Ccne1基因在檢測上尿路上皮癌中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明CCNE1基因在檢測上尿路上皮癌中的應用，屬于基因工程【技術領域】。所述的應用是指通過RT-PCR反應對尿路上皮組織樣本中的CCNE1基因的mRNA表達量與正常尿路上皮組織中的CCNE1基因的mRNA表達量進行對比，當樣本中CCNE1基因的mRNA表達量高于正常CCNE1基因的mRNA表達量時，該樣本為上尿路上皮癌樣本；也可以通過對樣本尿路上皮組織進行免疫組化測定，當樣本尿路上皮組織的染色指數≥5時，該樣本尿路上皮組織中CCNE1高表達，該樣本為上尿路上皮癌樣本。本發明具有為UTUC患者的診斷提供了一種新的診斷性指標，并且CCNE1基因能夠預測T2和T3患者生存差異的優點。
【專利說明】CCNE1基因在檢測上尿路上皮癌中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用。
【背景技術】
[0002]成年人腎癌包括起源于腎實質和腎盂的惡性腫瘤。腎癌中最主要的類型是腎實質癌而腎盂癌相對罕見(大約占10%)。幾乎所有的腎盂癌都是上尿路上皮癌(UTUC),UTUC大約占病理診斷腎癌的8.4%，大約占所有尿路上皮癌的5%。UTUC是一種起源于輸尿管口到腎盞的移行(尿路)上皮細胞的惡性腫瘤。人們對UTUC的認識不足，并且這些認識通常基于膀胱移行細胞癌，這是因為人們認為他們有共同的危險因素，如吸煙和使用含有乙酰對氨基苯酹類鎮痛藥。我們從Lughezzani等人的文獻了解到:在過去的幾年中，一些與UTUC進程相關的分子標志物如細胞增殖(EFGR)、新生血管形成(如HIF-1 α )、細胞粘附(如鈣粘附素和鏈蛋白)、細胞凋亡(如Bcl-2)和細胞周期控制(Ρ53)等推動著UTUC的臨床實踐向前發展。但是多變量分析證明P53并不能作為獨立的預后指標。雖然腫瘤的分期以及腫瘤的病理學分級仍被認為是最可信的臨床結果預測指標。然而，其它一些腫瘤研究卻表明:用分子標志物判斷生存預后要比病理學分級更好。為了證明在預后生存方面分子標志物優于病理學分級，在這項研究中，我們并不是簡單的選擇性的測試幾個基因序列，而是以全基因組mRNA表達譜為基礎盡可能找出與預后有關的所有基因。
[0003]人們已經證明:在確定腫瘤特異性標志物、亞型和預測治療結果方面，利用微陣列或第二代測序技術進行大規模的mRNA表達譜繪測的方法是有效的。這種方法使得同時對成千上萬的基因乃至整個基因組掃描的系列研究成為可能，因此這種方法可以促進對腫瘤的全面理解并有利于高敏感性和高特異性的生物標志物的發現。與微陣列技術相比，基于序列的分析不產生mRNA雜交序列并且避免重復性，它可以在無限的動態范圍中測量基因表達水平。
【發明內容】
[0004]本發明通過基于序列的分析，我們揭示了在UTUC患者中CCNEl的表達上調，并確定CCNEl的蛋白表達可以作為UTUC患者重要的并且獨立的預后評價指標。雖然病理TNM分期可以預測Tl和T2或Tl和T3生存差異，但是分子標記卻能夠預測T2和T3患者生存差異，這個不能通過!TM分期來預測。本發明的結果不僅描述了 UTUC的分子特性，并且提供了 UTUC的潛在的預后標志物；更重要的是，為功能與臨床驗證提供了一個豐富的案例。
[0005]本發明的目的在于公開了 CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0007]CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用。
[0008]上述技術方案所述的CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用，其中，CCNEI基因在上尿路上皮癌中表達上調。[0009]上述技術方案所述的CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用，包括下述步驟:
[0010](1)、取樣本尿路上皮組織，提取尿路上皮組織的RNA ；
[0011](2)、對樣本的尿路上皮組織RNA進行逆轉錄，得到樣本尿路上皮組織的cDNA ；
[0012](3)、以步驟⑵獲得的尿路上皮組織cDNA為模版，以引物對P為引物，進行RT-PCR反應，將樣本尿路上皮組織中的CCNEl基因的mRNA表達量與正常尿路上皮組織中的CCNEl基因的mRNA表達量進行對比，當樣本中CCNEl基因的mRNA表達量高于正常CCNEl基因的mRNA表達量時，該樣本為上尿路上皮癌樣本；其中引物對P為:
[0013]CCNEI 上游引物:5 ’ -TGGATGGCATCAAACAGGGCAAAG-3，，
[0014]CCNEI 下游引物:5 ’ -GCACGCACTGGTGTCTGGAGGT-3，。
[0015]上述技術方案所述的CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用，其中，所述RT-PCR 的條件為:50°C 2 分鐘、95°C 2 分鐘，I 個循環；95°C 15 秒、55°C 30 秒、72°C 40 秒，40個循環。
[0016]上述技術方案所述的CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用，其中，所述的應用是通過對樣本尿路上皮組織進行免疫組化測定，當樣本尿路上皮組織的染色指數> 5，該樣本尿路上皮組織中CCNEl高表達，該樣本為上尿路上皮癌樣本。
[0017]本發明具有以下有益效果:
[0018]1、本發明通過實驗揭示了 CCNEl基因在上尿路上皮癌中高表達，為UTUC患者的診斷提供了一種新的診斷性指標。
[0019]2、本發明的CCNEl基因能夠預測T2和T3患者生存差異，而--Μ分期卻不能用來預測T2和T3生存差異。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0020]1、圖1為CCNEl的mRNA的表達在UTUC患者的腫瘤組織和正常對照組織之間的對比結果圖。
[0021]2、圖2為運用免疫組化染色顯示CCNEl在腫瘤組織中和正常組織中的不同顯色效果圖。
[0022]3、圖3為CCNEl的高表達與病人的預后的關系，其中Low為CCNEl低表達，High為CCNEl高表達。
[0023]4、圖4為CCNEl作為預后指標分子標記物與了匪分期的對比試驗結果圖，其中Low為CCNEl低表達，High為CCNEl高表達。
【具體實施方式】:
[0024]為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用作進一步的說明。
[0025]一、樣本與試劑:
[0026](一)、樣本:
[0027]1、所有患者在術前都未經放療或化療；2、患者都是由中山腫瘤中心進行病理診斷和臨床診斷后確診的；3、年齡大于18歲；4、腫瘤組織是術中通過電切或全切獲得的；5、樣本組織都是新鮮組織，切下后30分鐘內放入RNAlater中，并在4°C冷藏過夜，其后_80°C低溫儲存；6、經HE染色，腫瘤細胞超過80%的腫瘤組織；7、正常腎組織在病理學檢查中顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細胞污染。
[0028]手術切除的新鮮組織立即沉浸在RNAlater (Qiagen公司；德國)中，并4°C冷藏過夜以便溶液深入浸潤組織，其后_80°C低溫儲存。另一方面，蘇木精-伊紅(HE)染色檢測腫瘤細胞的百分比，篩選出腫瘤細胞超過80%的腫瘤組織作進一步的研究。正常腎組織的病理學檢查顯示正常的腎小管和腎小球且無腫瘤細胞污染。根據2002美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期系統，對每名患者的腫瘤進行分期或重新分期。
[0029](二)、試劑:
[0030](I) ,RNAlater ；
[0031](2)、DNase I (RNase Free,美國，Promega)；
[0032](3)、Trizol 試劑溶液(Invitrogen ；Carlsbad,美國)；
[0033](4) > oligo (dT) 18beads (Invitrogen,美國)；
[0034](5)、逆轉錄酶(M-MLV) (Fermentas ;美國);
[0035](6)、RT-PCR儀(ABI7000)美國應用生物系統公司。
[0036]本發明中涉及到上述試劑的使用均按照試劑使用說明中的步驟進行操作。
[0037]試駘例1:RT-PCR檢測CCNEl基因的mRNA在上尿路上皮癌中表達上調:
[0038](一 )、樣本信息:`
[0039]10例患者的信息如表1所示:
[0040]表1樣本信息
[0041]
【權利要求】
1.CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用。
2.根據權利要求1所述的CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用，其特征在于:CCNEl基因在上尿路上皮癌中表達上調。
3.根據權利要求1或2所述的CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用，包括下述步驟: (1)、取樣本尿路上皮組織，提取尿路上皮組織的RNA； (2)、對樣本的尿路上皮組織RNA進行逆轉錄，得到樣本尿路上皮組織的cDNA； (3)、以步驟(2)獲得的尿路上皮組織cDNA為模版，以引物對P為引物，進行RT-PCR反應，將樣本尿路上皮組織中的CCNEl基因的mRNA表達量與正常尿路上皮組織中的CCNEl基因的mRNA表達量進行對比，當樣本中CCNEl基因的mRNA表達量高于正常CCNEl基因的mRNA表達量時,該樣本為上尿路上皮癌樣本；其中引物對P為: CCNEl 上游引物:5’ - TGGATGGCATCAAACAGGGCAAAG -3’， CCNEl 下游引物:5’ - GCACGCACTGGTGTCTGGAGGT -3’。
4.根據權利要求3所述的CCNEl基因在檢測上尿路上皮癌中的應用，其特征在于，所述RT-PCR的條件為:50°C 2分鐘、95°C 2分鐘，I個循環；95°C 15秒、55°C 30秒、72°C 40秒,40個循環。
5.根據權利要求1或2所述的CCNEl基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，其特征在于:所述的應用是通過對樣本尿路上皮組織進行免疫組化測定，當樣本尿路上皮組織的染色指數> 5，該樣本尿路上皮組織中CCNEl高表達，該樣本為上尿路上皮癌樣本。
【文檔編號】G01N33/574GK103558382SQ201310516287
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優先權日:2013年10月28日
【發明者】蔡志明, 吳松, 何穎穎, 謝暢, 毛有勝 申請人:深圳市第二人民醫院