用于農藥殘留速測的免疫阻抗生物傳感器檢測方法和檢測裝置制造方法
【專利摘要】本發明提供一種準確度好，靈敏度高的用于液體中農藥殘留檢測的免疫阻抗生物傳感器的檢測方法和裝置，該方法是把抗體交聯在工作電極上；測定固定抗體與不同濃度標準農藥作用后阻抗值，制定標準曲線，再測量待測農藥與固定抗體作用后阻抗值，與標準曲線比較而得出待測農藥中的農藥含量。該裝置包括注射泵、轉盤、電解槽、排出泵、工作電極、對電極和參比電極；轉盤內有電解液通道、磷酸鹽緩沖液通道、待測樣本通道、電極清洗通道、電極預處理通道、抗體注入通道；各通道入口和出口分別位于轉盤同一圓周上；轉盤繞中心轉動時，一通道入口和出口同時分別與注射泵出口、電解槽入口相通；電解槽出口與排出泵入口相通。該裝置可反復使用，重復性好，能保證檢測的一致性。
【專利說明】用于農藥殘留速測的免疫阻抗生物傳感器檢測方法和檢測裝置
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種對農藥殘留速測的免疫阻抗生物傳感器檢測方法和檢測裝置。
【背景技術】
[0002]各國政府不斷加強農藥殘留量的監測工作，制定的標準越來越嚴格。農藥殘留檢測和定量分析的常規方法是色譜、色譜-質譜聯用等。這些方法的測定結果準確可靠，是當前農殘分析的主流技術。但這些方法也存在儀器較昂貴，前處理時間長、過程煩瑣等不足，只適合于在專業實驗室中使用。目前，國內市場上的農藥速測方法以酶抑制法應用較多，它是利用農藥對某些特定酶，特別是膽堿酯酶的抑制作用，通過對比檢測水解后的底物或水解產物，以比色或分光光度分析的方法判定酶是否被抑制，從而測定農藥殘留。這種方法快速、簡單、方便，但也存在如下不足:
1、只能檢測農藥的總殘留量，不能夠區分具體農藥的種類；
2、顯色不穩定，容易受周圍環境、溫度等影響，給判斷帶來誤差；
3、檢測精密度不高，易出現假陽性、假陰性結果；
4、酶反應條件苛刻,對操作要求高；
中國專利ZL 01253887.6公開了探測農藥殘留用的量熱式生物傳感器，它是通過測量流經固定化酶柱的待測液體的溫度變化來檢測待測液體中的農藥含量。其不足之處在于:結構復雜，所用的固定化酶柱要求高。國際上研究快速檢測農藥的生物傳感器論文在也有發表，主要還是基于酶生物傳感器，未見有用于檢測農藥的免疫阻抗生物傳感器。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種用于液體中農藥殘留檢測的免疫阻抗生物傳感器的檢測方法，它可以快速測定目標農藥在樣品中的殘留量，準確度好，靈敏度高。
[0004]本發明的用于農藥殘留速測的免疫阻抗生物傳感器檢測方法，使用免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，免疫阻抗生物傳感器檢測裝置包括與阻抗分析儀電連接的工作電極、對電極和參比電極伸入到電解槽內；阻抗分析儀與計算機相連；該檢測方法包括下述步驟:
a.電極清洗
以清洗物質對工作電極、對電極和參比電極進行清洗；
b.電極預處理
以硅烷溶液對電極處理；再以甲醇和水清洗電極去除非特異性吸附；
c.抗體固定
把農藥抗體溶液注入電解槽內，使抗體通過交聯固定在工作電極上；以磷酸鹽緩沖液和去離子水，對電極進行清洗；
d.阻抗測試
把待測液體樣本注入電解槽，使得待測液體樣本與電極上的固定抗體發生特異性反應；然后以磷酸鹽緩沖液通清洗電極，再把含有[Fe (CN) 6] 3_或者[Fe (CN) 6] 4_的電解液注入電解槽內，然后以阻抗分析儀和計算機檢測并計算出電解液的法拉第阻抗；
e.數據分析
對不同濃度的農藥標準溶液，分別按照上述a-d步驟，得到與各濃度的農藥相應的法拉第阻抗，制定農藥濃度與拉第阻抗的標準曲線；將待測液體樣本按照上述a-d步驟得到的法拉第阻抗，根據標準曲線判斷待測液體樣本中的農藥濃度。
[0005]上述的檢測方法，步驟a中，對電極清洗時，分別以丙酮、乙醇和去離子水進行清洗，再以1:1:5 (ν/ν) Η202/ΝΗ40Η/Η20溶液清洗，10分鐘后，再以去離子水沖洗，后通入氮氣干燥；
步驟b中，硅烷溶液為3-氨丙基三乙氧基硅烷；
步驟c中，含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中含有體積比為1%的牛血清白蛋白，磷酸鹽緩沖液的PH值為7.4;
步驟d中，電解液中，[Fe(CN)6] 3_與[?6(0的6] 4_的濃度比1:1;法拉第阻抗測試頻率IHz -1OOkHz，振幅為 ±5mV0
[0006]本發明的有益效果:本發明的檢測方法是以流動注射的方式，將農藥抗體固定在工作電極上，作為生物傳感器的敏感元件。固定抗體與溶液中的農藥抗原發生特異性結合后，在電極表面形成“抗原一抗體”的復合物，改變雙電層的電荷轉移和表面層的電阻。通過測定固定抗體與不同濃度標準農藥作用后系統的阻抗值的變化，制定標準曲線，再測量待測農藥與固定抗體作用后的阻抗值，并與標準曲線比較，從而得出待測農藥中的目標農藥的含量。本發明的檢測方法快速、簡單、方便，同時準確度高，靈敏度高，重復性好。
[0007]本發明同時提供一種為在上述檢測方法中使用的免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，它結構簡單、制作方便、成本低廉，可以反復使用，重復性好，能夠保證檢測的一致性。
[0008]本發明的在上述檢測方法中使用的免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，包括注射泵、轉盤、電解槽、排出泵；與阻抗分析儀電連接的工作電極、對電極和參比電極伸入到電解槽內；阻抗分析儀與計算機相連；轉盤內具有沿著徑向延伸的6條通道:電解液通道、磷酸鹽緩沖液通道、待測樣本通道、電極清洗通道、電極預處理通道、抗體注入通道；6條通道的入口和出口分別位于轉盤的同一圓周上；當轉盤繞中心轉動時，一通道的入口和出口同時分別與注射泵的出口、電解槽的入口相通；電解槽的出口與排出泵的入口相通。
[0009]所述的免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，還包括與排出泵的出口相通的廢液池。
[0010]所述的免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，工作電極為盤陣微電極或叉指式帶列微電極。
[0011]本免疫阻抗生物傳感器檢測裝置的有益效果:使用時，均使用注射泵泵入各種物質；而且通過轉盤的轉動，能夠使得不同的通道分別與注射泵和電解槽相通，以通過不同的通道注入不同的物質，保證檢測步驟的一致性和重復性，使用檢測的結果準確性高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1是免疫阻抗生物傳感器檢測裝置的示意圖；
圖2是免疫阻抗生物傳感器檢測裝置的原理框圖。
[0013]圖3是電解槽的等效電路圖。[0014]圖4是對硫磷農藥濃度一阻抗標準曲線。
【具體實施方式】
[0015]參見圖1、2所示的用于農藥殘留速測的免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，由驅動系統、進樣系統、反應系統、檢測系統、控制系統組成。驅動系統由注射泵1，排出泵10組成，進樣系統由轉盤2、導管3組成，電解槽4的反應系統，檢測系統由工作電極5，對電極6，參比電極7組成，控制系統由阻抗分析儀8，計算機9組成，從電解槽的出口流出的廢液經排出泵10排入廢液池11。工作電極可以為叉指式帶列微電極或者盤陣微電極(圓盤電極)，對電極為鉬電極，參比電極為Ag/AgCl電極。
[0016]與阻抗分析儀電連接的工作電極5、對電極6和參比電極7伸入到電解槽內；阻抗分析儀與計算機相連。轉盤2內具有沿著徑向延伸的6條通道:電解液通道A、磷酸鹽緩沖液通道B、待測樣本通道C、電極清洗通道D、電極預處理通道E、抗體注入通道F ；6條通道的入口位于靠近轉盤中心部的同一內圓的圓周上；注射泵的出口與所述6條通道入口所在內圓的圓周密封接觸。6條通道的出口位于轉盤外周的同一圓周上。導管的進口與所述6條通道出口所在外圓的圓周密封接觸。導管的出口與電解槽的入口相通；電解槽的出口通過排液泵與廢液池相通。口當轉盤繞中心轉動時，6條通道中任一通道的入口和出口可以同時分別與注射泵的出口、導管的入口相通。
[0017]對農藥殘留速測的免疫阻抗生物傳感器檢測方法，是對電極經過預處理后，固定農藥抗體，加樣檢測得到交流阻抗譜，進行等效電路擬合，通過比較不同濃度農藥作用的電荷轉移電阻Ret值，制定標準曲線；測得待測農藥作用下的電荷轉移電阻Ret值，并與標準曲線比較，判定待測物中的目標農藥殘留濃度。其具體方法如下:
1、建立對硫磷農藥的濃度一阻抗標準曲線。
[0018]a.電極清洗
以注射泵在2mL/min的速度下分別把4 mL丙酮、乙醇和去離子水通過電極清洗通道D注入電解槽內并通過排出泵排出，再以注射泵把4mL的1: 1:5 (v/v) H2O2 /ΝΗ40Η/Η20混合溶液通過電極清洗通道D注入電解槽內并排出，10分鐘后，再以注射泵注入去離子水徹底沖洗并排出，后通入氮氣干燥；對工作電極、對電極和參比電極進行清洗并干燥。
[0019]b.電極預處理
以注射泵把4mL 2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液通過電極預處理通道E注入電解槽內并排出，處理電極工作；再以注射泵分別把甲醇和水清洗通過電極清洗通道注入電解槽內并排出，清洗電極，去除非特異性吸附；
c.抗體固定
以注射泵把lmg/mL濃度的對硫磷多克隆抗體溶液4mL,在0.5mL/min的速度下,通過抗體注入通道注入電解槽內并排出，使抗體通過交聯固定在工作電極上；20分鐘后以注射泵把含1%血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(PH值為7.4)通過磷酸鹽緩沖液通道注入電解槽內并排出，以注射泵把去離子水通過電極清洗通道注入電解槽內并排出，對電極進行清洗，去除未綁定的抗體。
[0020]d.阻抗測試
以注射泵把不同濃度的農藥標準溶液通過待測樣本通道注入電解槽并排出，使得農藥標準溶液與電極上的固定抗體發生特異性反應；30分鐘后以注射泵把磷酸鹽緩沖液通過磷酸鹽緩沖液通道注入電解槽內并排出，再以注射泵把0.01 mol/L的[Fe (CN)6]3_/4_ (1:1)磷酸鹽電解液通過電解液通道A泵入電解槽內，然后以阻抗分析儀和計算機檢測電解液的交流阻抗譜，阻抗分析儀的采樣頻率范圍lHz-100 kHz，振幅為±5 mV。對交流阻抗譜采用圖3所示的等效電路擬合，計算出與農藥濃度相應的法拉第阻抗。圖3中，Ret表示電荷轉移電阻，Rt表示溶液電阻，Cdl表示雙層電容，CPE表示常相位角元件，代表氧化還原探針的屬性。
[0021]e.數據分析
根據得到的與各濃度的農藥相應的法拉第阻抗，制定農藥濃度與拉第阻抗的標準曲線,如圖4所示。圖4中，縱坐標表示電荷轉移電阻,單位歐姆；橫坐標表示對硫磷農藥的濃度，單位納克/毫升。
[0022]2、對硫磷農藥的快速檢測
步驟a、b、C、d與上述相同，只不過以待測對硫磷農藥代替農藥標準溶液，計數出與待測對硫磷農藥的農藥濃度相應的法拉第阻抗。然后以把待測對硫磷農藥的法拉第阻抗與標準曲線比較，計算待測對硫磷農藥中的農藥濃度。
[0023]為了達到傳感器重復使用的目的，測試完后，在通過磷酸鹽緩沖液通道泵入磷酸鹽緩沖液沖洗，再通過電極清洗通道泵入蛋白質去垢劑，去除電極表面結合的抗原抗體復合物。
[0024]本發明可以快速測定目標農藥在樣品中的殘留量，準確度好，靈敏度高，可以重復使用。
[0025]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。
【權利要求】
1.用于農藥殘留速測的免疫阻抗生物傳感器檢測方法，使用免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，免疫阻抗生物傳感器檢測裝置包括與阻抗分析儀電連接的工作電極、對電極和參比電極伸入到電解槽內；阻抗分析儀與計算機相連；其特征在于:該檢測方法包括下述步驟: 電極清洗 以清洗物質對工作電極、對電極和參比電極進行清洗； 電極預處理 以硅烷溶液對電極處理；再以甲醇和水清洗電極去除非特異性吸附； 抗體固定 把農藥抗體溶液注入電解槽內，使抗體通過交聯固定在工作電極上；以磷酸鹽緩沖液和去離子水，對電極進行清洗； 阻抗測試 把待測液體樣本注入電解槽，使得待測液體樣本與電極上的固定抗體發生特異性反應；然后以磷酸鹽緩沖液通清洗電極，再把含有[Fe(CN)6] 3_或者[Fe(CN)6] 4_的電解液注入電解槽內，然后以阻抗分析儀和計算機檢測并計算出電解液的法拉第阻抗； 數據分析 對不同濃度的農藥標準溶液，分別按照上述a-d步驟，得到與各濃度的農藥相應的法拉第阻抗，制定農藥濃度與拉第阻抗的標準曲線；將待測液體樣本按照上述a-d步驟得到的法拉第阻抗，根據標準曲 線判斷待測液體樣本中的農藥濃度。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于: 步驟a中，對電極清洗時，分別以丙酮、乙醇和去離子水進行清洗，再以1: 1:5 (v/v)H2O2 /ΝΗ40Η/Η20溶液清洗，10分鐘后，再以去離子水沖洗，后通入氮氣干燥； 步驟b中，硅烷溶液為3-氨丙基三乙氧基硅烷； 步驟c中，含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中含有體積比為1%牛血清白蛋白，磷酸鹽緩沖液的PH值為7.4; 步驟d中，電解液中，[Fe(CN)6] 3_與[?6(0的6] 4_的濃度比1:1;法拉第阻抗測試頻率IHz-1OOkHz，振幅為 ±5mV0
3.在權利要求1或2的檢測方法中使用的免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，其特征在于:它包括注射泵、轉盤、電解槽、排出泵；與阻抗分析儀電連接的工作電極、對電極和參比電極伸入到電解槽內；阻抗分析儀與計算機相連；轉盤內具有沿著徑向延伸的6條通道:電解液通道、磷酸鹽緩沖液通道、待測樣本通道、電極清洗通道、電極預處理通道、抗體注入通道；6條通道的入口和出口分別位于轉盤的同一圓周上；當轉盤繞中心轉動時，一通道的入口和出口同時分別與注射泵的出口、電解槽的入口相通；電解槽的出口與排出泵的入口相通。
4.如權利要求3所述的免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，其特征在于:它還包括與排出泵的出口相通的廢液池。
5.如權利要求3所述的免疫阻抗生物傳感器檢測裝置，其特征在于:工作電極為盤陣微電極或叉指式帶列微電極。
【文檔編號】G01N33/543GK103543180SQ201310520942
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】蔣雪松, 周宏平, 許林云, 茹煜 申請人:南京林業大學