一種膠類中藥及其制品中龜源性成分的液質聯用檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種膠類中藥及其制品中龜源性成分的液質聯用檢測方法，其利用烏龜基因組中具有特異性核苷酸序列或氨基酸序列的不同進行檢測，所述特異性氨基酸序列如SEQ.ID?No1所示。采用本發明的方法，能夠快速檢測膠類中藥中是否含有龜源性成分，從而分辨真偽，盡管膠類中藥中膠原蛋白多肽有一定水解與破壞，但本發明基于其主要成分膠原蛋白中的差異性多肽，其含量高，受破壞程度很小，可對膠類中藥及其制品中的龜源性成分進行鑒定。
【專利說明】一種膠類中藥及其制品中龜源性成分的液質聯用檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種龜源性成分的檢測方法，具體涉及一種膠類中藥及其制品中龜源性成分的檢測方法，屬于中藥檢測領域。
【背景技術】
[0002]龜甲，即龜科動物烏龜(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲，屬于傳統名貴中藥。據最新版的中國藥典記載，服用龜甲能夠滋陰潛陽，益腎強骨，養血補心。近些年來，隨著生物學水平的提高，龜甲的相關研究也不斷深入。有研究表明，龜甲粉末及其提取物不僅能夠增強肝功能、緩解壓力，還具有抗癌以及調節免疫抵抗力的功效。以龜甲為原料而制成的兩類產品龜苓膏和龜甲膠在整個中藥市場上占據著重要的位置。
[0003]據2010年版中國藥典記載，龜甲膠是以龜甲為原料，經水煎煮、濃縮制成的固體膠，性咸、甘、涼，歸肝、腎、心經。能夠滋陰、養血、止血，主要用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃、崩漏帶下等。長期服用龜甲膠還有利于增強機體自身調節，能夠延年益壽，也利于陰虛陽亢患者的身體康復。隨著生活水平的不斷提高，與阿膠類似，龜甲膠也成為人們進補的首選之一。
[0004]由于龜甲自身比較名貴，藥用價值顯著，并且龜肉也常常用于烹飪各類補品供人們食用，近些年來對各種龜類的捕殺現象十分嚴重，甚至于某些龜類品種瀕臨滅絕。因此，龜甲原料的供應非常有限，并且價格高昂，也直接影響到了龜甲膠的生產。在龜甲膠市場上存在某些假冒偽劣產品，其制作原料并非龜甲，而是由其他動物雜皮、碎骨代替，包括豬皮、牛皮，甚至病死動物之皮，臟皮、爛皮等。該類假冒偽劣產品一旦成形，無論外觀、色澤、氣味都與正品龜甲膠及其相似，真偽難辨。服用這些偽品不僅沒有任何療效，還很可能對身體有害，后果十分嚴重。
[0005]膠類中藥由動物的皮、骨、甲等熬制而成膠類物質，包括阿膠、龜甲膠、鹿角膠等，具有典型民族特色的傳統中藥。膠類中藥一般經長時間高溫蒸煮濃縮而成，主要成分非常相近且不同廠家的生產工藝存在差異，采用紅外、近紅外、X-衍射等方法對膠類中藥純品進行真偽鑒別常存在判斷不準確等情況。膠類中藥中龜源性成分的鑒別，已有學者從DNA角度進行鑒別，但只是定性，存有假陰性與假陽性現象，且操作較為復雜。有報道稱從多肽的角度利用質譜檢測膠類中藥中龜源性成分，結果準確可靠。目前，還沒有對膠類中藥的制品中進行溯源鑒定的方法。
[0006]膠類中藥中主要成分為膠原蛋白多肽，不同動物的膠原蛋白氨基酸序列存在差異，同一物種穩定存在的差異性多肽可作為該物種的特征性多肽，通過限制性內切酶酶切，利用質譜完全有可能準確對膠類中藥及其制品進行溯源鑒定與含量檢測。
【發明內容】
[0007]本發明針對上述問題，提供了一種膠類中藥及其制品中龜源性成分的檢測方法，該方法操作簡單，特征性強，靈敏度高，可用于膠類中藥及其制品中龜源性成分的鑒定。[0008]本發明的技術方案如下:
[0009]首先，本發明提供了一種膠類中藥及其制品中龜源性成分的檢測方法，其利用烏龜基因組中具有特異性核苷酸序列或氨基酸序列的不同進行檢測，所述特異性氨基酸序列如 SEQ.1D Nol 所示。
[0010]優選的，所述膠類中藥選自阿膠、黃明膠、龜甲膠或鹿角膠。
[0011]優選的，所述膠類中藥制品選自由相應膠類中藥制成的食品、保健品或藥品。
[0012]具體地，該方法包括如下步驟:
[0013]( I)選取烏龜基因組中特異性氨基酸序列或氨基酸序列，所述特異性氨基酸序列如 SEQ.1D Nol 所示;
[0014](2)將膠類中藥或其制品溶解，或提取其中的蛋白多肽類成分溶解，加入限制性內切酶進行酶切；
[0015](3)隨后放入液質聯用儀，以待檢測的陰性樣品為基質，加入步驟(I)所得氨基酸序列或龜甲膠純品作為對照，選擇該多肽的母離子m/z427.0及其子離子進行監測。
[0016]如果檢出該離子的保留時間與對照品一致，且其子離子與對照品的子離子一致，則所述膠類中藥或其制品含有龜源性成分；如果沒有與對照品保留時間一致的該離子，則不含有龜源性成分。
[0017]優選的，步驟(2)中所述溶解所用的試劑是質量百分數為1%、pH值8.0的NH4HCO3溶液；所述限制性內切酶為胰蛋白酶。
[0018]采用本發明的方法，能夠快速檢測膠類中藥中是否含有龜源性成分，從而分辨真偽，盡管膠類中藥中膠原蛋白多肽有一定水解與破壞，但本發明基于其主要成分膠原蛋白中的差異性多肽，其含量高，受破壞程度很小，可對膠類中藥及其制品中的龜源性成分進行鑒定。
[0019]本發明還涉及多肽，其氨基酸序列為Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Arg,及其由所述多肽與相應載體組成的組合物。此外，還包括所述多肽及其組合物在檢測膠類中藥及其制品中龜源性成分中的應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是合成多肽及純品膠多反應監測掃描模式下選擇離子對m/z427.0 — 457.2、554.3、611.3監測的質譜圖；
[0021]圖2是合成多肽及加入5%龜甲膠的混合膠多反應監測掃描模式下選擇離子對m/ζ427.0 — 457.2,554.3,611.3 監測的質譜圖；
[0022]圖3是合成多肽及龜甲膠制品(以龜鹿二仙口服液為例)在多反應監測掃描模式下選擇離子對m/z427.0 — 457.2,554.3,611.3監測的質譜圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。[0024]本發明中特異性肽鏈的獲得:
[0025]I材料和試劑
[0026]材料:純品膠包括阿膠、馬皮膠、黃明膠、豬皮膠、龜甲膠、鹿角膠，分別用驢皮、馬皮、牛皮、豬皮、龜甲、鹿角煎煮獲得。
[0027]試劑:碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純，購自中國食品藥品檢定研究院)、合成多妝 Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Arg。
[0028]2樣品的檢測前處理
[0029]( I)膠樣品酶解溶液的制備
[0030]取1.0g待測膠樣品于500mL量瓶中，加少量1%NH4HC03溶液，超聲使樣品完全溶解，用1%NH4HC03溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續濾液ImL加2mg/mL的胰蛋白酶溶液100 μ L，37 °C恒溫酶解6h。
[0031](2)合成多肽對照樣品酶解溶液的制備
[0032]稱取一定量的合成多肽，加入1%NH4HC03溶液(pH8.0)，搖勻，配制成濃度約為
0.3 μ g/mL,微孔濾膜過濾,備用。
[0033]3多肽的發現
[0034](I)離子的發現
[0035]取5 μ L酶解溶液放入液質聯用儀檢測。液相條件=C18反相色譜柱(2.1mmX 100mm,
1.8 μ m)，流動相A為0.1%甲酸溶液(體積分數)，流動相B為乙腈，流速0.3mL/min ;梯度洗脫:0~40min，2%~50%流動相B (這里的百分數表示從O分鐘到第40分鐘，流動B由2%線性漸變為50%、流動相A則由98%漸變為50%)。質譜條件:電噴霧正離子模式(ESI+)進行一級全掃，掃描范圍m/z400-m/zl000。
[0036]從各自膠樣品的質譜全掃圖中提取離子m/z427.0，通過對比發現在6.16min左右只有龜甲膠中含有該離子峰，而阿膠、馬皮膠、黃明膠、豬皮膠和鹿角膠中均沒有。通過多批次樣品的檢測與驗證表明上述結論正確。說明:可以通過檢測龜甲膠中的離子m/z427.0，來確定是否含有龜源性成分。
[0037](2)多肽的氨基酸序列初步推測
[0038]利用三重四極桿質譜，對上述找出的離子進行子離子掃描，確認該離子帶雙電荷，通過序列拼接，推測出多肽的部分序列。根據推測的部分序列，在NCBKhttp: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)數據庫進行序列檢索，結合其的特點(龜中有，而驢、馬、牛、豬或鹿中均沒有，且被胰蛋白酶酶切后分子量約為853.0)，找出該多肽可能的序列Gly-Leu-Ala-Gly-Prο-Gln-Gly-Pro-Arg0根據肽鏈的CID斷裂理論,計算該多肽可能的子離子如下:
[0039]
【權利要求】
1.一種膠類中藥及其制品中龜源性成分的檢測方法，其利用烏龜基因組中具有特異性核苷酸序列或氨基酸序列的不同進行檢測，所述特異性氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述膠類中藥選自阿膠、黃明膠、龜甲膠或鹿角膠。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述膠類中藥制品選自由相應膠類中藥制成的食品、保健品或藥品。
4.根據權利要求1?3任意一項所述的方法，其具體包括如下步驟: (O選取烏龜基因組中特異性氨基酸序列或氨基酸序列，所述特異性氨基酸序列如SEQ.1D Nol 所示; (2)將膠類中藥或其制品溶解，或提取其中的蛋白多肽類成分溶解，加入限制性內切酶進行酶切； (3)隨后放入液質聯用儀，以待檢測的陰性樣品為基質，加入步驟(I)所得氨基酸序列或龜甲膠純品作為對照，選擇該多肽的母離子m/z427.0及其子離子進行監測。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述溶解所用的試劑是質量百分數為1%、pH值8.0的NH4HCO3溶液；所述限制性內切酶為胰蛋白酶。
6.一種檢測膠類中藥及其制品中龜源性成分的分子標記物，該分子標記物的氨基酸序列如SEQ.1D Nol所示。
7.編碼權利要求6所述的蛋白的基因。
8.權利要求6所述的分子標記物在檢測膠類中藥及其制品中龜源性成分的應用。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包含藥學有效量的權利要求6所述的蛋白和一種或多種藥學上可接受的載體。
10.權利要求9所述的藥物組合物在檢測膠類中藥及其制品中龜源性成分的應用。
【文檔編號】G01N30/88GK103630644SQ201310528797
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】秦玉峰, 尤金花, 周祥山, 田守生, 嵇傳良, 郭尚偉, 段小波, 張云霞 申請人:山東東阿阿膠股份有限公司