一種微流控芯片及基于微流控芯片的細胞計數方法
【專利摘要】本發明屬于細胞計數與分類儀器，具體的說是一種微流控芯片及基于微流控芯片的細胞計數方法。本發明通過在微流控芯片設置并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進樣口和出樣口以及多個捕獲細胞的微腔室；在進樣孔口處打孔，出樣口處不打孔。在細胞計數過程中，通過事先將微通道抽成負壓狀態，使細胞樣品自動進入微通道。本發明具有制作簡單，體積小、便于使用、樣品消耗量少、計數方便且通量高等特點，可以很好的滿足臨床需求。
【專利說明】一種微流控芯片及基于微流控芯片的細胞計數方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于細胞計數與分類儀器，具體的說是一種微流控芯片及基于微流控芯片的細胞計數方法。
【背景技術】
[0002]細胞計數在生物領域的科學研究和日常醫學診斷過程中都具有重要意義。在癌癥治療藥物的研發中，常需考察治癌藥物對目標細胞的作用效果，需定量對細胞進行計數；醫院內為對病人進行疾病的排查，需進行血常規的檢查，所以需要對血液中各類細胞進行計數與分類；為考察癌癥病人是否存在癌細胞擴散，也需對其血液內的癌細胞進行計數；有些感染了結核的病人并無癥狀顯示，為了確診其是否被感染，也需對其血液中結核桿菌的數目進行計數。細胞計數對于白血病患者顯得尤為重要，為準確得知化療過程中患者體內的造血骨細胞的數量以隨時對治療方案進行修正，醫生需多次對患者血液中的細胞進行計數。據以上所述，細胞尤其是與疾病或癌癥有關的細胞的計數顯得異常重要，而發展出能量高、計數準確且易于操作的便攜式細胞計數器顯得尤為重要。
[0003]目前已有一些細胞計數裝置，比如流式細胞儀，通過細胞的熒光信號或非熒光的散射信號對細胞進行分選和計數，這種方法能量大，且能自動進行計數，但是儀器體積大，價格高，專業性強，所以它的通用性受到很大的限制。除了流式細胞儀，還有細胞計數板也可用作細胞計數，但是這種方法計數速度很慢，消耗人力資源大。因此，目前已有的這些細胞計數方法難以滿足當下各領域特別是臨床領域的需求。
【發明內容】
[0004]針對【背景技術】的不足，本發明通過在微流控芯片設置并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進樣口和出樣口以及多個捕獲細胞的微腔室；在進樣孔口處打孔，出樣口處不打孔。在細胞計數過程中，通過事先將微通道抽成負壓狀態，使細胞樣品自動進入微通道。本發明具有制作簡單，體積小、便于使用、樣品消耗量少、計數方便且通量高等特點，可以很好的滿足臨床需求。
[0005]本發明的目的是提供一種高通量的細胞計數與分類芯片，具有樣品消耗量少、通量高且操作簡易的特點。
[0006]本發明的技術方案是:一種微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS與基片鍵合在一起，其特征在于:所述的PDMS上包含有并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進樣口和出樣口以及多個捕獲細胞的微腔室；在進樣孔口處打孔，出樣口處不打孔。
[0007]如上所述的微流控芯片，其特征在于:所述的微流控芯片經真空過程后將整個產品?封。
[0008]如上所述的微流控芯片，其特征在于:所述的基片為玻璃基片。
[0009]本發明還公開了一種基于微流控芯片的細胞計數方法，包括以下步驟:
步驟一、為目標細胞做熒光標記；步驟二、制作細胞樣品；
步驟三、細胞進樣；
步驟四、圖片獲取及細胞計數與分類；
其特征在于:所述步驟三細胞進樣的過程為:將細胞樣品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成負壓狀態，因此細胞會自動進樣至微通道中，大部分細胞會停留在微通道的微腔室中。
[0010]如上所述的細胞計數方法，其特征在于:所述的制作細胞樣品具體為:采用離心的方法去除上清液，再在離心管中加入磷酸緩沖液，充分吹打后離心，去除上清液，再加入少量磷酸緩沖液即可制得細胞樣品
如上所述的細胞計數方法，其特征在于:所述的步驟一是通過連接有熒光染料的抗體與細胞表面抗原反應后，離心去除過量的抗體；此處針對不同細胞可以選擇不同抗體，且樣品細胞有多類時，可以同時選擇幾種帶熒光標記的抗體。
[0011]本發明的技術效果體現在:本發明的微流控芯片具有制作簡單，體積小、便于使用等特點。本發明的方法用連接有熒光染料的抗體對目標細胞進行選擇性標記，特異性強；細胞進樣時，由于微通道已被抽成真空狀態，因此進樣口的細胞樣品會自動進樣；微通道中體積小，所樣品消耗非常少；CCD拍照后可通過軟件對目標細胞進行自動計數，計數效率高；通過不同熒光標記的抗體可以同時對細胞進行計數和分類。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1微流控芯片掩膜示意圖，白色部分為透光區域，黑色部分為不透光區域；
圖2 (A)為微流控芯片陽模加工勻膠前烘步驟示意圖；
圖2 (B)為微流控芯片陽模加工曝光步驟示意圖；
圖2 (C)為微流控芯片陽模加工后烘步驟示意圖；
圖2 (D)為微流控芯片陽模加工堅模步驟示意圖；
圖3為微流控芯片示意圖；
圖4 (A)所拍細胞明場圖；
圖4 (B)所拍細胞暗場圖。
【具體實施方式】
[0013]名稱解釋:PDMS為聚二甲基硅氧烷的英文縮寫 PGMEA為丙二醇甲醚醋酸酯的英文縮寫
下面結合附圖對本發明做進一步地詳細說明。
[0014]本發明所述的高通量細胞計數與分類方法，包括以下步驟:
第一步、為目標細胞做熒光標記。將一種或多種連接有熒光染料的抗體加至含有一種或多種目標細胞懸液的離心 管中，充分混合均勻，常溫下孵育10分鐘。
[0015]第二步、采用離心的方法去除上清液，再在離心管中加入磷酸緩沖液，充分吹打后離心，去除上清液，再加入少量磷酸緩沖液即可制得細胞樣品。本步驟中的離心方法為:離心時間5分鐘，每分鐘轉速1000轉，后續步驟中將離心時間和轉速在離心步驟中用括號標注。[0016]第三步、將細胞樣品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成負壓狀態，因此細胞會自動進樣至微通道中，大部分細胞會停留在微通道的微腔室中，即細胞完成進樣。
[0017]微流控芯片的PDM S具有透氣性，如果將整個PDM S放在真空干燥器，抽成真空后，整個PDMS層一直處于負壓狀態。拿出該產品放置在一般的環境中，該產品還能保持5分鐘至10分鐘的負壓，只要此時將細胞樣品滴加至微流控芯片的入口，細胞便會自動進樣至微通道中。
[0018]第四步、進樣后，將芯片靜置約10分鐘，即可在顯微鏡下用C⑶進行熒光照片的拍攝。目標細胞帶有熒光，在熒光照片上體現為亮點，而非目標細胞不會呈現亮點；若同時存在多類目標細胞，則可通過選取不同濾片組對相應目標細胞進行熒光照片的采集。最后采用軟件例如Image Pro Plus對目標細胞(即圖片中的亮點)進行自動計數，然而根據成像區域的體積和成像區域內的目標細胞數目即可算出目標細胞的濃度。
[0019]下面通過一個具體的實施方式對本發明做進一步的說明。
[0020]實例1:檢測人血中自免細胞的數目。
[0021]人血中含有的白細胞內有部分是自免細胞，且人與人之間自免細胞所占白細胞比例有較大差異，對自免細胞數目的測定非常重要。自免細胞表面有CD4抗體，可用連接有熒光素的CD4抗體對其自免細胞進行特異性標記，然后根據熒光場下圖片中的亮點個數對自免細胞進行計數。
[0022]1.細胞樣品制備
將取到的血液樣本去除紅細胞，用磷酸緩沖液緩沖液(pH 7.4)懸浮剩下的白細胞。取出200微升細胞液，離心(1000轉每分鐘，離心5分鐘)，去除上清液；加入50微升磷酸緩沖液緩沖液，加入10微升標記物(熒光素連接的⑶4抗體),混勻,常溫孵育15分鐘后，離心(1200轉每分鐘，離心10分鐘)，去除上清液；加入I毫升磷酸緩沖液緩沖液，輕輕混勻，離心(1200轉每分鐘，離心10分鐘)，去除上清液；再加入200微升磷酸緩沖液緩沖液制得最后的細胞樣品。
[0023]2.微流控芯片及其制作工藝。
[0024]本發明的微流控芯片包括PDMS和玻璃基片，PDMS與玻璃基片鍵合在一起，所述的PDMS上包含有并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進樣口和出樣口以及多個捕獲細胞的微腔室；在進樣孔口處打孔，出樣口處不打孔；在進樣前將陣列式微通道抽成真空狀態；進樣時，滴加于進樣口的細胞即可自動進入微通道中。
[0025]為了便于微流控芯片的使用，在產品制作完成后，將其放置在真空干燥器中，抽成真空后，使整個PDM S層一直處于負壓狀態，然后將整個產品密封。使用時，只要撕開密封袋，將細胞樣品滴加至微流控芯片的入口，細胞便會自動進樣至微通道中。
[0026]2.1掩膜制作
使用AutoCAD軟件對掩模圖形進行設計，采用25400 dpi激光打印機將設計好的掩模圖形打印在菲林膠片上，本研究PDMS陣列式細胞檢測裝置使用的AutoCAD掩模圖形如圖1所示，圖中黑色部分為不透光區域，白色部分為透光區域即微通道區域，包括六條并列的微通道，每條微通道含有六個微腔室。掩膜的功能在于區分圖形區和非圖形區，在光照時實現光刻膠的局部曝光，從而將掩模設計的圖形轉移到光刻膠層。本實施例中的光刻膠選取SU-8光刻膠。
[0027]2.2基片清洗及勻膠
如附圖2 (A)所示，勻膠之前，預備涂光刻膠的硅片(直徑為3英寸)需先經丙酮(除油月旨、手印等)、Piranha溶液(濃硫酸與過氧化氫體積比為3:1)和超純水的嚴格清洗，并采用高溫(150攝氏度I小時h或200攝氏度20分鐘)烘干以除去硅片上的吸附水。在硅片中心滴加3毫升的SU-8光刻膠，后置于勻膠機轉盤的中心位置，使硅片中心與轉盤中心重合，通過真空抽吸固定硅片，采用勻膠程序(600轉每分鐘18秒，然后1500轉每分鐘60秒)勻膠，其對應SU-8膠厚度為50微米。勻膠后，涂覆光刻膠的硅片需要平整放置至少I小時以上進行前置，利用SU-8光刻膠的自平整特性，消除勻膠過程中造成的細小坑洼或波紋，以使SU-8光刻膠層均勻、平整而無氣泡。
[0028]整個陽模的制作過程(包括勻膠、前烘、曝光、后烘、堅模五個工藝步驟)在裝有黃光特種燈管(濾除可見光中的藍光和紫外的波長)的百級超凈間(每立方英尺空氣中直徑大于等于0.5微米的塵粒數小于100個)內進行。
[0029]2.3 前烘
如附圖圖2 (A)所示，采用以下加熱程序對SU-8光刻膠進行前烘:從室溫以2攝氏度每分鐘的速度升溫至65攝氏度，在65攝氏度的溫度下保持15分鐘，再以2攝氏度每分鐘的速度升溫至95攝氏度，在95攝氏度的溫度下保持120分鐘后，以2攝氏度每分鐘的速度降溫至室溫。前烘是SU-8陽模制作過程中非常重要的一個環節。前烘的作用是除去光刻膠內的大部分溶劑，同時使光敏分子在垂直方向上獲得高斯分布，增加光刻膠在基片上的粘著力。前烘不足易導致光刻膠發軟，在曝光時粘附掩模，從而污染菲林膠片，且最終不能獲得精細圖形，甚至在顯影時漂膠；前烘過度則會導致顯影時間增長，使得圖形在Z軸上有歧視效應。一般來說前烘應該緩慢升溫，使膠內分子能夠穩定擴散。
[0030]2.4 曝光
如附圖2 (B)所示，通過光刻可以將掩模上的圖形轉移至光刻膠上。光刻的原理為:經過前置和前烘后，光敏分子均勻分布在光刻膠層，經過紫外光i線(365納米)的照射后，光引發劑吸收光子發生光化學反應，生成強酸，在后烘過程中作為酸性催化劑引發SU-8光刻膠的交聯反應，每一個環氧基都能與同分子或不同分子的其他環氧基反應。交聯形成的致密交聯網絡結構在其后的顯影過程中變得惰性而不能被顯影液溶解，微結構部分由此在膠內與非結構部分區分開來。本研究采用90 s的時間進行光刻膠的曝光。
[0031]2.5 后烘
如附圖2 (C)所示，采用以下的加熱程序對硅片進行后烘:從室溫以2攝氏度每分鐘的速度升溫至65攝氏度，在65攝氏度的溫度下保持15分鐘，再以2攝氏度每分鐘的速度升溫至95攝氏度，在95攝氏度的溫度下保持40分鐘后，以2攝氏度每分鐘的速度降溫至室溫。后烘是為了進一步除去光刻膠中的溶劑，促進化學交聯反應的進行，后烘充分能使曝光區域內交聯反應充分，從而在顯影中獲得垂直的微結構。
[0032]2.6顯影和定影
顯影和定影是在硅片上生成圖形的關鍵步驟。顯影液為PGMEA，定影液為異丙醇，顯影時間為80秒。顯影和定影的具體操作為:輕輕搖動顯影容器使硅片上的光刻膠被均勻溶解，采用異丙醇定影，若顯影不完全，在硅片上將會呈現白色沉淀物，將其用PGMEA沖洗掉，繼續顯影，直至再次用異丙醇沖洗時不再出現白色物質，即表明顯影完全，用氮氣槍將硅片吹干后，可以很明顯的看到設計的圖形。顯影對于光刻膠來說是一個從外至內的過程，成功顯影的結果應該具有垂直而精細的邊壁結構。
[0033]2.7 堅膜
如附圖2 (D)所示，將顯影后具有微結構的硅片置于真空烘箱中，135攝氏度的溫度下靜置120分鐘，自然冷卻，加固交聯后的PGMEA在基片上的粘附，此處得到的微結構稱為陽模。
[0034]上述2.2至2.7的加工過程示意圖如圖2 (A)至圖2 (D)所示。
[0035]2.8 PDMS 固化
首先將PDMS預聚體(二甲基硅氧烷單體)和固化劑按照10:1的比例攪拌混勻，置于真空干燥器中真空脫氣后，倒在有圍堰的堅膜后的硅片上，置于熱平板上65攝氏度溫度下烘烤4小時后，PDMS將通過交聯反應形成有彈性的透明固體。將PDMS從SU-8陽模上剝離下來，在入口處用針頭打孔，從而得到有微通道結構的PDMS基片。將玻璃片與PDMS鍵合即得到PDMS陣列式細胞檢測裝置。
[0036]2.9玻璃基片處理
將玻璃基片先用丙酮超聲清洗30分鐘后(除油脂、手印等)，用超純水漂洗后加入Piranha溶液80攝氏度溫度下超聲清洗30分鐘，再用超純水超聲清洗后，置于熱平板上150攝氏度溫度下烘烤I小時后，除去基片上的吸附水，冷卻至室溫。
[0037]2.10 鍵合
打開等離子體清洗器清洗空腔，清除腔內雜質，并獲得穩定氧氣流；將需要鍵和的PDMS和玻璃基片平放入腔內，待鍵合的表面朝上放置；抽真空，打開高頻電源至600伏，當達到所需真空度時清洗機會起輝(紫紅色)，氧氣流量為600毫升每分鐘，清洗60秒；取出、對齊、貼合后，置于150分鐘熱平板上靜置30分鐘，使PDMS與玻璃基片鍵合在一起，得到陣列式微流控芯片。
[0038]2.11微通道真空處理
將加工好的微流控芯片放置于真空干燥器中，用外設真空泵抽真空20分鐘，然后取出微流控芯片，在入口處貼上膠帶以保持微通道內負壓狀態。
[0039]3.細胞進樣
用移液槍取5微升上述制好的細胞樣品滴加至微通道的入口處，由于通道中負壓的存在，細胞樣品會自動流進微通道中。進樣后讓將微流控芯片靜置10分鐘。
[0040]4.細胞成像
將進樣好的微流控芯片置于倒置熒光顯微鏡的載物臺上，在明場和熒光場下，采用20倍物鏡，對微通道中同一位置的細胞進行明場和暗場圖片的拍攝。其中，暗場(即熒光圖片)用汞燈作為光源對熒光素進行激發，濾片組為:激發濾片460-490納米，二色鏡505納米，發射濾片510-550納米。
[0041]由于目標細胞標記了熒光素，在暗場下為亮點。通過軟件Image Pro Plus計算暗場(如圖4 (B))下亮點的個數，對比明場(如圖4 (A))下細胞的總個數，就可得知所拍圖片中目標細胞占細胞總數的比例；另外，根據成像區域的體積其區域內目標細胞的個數可以推算出細胞樣品內目標細胞的個數或濃度。[0042]本領域的技術人員容易理解，以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS與基片鍵合在一起，其特征在于:所述的PDMS上包含有并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進樣口和出樣口以及多個捕獲細胞的微腔室；在進樣孔口處打孔，出樣口處不打孔。
2.如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述的微流控芯片經真空過程后將整個產品密封。
3.如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述的基片為玻璃基片。
4.一種基于微流控芯片的細胞計數方法，包括以下步驟: 步驟一、為目標細胞做熒光標記； 步驟二、制作細胞樣品； 步驟三、細胞進樣； 步驟四、圖片獲取及細胞計數與分類； 其特征在于:所述步驟三細胞進樣的過程為:將細胞樣品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成負壓狀態，因此細胞會自動進樣至微通道中，大部分細胞會停留在微通道的微腔室中。
5.如權利要求4所述的細胞計數方法，其特征在于:所述的制作細胞樣品具體為:采用離心的方法去除上清液，再在離心管中加入磷酸緩沖液，充分吹打后離心，去除上清液，再加入少量磷酸緩沖液即可制得細胞樣品。
6.如權利要求4所述的細胞計數方法，其特征在于:所述的步驟一是通過連接有熒光染料的抗體與細胞表面抗原反應后，離心去除過量的抗體；此處針對不同細胞可以選擇不同抗體，且樣品細胞有多類時，可以同時選擇幾種帶熒光標記的抗體。
7.如權利要求4所述的細胞計數方法，其特征在于:所述的微流控芯片為權利要求1、2或3所述的微流控芯片。
【文檔編號】G01N15/10GK103611584SQ201310517183
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】馮曉均 申請人:武漢斯坦姆賽爾生物技術有限公司