被分析物，該第一抗體，和該第二抗體的免疫復合體；(d)將該探針梢端浸入含洗液的洗滌容器；和(e)通過檢測該探針梢端上的熒光信號檢測所形成的免疫復合體；其中該第一和第二抗體是針對該被分析物的抗體。
[0057]在又一個實施方式中(三步驟結合)，該方法包括步驟:(a)獲得一探針，其具有被固定在該探針梢端上的第一抗體，其中該梢端表面的直徑< 5毫米；(b)將該探針梢端浸入包含具有被分析物的樣品溶液的樣品容器中，在該樣品容器中上下移動該探針梢端并水平流動該樣品溶液；(C)將該探針梢端浸入包含試劑溶液的試劑容器，該試劑溶液包括和一結合配對的第一成員結合的第二抗體分子，在該試劑容器中上下移動該探針梢端并水平流動該試劑溶液；(d)將該探針梢端浸入含擴增溶液的擴增容器，該擴增溶液包括分子量至少為約一百萬道爾頓，并和至少5個該結合配對的第二成員的分子以及至少25個熒光標記結合的聚合物，在該擴增容器中上下移動該探針梢端并水平流動該擴增溶液，以在該探針梢端上形成該被分析物，該第一抗體，該第二抗體，和該結合配對的第一和第二成員之間的免疫復合體；(e)將該探針梢端浸入含第二洗液的第二洗滌容器中；和(f)通過檢測該探針梢端上的熒光信號檢測所形成的免疫復合體；其中該第一抗體和該第二抗體是針對該被分析物的抗體；在上述方法中，可以在結合步驟(b)和(C)之后加入任選的洗滌步驟。因為結合表面面積小，攜帶溶液的量極少，可以不需要此額外的洗滌步驟。
[0058]將試劑固定至該固相(該探針梢端的傳感表面)的方法在免疫生物化學中是常見的，其涉及該固相和試劑之間共價的，疏水性的或靜電鍵的形成。被分析物結合分子可以被直接固定化在該傳感表面上。或者，被分析物結合分子可以通過結合配對被間接固定在該傳感表面上。例如，可以先通過對該固體表面的吸附或通過和該固體表面上涂覆的氨基丙基硅烷的共價結合固定抗熒光素，然后用熒光素標記的該被分析物結合分子可以通過熒光素和抗熒光素的結合(結合配對)結合至該固體表面。
[0059]本發明的方法實現了高靈敏度，這是由于獨特地組合了(i)采用小傳感表面面積的用于結合被分析物分子的探針，(ii)在反應容器中上下移動該探針梢端并水平流動該反應溶液，和(iii)采用與多重結合分子和多重熒光標記結合的高分子量聚合物。
[0060]本發明的第一要素是使用具有小梢端的用于結合被分析物的探針。該梢端具有較小的表面面積，其直徑< 5毫米，優選< 2毫米或< I毫米。該探針梢端的小表面賦予它若干優點。在固相免疫分析中，具有小表面面積是有利的，因為其具有更少的非特異性結合，并因此產生更低的背景信號。進一步地，由于該梢端的表面面積小，攜帶在該探針梢端上的試劑或樣品也極小。此特征使該探針梢端便于洗滌，由于洗液具有較大的體積，其在該洗液中導致的污染可以忽略。該探針梢端的小表面面積的另一個方面是其結合量小。因此，當該探針梢端被浸入試劑溶液中時，該試劑的結合不會耗損大量該試劑。該試劑的濃度被有效地維持不變。對洗液污染可忽略不計以及試劑消耗少可以使該試劑溶液，該擴增溶液，以及該洗液被重復使用許多次，例如2-8次。
[0061]然而，在該探針梢端和表面面積的結合反應是緩慢的。當該探針梢端被浸入溶液時，結合表面面積和溶液體積的比率小，因此需要極長的培育時間，使靶分子擴散到該探針的傳感表面。本發明提高靈敏度的第二要素是引起該溶液橫向流動(軌道流)經過該探針梢端，經過探針梢端的溶液的橫向流動加快靶分子因與已被固定于固定相的配偶體結合而被捕獲在探針梢端上。例如，該反應容器可以被裝在軌道振蕩器上，并且該軌道振蕩器以至少50rpm的速度旋轉，優選至少200rpm,更優選至少500rpm,如500-1, OOOrpm。另外，該探針梢端以0.01至10毫米/秒的速度垂直于該軌道流的平面上下移動，以在該探針梢端以上和以下引起額外的溶液混合。將低背景的小表面和為了迅速捕獲靶分子的流動的組合產生了高特異性的分析信號和低背景噪音，它們是分析靈敏度的決定因素。
[0062]本發明提高靈敏度的第三要素是使用以多重結合分子和多重熒光染料標記的高分子量聚合物。熒光染料作為免疫分析中的標記具有許多實用性的優點；主要是它們很穩定并且易于和結合蛋白相連。熒光染料的主要限制在于它們不能形成用于靈敏分析的足夠的熒光信號。因此，在聚合物上具有多重熒光染料標記以增加熒光信號很重要。許多聚合物(如右旋糖酐和Ficoll和核酸聚合物)均適合作為染料載體。熒光標記可以直接附著于該聚合物，或者可以通過結合分子(如抗體或鏈霉親和素)被間接附著于該聚合物。
[0063]當該結合分子是多肽或蛋白質(如抗體)時，該熒光標記可以采用科學和專利文獻中所述的常規的結合化學作用通過各種部分與之共價結合，包括二硫化物，羥苯基，氨基，羧基，卩引哚，或其它官能團。另外，抗體可以用已知的技術(見Wilchek和Bayer, (1988)ANAL.BIOCHEM.171: 1_32)進行生物素酰化并且通過抗生物素蛋白/鏈霉親和素分子連接該突光標記。
[0064]該熒光標記與多核苷酸的共價結合可以用常規的結合化學作用通過各種部分實現，包括醛，酮，異硫氰酸酯，亞氨酸酯，肌苷，酰基和烷基，而許多參考文獻也教導了用生物素的衍生。(Leary 等(I983)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80: 4045-4049 ；W086/02929 ；EP063879 ；Langer 等(1981) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA78: 6633-6637 ;和 EP2009996)。
[0065]美國專利號5，268，486 ;5，650，334描述了將芳基磺酸酯花青熒光染料標記結合至抗體及其它蛋白的示范性的技術，其內容以參考方式被合并于此。由賓夕法尼亞州，匹茲堡的Biological Detection Systems公司出版的技術通報(標識為Cat.N0.A25000)描述了將優選的Cy5熒光標記連接至抗體和核酸的技術。
[0066]本發明的方法可以由此申請中如上所述的熒光檢測系統進行檢測,其中光源和檢測器被安裝在探針傳感表面的同一側(近側)。
[0067]另外，本發明的方法也可以由光源和檢測器均安裝在探針的傳感表面的相對側，并且接近于該探針另一端的光學系統(圖8-9)進行檢測。
[0068]在圖8中，該探針可從該檢測系統移除。激光被直接接入該探針的一端。該探針可以相對于該光學探測系統以X-Y-Z方向移動。此種運動可以在該探針和該光學探測系統之間精確對準。該探針梢端可以被浸入標準微量滴定板的孔中。該板被安裝在軌道振蕩器上。該探針梢端和該樣品溶液在該孔中的相對運動可加快分析速度。
[0069]如圖9的放大圖所示，探針的梢端被直接浸入被分析物樣品，用于結合分析。該聯接端從該光學探測系統被卸下。光電倍增管(PMT)被用作光電探測器。
[0070]該探針可以由整體式襯底或光學纖維構成。如果該探針是光學纖維，則該纖維探針的聯接端可以被涂覆以抗反射涂層，以增加聯接效率。
[0071]在一個實施方式中，一偏振過濾器被置于該激光器的前端，并且一垂直偏振的第二偏振過濾器被置于該PMT的前端。采用兩個偏振過濾器，不希望的激光反射被最小化。
[0072]在另一個實施方式中，該偏振過濾器可以被帶通過濾器取代，其只允許該熒光波長通過。
[0073]該探針的芯直徑大于0.1毫米，但不超過5毫米，優選不超過2毫米，或I毫米。優選的數值孔徑在0.15和0.50之間。
[0074]含多個結合分子和突光標記的聞分子量支鏈多糖。
[0075]本發明還涉及熒光標記組合物，其包括(a)分子量至少為一百萬道爾頓的交聯Ficoll, (b)至少5個結合分子，和(C)至少25個熒光染料分子，其中這些結合分子和熒光染料分子與該交聯Ficoll相連。該組合物優選包括5-50或5-100個結合分子和25-100或25-500個熒光染料分子。
[0076]在一個實施方式中，該突光染料分子被直接與該交聯Ficoll相連。在另一個實施方式中，該熒光染料分子通過結合分子(如抗體分子或鏈霉親和素)被間接與該交聯Ficoll相連。為了最小化熒光熄滅，這些熒光染料分子在沿著該交聯Ficoll的被間隔開的位置與其相連
[0077]此熒光標記組合物是用于本發明上述方法的優選組合物。
[0078]Ficoll是商業上可獲得的，其分子量為70K和400K道爾頓。Ficoll具有作為高分子載體的優點。將熒光蛋白質進行交聯在提高分析靈敏度方面的一個問題是非特異性的背景信號會增加。以相同比例增加的特異性分析信號和背景信號會導致相同的信號和背景比率，而沒有靈敏度改善。多糖總體上對于許多通常被應用于免疫分析的固相材料展現的非特異性結合可以被忽略。因此，在最小化對于該固相的非特異性結合時，Ficoll高分子載體增加了特異性結合的信號，由此增加信號和背景的比率，增強靈敏度。
[0079]相對于其它多糖右旋糖酐，Ficoll是有利的。由于右旋糖酐為直鏈，幾乎沒有分支點，其分子量分布極為多分散(polydisperse)。在將蛋白質連接到多糖載體的過程中,起始材料具有限定的，窄的分子量范圍時，可獲得可重復的結果。Ficoll的支鏈結構使其對于化學裂解或機械剪切有一定耐受度，并因此最小化對其分子量的影響。Ficoll的支鏈結構的另一個方面是其可以最小化該聚合物和用于免疫分析的固相材料的相互作用；因此相比于其它多糖，非特異性結合較少。
[0080]Ficoll400 (分子量)是多分散的(polydisperse)并且大多數該材料實際上分離為比IgG小得多的分子。理想的多糖載體的分子量應大于一百萬道爾頓，其在Sepharose4BCL柱的空隙體積或其附近洗出。極少Ficoll400制品表現為這種實際上有用的高分子量聚合物。
[0081]本發明的一個方面是制備Ficoll的交聯衍生物，以形成高分子量聚合物。Ficoll的交聯進一步增加該聚合物內的支化程度。本發明的這個方面的優點在于，通過控制該交聯化學作用，可以在很寬的分子量范圍內制備Ficoll聚合物。可以實現分子量大于一百萬道爾頓的交聯Ficoll，并且這些聚合物保持可溶解。這種聚合物能夠進一步衍生，用于結合熒光染料和蛋白質；這些結合后的聚合物在固相結合分析中顯示可以放大信號，并且最令人驚訝的是，對于該固相的低非特異性結合。這些性能特征是Ficoll400或其它多糖的商業制品不可預期的。
[0082]該交聯的Ficoll組合物應具有以下特征:(a)可溶性大于2.5，5或10毫克/毫升；(b)平均水動力直徑大于100，150，或200納米；(c)分子量大于1，2，5，或IOMD和(d)每Ficoll有至少25個用于連接結合分子和/或熒光染料分子的官能團。
[0083]Ficoll的胺衍生物是商業上可獲得的，其能夠交聯。圖10顯示了制備交聯Ficoll的流程圖。
[0084]許多突光發生團是商業上可獲得的，如NHS衍生物,其允許和蛋白質(如鏈霉未和素或抗體)的氨基結合。Cy5和Alexa Fluor647是良好的例子。然后該被突光標記的蛋白質通過使用沿用已久的馬來酰亞胺/巰基蛋白質結合步驟或其它交聯方法被結合至氨基Ficollo圖11顯示了抗體結合至交聯Ficoll的流程圖。
[0085]交聯Ficoll可以作為Cy5抗FITC的大分子載體，這種結合，與單體的Cy5抗FITC相比較，可以增加免疫分析靈敏度。
[0086]以下實施例進一步示范了本發明，其不應被解釋為將本發明的范圍限制為其中所 述的特定步驟。
【具體實施方式】
[0087]實施例1交聯Ficoll400的制備
[0088]圖10顯示了制備交聯Ficoll400的流程圖。
[0089]向2毫升經過胺化，使每Ficoll400kD含88個胺(Skold Technology)的Ficol 1400 (Sigma/Aldrich)的 20 毫克 / 毫升的 PBS 溶液添加 10 微升 SPDP (6-[3-[2-吡啶二硫基]丙酰胺基]己酸琥拍酰亞胺酯，Invitrogen)的50毫克/毫升的DMF(N，N- 二甲基甲酰胺)溶液。該SPDP與Ficoll的分子結合率(MCR)為15。在室溫下使該混合物反應I小時，隨后滲析。通過標準方法估算的硫醇結合為5.5/Ficoll400kD。
[0090]為了去保護SPDP標記的Ficol 1400上的硫醇，向20毫克在I毫升PBS中的溶液添加30微升DTT ( 二硫蘇糖醇，Thermo Scientific)的38毫克/毫升的PBS溶液，并使其在室溫下反應兩小時。在HHO柱上純化該SH-Ficoll。
[0091]將SMCC (4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯)通過如下兩種制備反應連接至胺化的Ficol 1400 (88個胺/Ficoll):1.)將10毫克胺化的Ficol 1400在I毫升PBS中的溶液和25微升SMCC (Pierce Chemical)的10毫克/毫升的DMF溶液混合，使SMCC/Ficoll的MCR為30。該混合物在室溫下反應兩小時，隨后在HHO柱(GE Healthcare)上純化。2.)將10毫克胺化的Ficoll400在I毫升PBS中的溶液和12.5微升SMCC的10毫克/毫升的DMF溶液混合，使SMCC/Ficoll的MCR為15。該混合物在室溫下反應2小時，隨后在roio柱上純化。
[0092]為了交聯該SH_Ficoll400和SMCC_Ficoll400，進行了兩種制備反應:1.)將10毫克SH-Ficol 1400在I毫升PBS中的溶液和10毫克SMCC-Ficol 1400在I毫升PBS中的溶液(30MCR)混合。2.)將10毫克SH-Ficoll400在I毫升PBS中的溶液和10毫克SMCC-Ficol 1400在I毫升PBS中的溶液(15MCR)混合。將混合物在30°C反應過夜。
[0093]為了提供抗體和該交聯Ficoll400的連接位點，隨后將殘余的胺與過量的SPDP反應。將20毫克交聯Ficoll400和75微升SPDP的50毫克/毫升的DMF溶液混合。該混合物在室溫下反應I小時，隨后相對于PBS滲析。
[0094]然后將該SPDP標記的交聯Ficol 1400制備反應物在Sepharose4B CL (GEHealthcare)柱上分離。結果表明該交聯Ficoll是比天然的Ficoll400大得多的聚合物，并且交聯的程度取決于SMCC的MCR。用30的SMCC MCR獲得了高分子量聚合物，其在4B CL的空隙體積處或其附近，組分40-50被洗出，其峰大致位于組分45(圖12);它們是用于在之后和結合蛋白及熒光染料載體結合的優選的聚合物。作為對比，空隙組分為組分32，該非交聯的SPDP-FicolI高度分散，并且在組分50-120被洗出，其峰大致在組分98。
[0095]實施例2.Cy5-抗體-交聯Ficoll結合物的制備
[0096]圖11顯示了制備Cy5_抗體-交聯Ficoll400的流程圖。
[0097]將抗FITC (Biospacific)在pH為9.5的I毫升0.1M碳酸鈉溶液中的3.2毫克/毫升溶液和10.6微升Cy5-NHS (N-羥基琥珀酰亞胺，GE Healthcare)的10毫克/毫升DMF溶液混合，并使其在30°C反應1/2小時。然后在roio柱上純化該混合物。
[0098]將該Cy5_抗FITC在I毫升PBS中的1.5毫克/毫升溶液和1.9微升SMCC的5毫克/毫升的DMF溶液混合，并在室溫下反應I小時，隨后在roio柱上純化。
[0099]通過向0.7毫克交聯Ficol 1400-SPDP在I毫升PBS中的溶液加入30微升38毫克/毫升的DTT，并在室溫下反應I小時，隨后用roiO柱純化該交聯Ficoll，來將交聯Ficoll400-SPDP上的硫醇去保護。
[0100]將該Cy5_抗FITC-SMCC與交聯Ficoll400-SH混合，并在室溫下反應過夜。然后加入10微升12.5毫克/毫升的NEM(N-乙基馬來酰亞胺，Aldrich)，并在室溫下反應1/2小時。然后在S印harose4B CL柱上純化該結合物。
[0101]實施例3.Cy5-抗體右旋糖酐結合物的制備
[0102]制備Cy5_抗體右旋糖酐(直鏈)結合物(描述于美國專利5，650，334)，用于對比研究。
[0103]將抗FITC (Biospacific)在pH為9.5的I毫升0.1M碳酸鈉溶液中的3.2毫克/毫升溶液和10.6微升Cy5_NHS (GE Healthcare)的10毫克/毫升DMF溶液混合，并使其在30°c反應1/2小時。然后在roio柱上純化該混合物。
[0104]將該Cy5_抗FITC在I毫升PBS中的1.5毫克/毫升溶液和1.9微升SMCC的5毫克/毫升的DMF溶液混合，并在室溫下反應I小時，隨后在roio柱上純化。
[0105]為了硫醇化右旋糖酐，將150微升的34毫克/毫升的6-[3-[2_吡啶二硫基]-丙酰胺基I己酸琥珀酰亞胺酯(LC-STOP) (Pierce#21651)的DMF溶液加入5毫升含20毫克/毫升氨基右旋糖酐(Molecular Probes, #D_7145，130 胺 / 右旋糖酐，2000kD M.W.)，pH 為
7.4的PBS溶液。在室溫(RT)下進行反應30分鐘，然后將該混合物在RT相對于PBS滲析過夜。在該反應期間，氨基右旋糖酐中超過95%的胺被LC-SPDP標記。然后該LC-STOP-右旋糖酐在Sephar0Se4B CL柱上被純化。為去除低分子量右旋糖酐組分，僅收集空隙峰的組分。
[0106]將6.15毫升pH7.4，濃度為2.6毫克/毫升的Cy5_抗FITC的PBS溶液和156微升2.7毫克/毫升的SMCC(Pierce#22320)的DMF溶液混合，并使其在RT反應30分鐘。通過在roio柱上純化去除未反應的SMCC。
[0107]通過將156微升的0.5M 二硫蘇糖醇加入5.2毫升的3.1毫克/毫升LC-SPDP-右旋糖酐，并在RT培育15分鐘，來還原該LC-STOP-右旋糖酐。然后在PD-1O (Pharmacia#17-0851-01)柱上純化該右旋糖酐。
[0108]通過將該被還原的LC-SroP-右旋糖酐和SMCC-抗-FITC混合并在RT培育過夜，獲得結合物。加入NEM(Sigma#12828-7)至1.0mM的最終濃度，以停止該反應。然后將該結合物加樣至Sepharose4B CL柱,并且收集在空隙體積洗出的組分。
[0109]實施例4.肌鈣蛋白I分析材料
[0110]反應盤由PMMA塑料制成，在其底部上固定有苯甲酮牛血清白蛋白(BSA)-生物素，其制備如下。然后將每盤100微升苯甲酮BSA-生物素在10微升/毫升的條件下通過紫外線-固化60分鐘來固定。
[0111]用異雙功能連接試劑，S-乙酰基硫代乙醇酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SATA，Pierce#26102)，和SMCC(Pierce#22320)制備鏈霉親和素-單克隆抗TnI結合體(SA-抗TnI)。將十五(15)摩爾過量的SATA (以5毫克/毫升溶解于DMF中)與I毫克pH為7.4，
0.74毫克/毫升的抗-TnI (BioDesign)的PBS溶液在室溫下反應3小時。另外將15摩爾過量的SMCC (以5毫克/毫升溶解于DMF中)與1.1毫克的鏈霉親和素在PBS中的1.1毫克/毫升溶液在室溫下反應3小時。用roiO柱從抗Tnl/SATA和鏈霉親和素/SMCC反應混合物中去除未反應的連接物。將純化的抗Tn1-SATA和鏈霉親和素-SMCC以1: 3的蛋白摩爾比率混合。通過加入IM羥胺開始該結合反應直至IOOmM的最終濃度，并在4°C培育18小時以上。通過在該反應混合物中加入IOOmM的NEM至ImM的最終濃度停止該反應，并在室溫下培育15分鐘。NEM培育后，用S印hacryl S300柱(GE Healthcare)純化混合物。
[0112]將40微升25微克/毫升的SA-抗-TnI加入每個盤并在室溫下培育I小時。分析緩沖液為PBS，1% BSA, 0.1%吐溫20，pH為7.4。然后洗滌該盤3次。
[0113]用突光素標記親合力純化的山羊抗-TnI肽3 (Biospacific)如下:將I毫克抗體的1.8毫升PBS溶液和64微升熒光素-NHS (Invitrogen)的2毫克/毫升DMF溶液混合并在室溫下反應2小時，隨后在roio柱上純化。
[0114]實施例5.Cy5_抗FITC對Cy5_抗FITC-交聯Ficoll在肌鈣蛋白I免疫分析中的比較
[0115]將40微升樣品體積的O，10和50納克/毫升的肌鈣蛋白I加到盤中，并在室溫下培育I小時。在分析緩沖液中洗滌這些盤三次。向每個盤加入40微升10微克/毫升熒光黃標記的抗TnI肽3,并在室溫下培育25分鐘，隨后三次洗漆。將40微升10微升/毫升抗體的Cy5-抗FITC或Cy5-抗FITC-交聯的(cx)Ficoll加入這些盤并在室溫下培育25分鐘，隨后三次洗滌。接著測量每個盤表面上的Cy5熒光。(表1)。
[0116]表1:分析結果
[0117]
【權利要求】
1.用于在熒光分析中測量熒光信號的檢測系統，包括: 長度比寬度的縱橫比至少為5比I的探針，該探針具有遠端和近端，該近端具有和熒光標記結合的傳感表面； 用于直接發射激發光至該探針的傳感表面的光源； 朝向該傳感表面的會聚透鏡；和 用于檢測該發射熒光的光學探測器；其中這些會聚透鏡會聚此發射熒光并將其引導至該光學探測器。
2.根據權利要求1的系統，其中該探針梢端表面的直徑等于或小于5毫米。
3.根據權利要求1的系統，其中該探針是透明的。
4.根據權利要求3的系統，其中該探針的遠端是錐形和/或粗糙的，以減少不希望的反射。
5.根據權利要求3的系統，其中該光源被對準，以使該光束以大于此探針的數值孔徑角度的入射角投射在在該梢端表面上。
6.據權利要求1的系統，其中該探針是非透明的整體式的桿。
7.根據權利要求1的系統，其中該傳感表面被覆蓋以選自鋁，金，或銀的膜，該膜厚度為約50納米至約500微米。
8.根據權利要求1的系統，進一步包括含溶液的容器，其中該探針的近端被浸入該溶液中，并且該光源和會聚透鏡被安裝在該容器的底部上。
9.在液體樣品中檢測被分析物的方法，包括步驟: 獲取一探針，其具有被固定在該探針梢端的第一抗體，其中該梢端表面的直徑< 5毫米; 將該探針梢端浸入含液體樣品的容器中，該液體樣品含有被分析物； 在該樣品容器中上下移動該探針梢端并在該樣品容器中水平流動該試劑溶液，以將該被分析物和該第一抗體結合； 將該探針梢端浸入含試劑溶液的試劑容器中，該試劑溶液包括分子量至少為一百萬道爾頓，并且和至少5個第二抗體分子和至少25個熒光標記結合的聚合物； 在該樣品容器中上下移動該探針梢端并在該樣品容器中水平流動該試劑溶液，以在該探針梢端上形成該被分析物，該第一抗體，和該第二抗體之間的免疫復合體； 將該探針梢端浸入含洗液的洗滌容器中，和 通過檢測該探針梢端上的熒光信號檢測該形成的免疫復合體； 其中該第一抗體和該第二抗體是針對該被分析物的抗體。
10.在液體樣品中檢測被分析物的方法，包括步驟: 獲取一探針，其具有被固定在該探針梢端的第一抗體，其中該梢端表面的直徑< 5毫米; 將該探針梢端浸入樣品容器中，該樣品容器包含(i)具有被分析物的液體樣品和(ii)包括分子量至少為一百萬道爾頓，并且和至少5個第二抗體分子和至少25個熒光標記結合的聚合物的試劑溶液； 在該樣品容器中上下移動該探針梢端并在該樣品容器中水平流動該試劑溶液，以在該探針梢端上形成該被分析物，該第一抗體，和該第二抗體的免疫復合體；將該探針梢端浸入含洗液的洗滌容器中；和 通過檢測該探針梢端上的熒光信號檢測該形成的免疫復合體； 其中該第一抗體和該第二抗體是針對該被分析物的抗體。
11.在液體樣品中檢測被分析物的方法，包括步驟: (a)獲取一探針，其具有被固定化在該探針梢端的第一抗體，其中該梢端表面的直徑< 5毫米； (b)將該探針梢端浸入樣品容器中，該樣品容器含有具有被分析物的樣品溶液，在該樣品容器中上下移動此探針梢端并水平流動該樣品溶液； (C)將該探針梢端浸入含試劑溶液的試劑容器中，該試劑溶液包括和一結合配對的第一成員結合的第二抗體分子，在該試劑容器中上下移動該探針梢端并水平流動該試劑溶液； (d)將該探針梢端浸入含擴增溶液的擴增容器中，該擴增溶液包括分子量至少為一百萬道爾頓，并且和該結合配對的至少5個第二成員以及至少25個熒光標記結合的聚合物，在該擴增容器中上下移動該探針梢端并水平流動該擴增溶液，以在該探針梢端上形成該被分析物，該第一抗體，該第二抗體，和該結合配對的第一和第二成員的免疫復合體； (e)將該探針梢端浸入含第二洗液的第二洗滌容器中；和 (f)通過檢測該探針梢端上的熒光信號檢測形成的免疫復合體，其中該第一抗體和該第二抗體是針對該被分析物的抗體。
12.根據權利要求9，10，或11的方法，其中該梢端表面的直徑小于約2毫米。
13.根據權利要求11的方法，其中該結合配對的第一成員是生物素，并且該結合配對的第二成員是鏈霉親和素。
14.一種組合物，包括: 分子量至少為一百萬道爾頓的交聯Ficoll， 至少5個結合分子,和 至少25個熒光染料分子， 其中該結合分子和該突光染料分子被連接至該交聯Ficoll。
15.根據權利要求14的組合物，其中該熒光染料分子通過這些結合分子被間接連接至交聯 Ficollo
16.根據權利要求14的組合物，其中該結合分子是抗體分子或鏈霉親和素。
17.根據權利要求14的組合物，其中該熒光染料分子是芳基磺酸酯花青染料。
18.根據權利要求17的組合物，其中該芳基磺酸酯花青染料是Cy5。
【文檔編號】G01N33/543GK103604786SQ201310549211
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2010年3月2日 優先權日:2009年3月3日
【發明者】譚洪, 羅伯特·F·祖克, 譚玉山, 曹二華, 夏明 , 陳駿 申請人:萬邁醫療儀器有限公司