基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素a的方法
【專利摘要】本發明提供了一種基于熒光染料四甲基羅丹明（tetramethylrhodamine，簡稱TMR）標記的核酸適配體熒光各向異性（熒光偏振）檢測赭曲霉素A的方法，本發明將TMR修飾到赭曲霉素A適配體的特定位置上，赭曲霉素A的結合引起TMR標記的核酸適配體熒光各向異性（熒光偏振）值發生明顯改變，通過測定熒光各向異性（熒光偏振）值，可以實現對赭曲霉素A的定量檢測。本發明具有操作簡單、快速、易于高通量檢測、特異性好、靈敏度高、成本低的優點。
【專利說明】基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及真菌毒素檢測技術，具體屬于ー種基于核酸適配體檢測赭曲霉素A的熒光檢測技木。
【背景技術】
[0002]赭曲霉素A,英文名稱為Ochratoxin A,是ー種影響廣泛的真菌毒素，曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產生的二級代謝產物，產毒菌包括赭曲霉、疣孢青霉和碳黑曲霉等。赭曲霉素A可以直接污染谷類、飼料、水果、干果等農作物和多種食品，人和動物通過攝入污染的植物性食物而吸收進入體內，同時也可因赭曲霉素A在動物體內的蓄積作用而通過攝入動物性食物進入人體內。赭曲霉素A具有很強的腎臟毒性、免疫抑制毒性、神經毒性、致癌性、致畸性。高靈敏、高特異檢測赭曲霉素在食品安全和環境健康方面具有重要的意義。檢測方法目前主要包括薄層色譜、高效液相色譜、酶聯免疫分析、液質聯用等方法。這些方法往往需要昂貴的儀器和復雜的操作步驟。采用免疫抗體的分析方法需要利用特異性識別赭曲霉素A的抗體，抗體的制備往往成本高，制備重現性差，穩定性好，抗體保存和運輸的條件要求高。
[0003]核酸適配體(Aptamer)是通過SELEX技術篩選出的ー類能與目標分子特異性結合的寡聚核苷酸片段，對目標分子具有高度親和カ和專ー性的識別能力(Ellington, A.D.and Szostak, J.ff.Naturel990, 346, 818 - 822.Tuerk, C.and Gold, L.Sciencel990, 249，505 - 510.)。核酸適配體作為親和配體，與免疫抗體相比，具有顯著的優點:具有高的親和カ和高特異性；篩選制備方便；穩定性高；易于化學修飾。因此核酸適配體在分析檢測和傳感領域中顯示出很多優點，可以克服常用的免疫抗體的在穩定性和制備等的ー些局限，顯示出應用前景(Liu, J.;Cao, Z.;Lu, Y.Chem.Rev.2009，109，1948 -1998 ; Cho, E.J.; Lee, J.-ff.; Ellington, A.D.Annu.Rev.Anal.Chem.2009, 2, 241 - 264.) ? 已報道的利用核酸適配體檢測赭曲霉素A的方法往往比較復雜，需要采用合理的設計和分離等，如電化學傳感、親和色譜等(Yang, X.H.; Kong, ff.J.; Yang, M.H.; Zhao, M.; Ouyang, Z.Chin.J.Anal.Chem.2013, 41, 2977306 ;Hayat，A.; Paniel, N.; Rhouati, A.; Marty, J.-L? ;Barthelmebs, L.Food Control2012, 26, 401 - 415 ;Chapuis-Hugon, F.;duBoisbaudry, A.; Madru, B.;Pichon, V.Anal.Bioanal.Chem.2011, 400, 1199 - 1207.)。
[0004]本發明采用突光染料四甲基羅丹明(tetramethyIrhodamine,簡稱TMR)標記的核酸適配體建立了一種簡單方便的熒光各向異性(熒光偏振)法檢測赭曲霉素A的檢測技術。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法和相應的試劑，該方法具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高的優點。
[0006]本發明是利用赭曲霉素A與四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine,簡稱TMR)修飾的核酸適配體的選擇性結合，引起TMR修飾的核酸適配體的熒光各向異性(熒光偏振)改變，通過測定熒光各向異性(熒光偏振)的變化，實現對赭曲霉素A的定量檢測。(見圖1)。
[0007]本發明提供的一種突光染料四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine,簡稱TMR)標記的核酸適配體，其核酸適配體的核苷酸序列為SEQ ID NO:1 (5’ -GAT CGG GTG TGG GTGGCGTAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’);TMR標記到核苷酸序列SEQ ID NO:1的5，端開始的第10個T堿基上，或第8個T堿基上，或第19個T堿基上。
[0008]本發明提供的一種基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法，步驟包括:將TMR標記的核酸適配體，在結合緩沖溶液中與赭曲霉素A混合，溫育，測定TMR標記的核酸適配體的熒光各向異性，激發波長為560納米，發射波長為578納米，依據核酸適配體的熒光各向異性的變化，即可求得被測樣品中赭曲霉素A的濃度。
[0009]所述的結合緩沖溶液為:IOmMTris-HCl, 120mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.l%Tween20,pH8.50
[0010]與現有技術相比本發明具有如下的優點和效果:
[0011]本發明將熒光染料標記的核酸適配體用于對赭曲霉素A的特異性識別，充分利用核酸適配體的高穩定性、易制備、易引入功能團等方面的優點。熒光各向異性(熒光偏振)檢測技術具有操作簡單、靈敏、重現性好、無需分離、易實現高通量分析等優點。本發明只需要采用ー種熒光染料標記的適配體和相應的結合緩沖溶液，整個檢測過程簡単，容易操作，并不要求復雜的儀器設備。本發明采用核酸適配體作為識別試劑可以克服使用免疫抗體在制備和穩定性等方面的局限性。便于快速處理大批量樣品，易于商品化和實際應用，具有高通量、自動化分析的優勢。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0012]圖1采用TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)檢測不同濃度的赭曲霉素A
[0013]圖2采用TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)檢測赭曲霉素A的選擇性。
[0014]圖3采用TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)檢測在采用緩沖溶液50倍稀釋的葡萄酒中不同濃度的赭曲霉素A
【具體實施方式】:
[0015]實施例1:采用第10個T堿基上標記TMR的核酸適配體檢測不同濃度的赭曲霉素A (圖1)。
[0016]TMR標記的核酸適配體具有如下序列:5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAGCAT CGG ACA-3，TMR被標記到第10個T堿基上，相應的TMR標記的核酸適配體簡稱為T10-TMR-036。
[0017]在緩沖溶液(IOmMTris-HCl, 120mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.l%Tween20, pH8.5)中將T10-TMR-036 (濃度為27nM)與不同濃度的赭曲霉素A混合，在室溫下溫育40分鐘，然后測定T10-TMR-036的熒光各向異性，激發光波長560納米，發射光波長578納米。隨著赭曲霉素A (Ochratoxin A)的濃度的增加，T10-TMR-036的熒光各向異性值r逐漸降低，檢測限為3nM，檢測范圍3nM到3 y M，檢測相對標準偏差小于3%。
[0018]實施例2:考察基于TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)檢測赭曲霉素A的選擇性(圖2)。[0019]在緩沖溶液中(IOmMTris-HCl, 120mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.l%Tween20,pH8.5)將T10-TMR-036 (濃度為27nM)與不同的待測物混合，室溫下溫育40分鐘，測定T10-TMR-036的熒光各向異性變化Ar。只有赭曲霉素A (620nM)引起T10-TMR-036的熒光各向異性值的顯著降低，其它被測物質均不能引起T10-TMR-036的熒光各向異性值的顯著變化。圖2中(a)為不含有赭曲霉素A的緩沖溶液，(b)為620nM赭曲霉素 A,由(C)到(j)被測物質分別為 10 u M N-acetyl-L-phenylalanine (NAP) (c), 7 U Mwarfarin(d),9 u M7-amino-4-methylcoumarin (AMC) (e；,62 u M arginine(t；, 62 u Mphenylalanine(g)，62u M aspartic acid(h),62 U M serine(i),62 U M tyrosine リノ。
[0020]實施例3:采用TMR標記的核酸適配體(T10-TMR-036)在稀釋的紅葡萄酒中檢測赭曲霉素A (圖3)。
[0021]將紅葡萄酒采用緩沖溶液(IOmMTris-HCl, 120mM NaCl, 20mMCaC12, 0.l%Tween20, pH8.5)稀釋50倍，然后在稀釋的紅葡萄酒溶液中將T10-TMR-036 (濃度為27nM)與不同濃度的赭曲霉素A混合，在室溫下溫育40分鐘，然后測定T10-TMR-036的突光各向異性，激發光波長560納米,發射光波長578納米。隨著赭曲霉素A (OchratoxinA)的濃度的增加，T10-TMR-036的熒光各向異性值r逐漸降低。
【權利要求】
1.一種熒光染料四甲基羅丹明標記的核酸適配體，其特征在于，所述的核酸適配體的核苷酸序列為SEQ ID NO:1 ;熒光染料四甲基羅丹明標記到核苷酸序列SEQ ID NO:1的5’端開始的第10個T堿基上，或第8個T堿基上，或第19個T堿基上。
2.一種基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法，步驟包括:將權利要求1所述的熒光染料四甲基羅丹明標記的核酸適配體，在結合緩沖溶液中與赭曲霉素A混合，溫育，測定熒光染料四甲基羅丹明標記的核酸適配體的熒光各向異性，激發波長為560納米，發射波長為578納米，依據核酸適配體的熒光各向異性的變化，求得被測樣品中赭曲霉素A的濃度。
3.如權利要求2所述的ー種基于核酸適配體熒光各向異性檢測赭曲霉素A的方法，所述的結合緩沖溶液為:10mM Tris-HCl, 120mM NaCl, 20mM CaCl2, 0.l%Tween20, pH8.5。
【文檔編號】G01N21/64GK103575713SQ201310533285
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月1日 優先權日:2013年11月1日
【發明者】趙強, 呂琴 申請人:山西大學