一種致敏雞紅細胞的制備方法及ibv檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種致敏雞紅細胞的制備方法及IBV檢測試劑盒。一種致敏雞紅細胞的制備方法，包括如下步驟：細胞固化：將新鮮雞紅細胞用緩沖液洗滌干凈，加入醛溶液稀釋，振蕩反應，洗滌得到固化雞紅細胞；細胞鞣化：將固化雞紅細胞稀釋，加入鞣酸，得到鞣化雞紅細胞；細胞致敏：將鞣化雞紅細胞稀釋，加入IBV液混合作用，得到致敏雞紅細胞。本發明的致敏雞紅細胞，具有很高的特異性，檢測結果具有很好的符合性。用其制備得到的IHA檢測試劑，具有成本低廉，易于操作，25分鐘即可觀察結果，大大縮短了檢測時間。
【專利說明】—種致敏雞紅細胞的制備方法及IBV檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測用材料的制備方法及其檢測試劑盒，特別涉及一種用于間接血凝檢測IBV抗體的致敏雞紅細胞的制備方法及IBV檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]傳染性支氣管炎(IB)是雞的一種急性、高度接觸性傳染的病毒性呼吸道和泌尿生殖道疾病。其特征是咳嗽、噴嚏、氣管啰音和呼吸道粘膜呈漿液性卡他性炎癥。本病流行呈世界性分布，可感染所有品種和日齡的雞，導致病雞生長遲緩、死亡、增重和飼料報酬降低，成年雞感染后主要表現為開產期推遲，產蛋量、蛋品質明顯下降，康復后的蛋雞產蛋量很難恢復到患病前的水平，本病常常引起霉形體、大腸桿菌等的繼發感染而提高雞群的死亡率，給養雞業帶來巨大的經濟損失。
[0003]IBV的血清型眾多，據不完全統計，迄今已至少發現27個血清型，而且新的血清型和變異株還在不斷出現，這就給IB的預防帶來很大困難。據調查，我國目前大部分地區的IBV毒株屬于Massachusetts血清型和基因型(其代表株為M41株)。主要引起呼吸道癥狀。但有些地區也存在類似美國Gray株和Holte株的野毒的局部流行，其共同特點是引起典型腎臟損傷。
[0004]國內外普遍采用Massachusetts血清型的H120和H52弱毒疫苗來控制IB，對于飼養周期長的蛋雞和種雞于開產前接種一次IB油乳劑滅活疫苗，代表株為M41株，這與該毒株的流行最廣泛有關。因IBV變異很快，所以用疫苗前必須掌握當地流行的病毒血清型，并使用與當地流行毒株抗原性一致的疫苗品系，這樣才能達到有效的免疫預防目的。
[0005]目前國內外IBV抗體的血清學檢測方法主要包括病毒中和試驗、瓊脂擴散試驗、血凝抑制試驗、ELISA等。以上血清學檢測方法可能由于試驗對象的個體差異會導致試驗結果的不準確，瓊脂擴散試驗相對于IB靈敏度較差，有些血清型很難出現沉淀線，臨床上很少用該方法進行IB抗體的檢測，HI和ELISA靈敏度高，生產成本也隨之提高，臨床上抗體檢測較常用的為HI，目前國內尚未有提供較好的IB凝集抗原的廠家，需從荷蘭Gezonheidsdienst Voor Dieren B.V.公司購買，這就大大提高了檢測成本。
[0006]在病原抗體檢測領域，IHA (間接血凝試驗)經過大量試驗驗證，是一項簡便、快速、結果準確、可重復性強、經濟實用的檢測技術，可應用于臨床抗體的大量、快速檢測，值得推廣應用。在IHA實驗中，紅細胞的處理至關重要，直接影響檢測速度和檢測結果的準確性。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種用于間接血凝檢測IBV抗體的鞣化雞紅細胞的制備方法。
[0008]本發明的另一個目的在于提供一種IBV檢測試劑盒。
[0009]本發明所采取的技術方案是: 一種致敏雞紅細胞的制備方法，包括如下步驟:
1)細胞固化:將新鮮雞紅細胞用緩沖液洗滌干凈，加入醛溶液稀釋，振蕩反應，洗滌得到固化雞紅細胞；
2)細胞鞣化:將固化雞紅細胞稀釋，加入鞣酸，得到鞣化雞紅細胞；
3)細胞致敏:將鞣化雞紅細胞稀釋，加入IBV液混合作用，得到致敏雞紅細胞。
[0010]作為本發明的進一步改進，細胞固化的操作為:
1)將新雞紅細胞用pH7.0 PBS液洗滌干凈，通過離心沉淀將紅細胞分離；
2)將紅細胞用PBS液懸浮，加入戊二醛進行固化處理，振蕩處理10min以上至固化完全且紅細胞未發生自凝；
3)用pH7.0 PBS液將戊二醛固化處理后的紅細胞洗滌干凈，得到固化雞紅細胞。
[0011]優選的，在進行細胞固化時，紅細胞懸液中，紅細胞的濃度為8.48X IO8?8.72X IO8個/ml，戊二醛的質量濃度為0.3?1.25%0。
[0012]作為本發明的進一步改進，細胞鞣化的操作為:將固化雞紅細胞用稀釋液稀釋制成懸液，在懸液中加入鞣酸，鞣化處理20?90 min，之后用PBS液洗凈。
[0013]優選的，稀釋后的固化雞紅細胞懸液中，紅細胞的濃度為8.52X IO8?8.68X IO8個/ml，鞣酸的質量濃度為0.125?0.5%。稀釋液為蒸餾水。
[0014]作為本發明的進一步改進，細胞致敏的操作為:將鞣化雞紅細胞稀釋至4.26X 108?4.34X 108個/ml，與IBV病毒混合，35?40°C作用15?45 min，之后洗滌干凈，得到致敏雞紅細胞。
[0015]一種IBV間接血凝試劑盒，含有致敏紅細胞、陽性對照血清、陰性對照血清和致敏紅細胞稀釋劑，致敏紅細胞按上述任意一項所述方法制備得到。
[0016]作為本發明的進一步改進，稀釋液為含有體積比為1%新生牛血清的pH7.0 PBS液。
[0017]本發明的有益效果是:
本發明的致敏雞紅細胞，具有很高的特異性，檢測結果具有很好的符合性。用其制備得到的IHA檢測試劑，具有成本低廉，易于操作，25分鐘即可觀察結果，大大縮短了檢測時間。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例，進一步說明本發明。
[0019]新鮮雞紅細胞的制備:
取SPF雞新鮮血液，離心去血清，用pH7.0 PBS液洗滌紅細胞3?4次，離心沉淀紅細胞，4°C保存備用。
[0020]當然，也可以使用其他公知的方法獲得雞紅細胞。以下實驗中所使用的雞紅細胞 雞紅細胞的固化:
將雞紅細胞用pH7.0 PBS液稀釋至8.48 X IO8?8.72 X IO8個/ml，分成10份，分別加入戊二醛，調整其質量濃度依次為 0.075%。、0.15%。、0.3%。、0.6%。、1.25%>2.5%。、5%。、10%。、15%。、25%。，25°C振搖作用30分鐘取出，之后用pH7.0 PBS液洗滌紅細胞3?4次，離心沉淀得到固化紅細胞，4°C保存備用；
對比例:使用同濃度的甲醛替換戊二醛，其他操作相同。[0021]將雞紅細胞用pH7.0 PBS液稀釋至8.48X 108?8.72X 108個/ml，，取8份等量紅細胞，分別加入甲醛，調整其質量濃度依次為0.075%。、0.15%。、0.3%。、0.6%。、1.25%0、2.5%0、5%。、10%。、15%。、25%。，分別置于25°C和4°C振搖作用20分鐘、30分鐘、50分鐘、60分鐘取出，用PH7.0 PBS液洗滌紅細胞3?4次，離心沉淀得到固化紅細胞，4°C保存備用。
[0022]固化效果評價:
分別取部分上述制備得到的固化雞紅細胞進行自凝性檢測，剩余部分4°C保存備用。
[0023]用甲醛和戊二醛兩種試劑溶液按不同濃度固化紅細胞，經震蕩后離心和紅細胞自凝性檢測，甲醛濃度在 0.075%o>0.15%0、0.3%ο、0.6%。、1.25%>2.5%。、5%。、10%。時可使紅細胞固化，自凝試驗甲醛濃度在2.5%。、5%。、10%。時紅細胞會發生自凝現象，甲醛濃度在
0.075%。、0.15%。、0.3%。、0.6%。、1.25%。時紅細胞沉積于孔底并呈淚滴樣流淌，甲醛濃度在15%。、25%。時紅細胞迅速溶血，可見甲醛濃度在0.075%。、0.15%。、0.3%。、0.6%。、1.25%。時可使紅細胞很好的固化，缺點是固化過的紅細胞顏色呈暗紅色。
[0024]戊二醛濃度在0.3%ο、0.6%。、1.25%。、2.5%。、5%。、10%。、15%。、25%。時可使紅細胞固化，自凝試驗戊二醛濃度在10%。、15%。、25%。時紅細胞會發生自凝現象，戊二醛濃度在
2.5%。、5%。時發生半自凝現象，戊二醛濃度在0.3%。、0.6%。、1.25%。時紅細胞沉積于孔底并呈淚滴樣流淌，戊二醛濃度在0.075%。、0.15%。時震蕩后離心紅細胞出現溶血現象，可見戊二醛濃度在0.3%。、0.6%。、1.25%。時可使紅細胞很好的固化，且紅細胞顏色鮮艷如新鮮紅細胞。
[0025]通過兩種醛類固化紅細胞對比，戊二醛固化效果要好于甲醛固定。
[0026]加入適量戊二醛的紅細胞，在25°C和4°C作用不同時間的紅細胞自凝性檢測表明，紅細胞在25°C時作用20分鐘時不能完全被固化，作用30分鐘紅細胞被完全固化，且不發生自凝現象，作用50分鐘紅細胞出現了自凝，紅細胞在4°C作用20分鐘、30分鐘、50分鐘均不能使紅細胞完全固化，作用60分鐘及以上可使紅細胞完全固化，且不出現自凝現象。
[0027]通過不同溫度作用不同時間表明，紅細胞在25°C作用30分鐘和4°C作用60分鐘即可使紅細胞完全固化。
[0028]固化雞紅細胞的鞣化:
鞣化紅細胞稀釋液選擇
分別用PH7.0 PBS液、生理鹽水和雙蒸水將固化紅細胞稀釋至4.26 X IO8?4.34X IO8個/ml，，得到固化紅細胞懸液，之后加入鞣酸使其在固化紅細胞懸液的質量濃度為0.5%，38°C水浴作用30分鐘取出，用pH7.0 PBS液洗滌紅細胞3?4次，離心沉淀得到鞣化紅細胞，4°C保存備用。
[0029]鞣酸液濃度選擇
用滅菌蒸餾水將固化紅細胞稀釋至4.26X IO8?4.34X IO8個/ml，，得到固化紅細胞懸液，分成6等份，之后加入鞣酸使其在固化紅細胞懸液的質量濃度分別為4%、2%、1%、0.5%、
0.25%,0.125%，38°C水浴作用30分鐘取出，用pH7.0 PBS液洗滌紅細胞3?4次，離心沉淀得到鞣化紅細胞，4°C保存備用。
[0030]紅細胞鞣化溫度及時間選擇
用滅菌蒸餾水將固化紅細胞稀釋至4.26X IO8?4.34X IO8個/ml，，得到固化紅細胞懸液，分成12等份，之后加入鞣酸使其在固化紅細胞懸液的質量濃度為0.3%，分別放入38°C、25°C和4°C作用20分鐘、30分鐘、50分鐘、60分鐘取出，用pH7.0 PBS液洗滌紅細胞3?4次，離心沉淀得到鞣化紅細胞，4°C保存備用。
[0031]鞣化效果評價:
取上述鞣酸濃度為1%、0.5%、0.25%,0.125%的鞣化紅細胞，38 °C作用20?30分鐘、25°C和4°C作用20分鐘、30分鐘、50分鐘、60分鐘的紅細胞，分別加入IBV病毒液混合，紅細胞與病毒液濃度為1:5進行混合，38°C作用30分鐘取出，用pH7.0 PBS液洗滌紅細胞3?4次，進行致敏紅細胞自凝性檢測和間接血凝試驗。
[0032]固化紅細胞用PBS、生理鹽水和蒸餾水稀釋后加入適量鞣酸液進行鞣化，在鞣化紅細胞洗滌過程中發現用PBS液和生理鹽水稀釋紅細胞進行的鞣化，紅細胞呈現顆粒狀，用蒸餾水稀釋紅細胞進行的鞣化，紅細胞呈均勻的云霧狀分散。自凝性試驗，用PBS液和生理鹽水進行的鞣化，紅細胞加入V型孔內靜止20?25分鐘呈顆粒狀沉積于孔底且呈塊狀下滑，用蒸餾水稀釋進行的鞣化，紅細胞加入V型孔內靜止20?25分鐘呈淚滴樣流淌。
[0033]用三種稀釋液進行的紅細胞鞣化，蒸餾水的鞣化效果要好于PBS液和生理鹽水的鞣化，且三種鞣化液在4°C放置一定時間后，進行自凝性檢測，只有蒸餾水鞣液未發生自凝現象，另兩個鞣化液紅細胞沉積于孔底不下滑。
[0034]試驗證明固化紅細胞的鞣化應選用蒸餾水作為稀釋液，能使固化紅細胞表面均勻軟化，以利于下游試驗中病毒的吸附。
[0035]用不同濃度鞣酸固化紅細胞，自凝性試驗表明，鞣酸濃度在4%時會發生自凝現象，濃度在1%?2%時出現半自凝現象，濃度在0.5%、0.25%和0.125%時鞣化紅細胞在20?25分鐘很快下滑。
[0036]試驗表明固化紅細胞表面軟化用鞣酸濃度在0.5%?0.125%能使固化紅細胞表面很好的鞣化。
[0037]將加入0.3%鞣酸液的固化紅細胞，放入38°C、25°C和4°C作用不同時間段取出進行自凝性檢測，紅細胞在38°C作用50和60分鐘均可使紅細胞出現自凝現象，38°C作用20和30分鐘、25°C和4°C作用20、30、50、60分鐘紅細胞均不出現自凝現象。
[0038]用同一份陽性血清進行間接血凝試驗表明:鞣酸液濃度在0.5%、0.25%、0.125%及38°C作用30分鐘的致敏紅細胞與陽性血清作用，凝集價均在1:16以上；38°C作用20分鐘、25°C作用50?60分鐘的致敏紅細胞與陽性血清作用，凝集價為1:2?1:4 ;25°C作用20、30分鐘、4°C作用20、30、50、60分鐘的致敏紅細胞與陽性血清作用，紅細胞均不出現凝集。
[0039]試驗表明固化紅細胞用鞣酸濃度為0.125%?0.5%，溫度為38°C，時間為30分鐘，能使紅細胞很好的鞣化并能使病毒很好的吸附。
[0040]致敏紅細胞用IBV病毒液的病毒含量每0.1ml不低于IO7 5EID5tl方可用于致敏。
[0041]紅細胞的致敏:
本實驗中所使用的鞣化紅細胞為上述“鞣酸液濃度選擇”中，鞣酸濃度為0.5%的鞣化紅細胞。
[0042]致敏濃度的選擇
取鞣化紅細胞稀釋至4.26X IO8?4.34X IO8個/ml，加入IBV病毒液(病毒含量每
0.1ml不低于107_5EID5tl)混合，紅細胞與病毒液比例分別為:1: 1、1: 2、1: 3、1:4、1:5混合均勻，38°C水浴作用30分鐘取出，用pH7.0 PBS液洗滌紅細胞3?4次，用pH7.0 PBS液配制成1%的紅細胞溶液，4°c保存備用。
[0043]致敏溫度及時間的選擇
取鞣化紅細胞1份、病毒液2份混合均勻，38°C和56°C水浴作用10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘時取出，用PH7.0 PBS液洗滌紅細胞3~4次，4°C保存備用。
[0044]致敏效果的評價:
結果判定標準:紅細胞全部凝集表示為“++++” ；75%紅細胞凝集表示為“+++” ；50%紅細胞凝集表示為“++” ;25%紅細胞凝集表示為“ + ” ；紅細胞無凝集表示為陽性對照血清呈現50%以上凝集的不低于1:16 ;陰性血清和空白對照呈現50%凝集的不高于1:2。
[0045]結果判定應在陽性對照和陰性對照成立的前提下，觀察待檢血清各孔凝集情況，以呈現50%凝集的血清最大稀釋倍數作為該血清的抗體效價。
[0046]待檢血清1:2呈現50%凝集的判為陰性；待檢血清1:4及以上呈現50%凝集的判為陽性；待檢血清1:16及以上呈現50%凝集的判為血清抗體保護效價。
[0047]鞣化紅細胞與不同濃度IBV病毒液作用，經間接血凝試驗表明:紅細胞與病毒液比例為1:1時，紅細胞凝集價≤1:8 ;紅細胞與病毒液比例為1:2、1:3、1:4、1:5時紅細胞凝集價相同，均> 1:16。為節省病毒用量，病毒液的致敏濃度選擇1:2~1:3為佳。
[0048]紅細胞與病毒液在56°C作用10分鐘、38°C作用40、50和60分鐘均發生了自凝，38°C作用10、20、30分鐘不發生自凝。間接血凝試驗，紅細胞與病毒液38°C作用10分鐘，紅細胞無凝集價，38°C作用20分鐘，紅細胞凝集價為1:4，38°C作用30分鐘紅細胞凝集價為1:16。可見紅細胞與病毒液在38°C作用30分鐘，能使病毒很好的吸附于紅細胞。
[0049]IBV檢測試驗 間接血凝試驗
96孔微量板法，取96孔V型血凝板，每孔加入25 μ I PBS液，左邊第I孔各加入25 μ I陽性血清，用移液器從左邊第I孔開始將血清2倍系列稀釋至第11孔，棄去移液器內25 μ I液體(稀釋倍數以次為2、4、8、16、32……2048)，第I~6列分別加入上述致敏10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘的紅細胞，每孔25 μ 1，第7列加入陰性血清，每孔25 μ 1，然后加入每個時間段的致敏紅細胞，每個樣加2孔，第8列加入醛化紅細胞作對照，混合均勻，室溫靜止作用20~25分鐘觀察結果。
[0050]特異性試驗
用制備好的致敏紅細胞檢測新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV，Η9、Η5亞型)、減蛋綜合癥病毒(EDSV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、大腸桿菌(01、078型)、鴨疫里默氏桿菌(1、2型)陽性血清，結果均為陰性反應。說明制備的紅細胞具有很高的特異性。
[0051]IHA 與 HI 試驗
取IBV病毒，分成兩份，一份用來做成致敏紅細胞，另一份制備成具有血凝性的病毒抗原，用同一份陽性血清進行IHA和HI對比試驗，反復檢測3次，結果抗體效價符合率為97.9%。說明用兩種方法檢測抗體結果基本一致，可用IHA試驗代替HI試驗，可節省成本，簡單易操作，25分鐘即可觀察結果，還可大幅節省時間。
[0052]批量血清樣品檢測
取實驗室和田間血清樣品共計210份，用致敏好的紅細胞進行IHA和用同批病毒制備的具有血凝的病毒抗原進行HI兩種方法同時進行檢測，結果兩種方法檢測結果符合率達97.9%，與進口抗原進行HI抗體檢測，結果符合率達64.3%，這可能與不同地區病毒株存在差異有關。具體檢測結果如表1所示。
[0053]表1 IHA試劑盒與同種病毒制備血凝抗原和進口抗原HI試驗結果
【權利要求】
1.一種致敏雞紅細胞的制備方法，包括如下步驟: 1)細胞固化:將新鮮雞紅細胞用緩沖液洗滌干凈，加入醛溶液稀釋，振蕩反應，洗滌得到固化雞紅細胞； 2)細胞鞣化:將固化雞紅細胞稀釋，加入鞣酸，得到鞣化雞紅細胞； 3)細胞致敏:將鞣化雞紅細胞稀釋，加入IBV液混合作用，得到致敏雞紅細胞。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:細胞固化的操作為: 1)將新雞紅細胞用PH7.0 PBS液洗滌干凈，通過離心沉淀將紅細胞分離； 2)將紅細胞用PBS液懸浮，加入戊二醛進行固化處理，振蕩處理10min以上至固化完全且紅細胞未發生自凝； 3)用pH7.0PBS液將戊二醛固化處理后的紅細胞洗滌干凈，得到固化雞紅細胞。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:紅細胞懸液中，紅細胞的濃度為8.48X IO8?8.72X IO8個/ml，戊二醛的質量濃度為0.3?1.25%0。
4.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:細胞鞣化的操作為:將固化雞紅細胞用稀釋液稀釋制成懸液，在懸液中加入鞣酸，鞣化處理20?90 min，之后用PBS液洗凈。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于:稀釋后的固化雞紅細胞懸液中，紅細胞的濃度為8.52X IO8?8.68X IO8個/ml，鞣酸的質量濃度為0.125?0.5%。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于:稀釋液為蒸餾水。
7.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:細胞致敏的操作為:將鞣化雞紅細胞稀釋至4.26X 108?4.34X 108個/ml，與IBV病毒混合，35?40°C作用15?45 min,之后洗滌干凈，得到致敏雞紅細胞。
8.—種IBV間接血凝試劑盒，含有致敏紅細胞、陽性對照血清、陰性對照血清和致敏紅細胞稀釋劑，其特征在于:致敏紅細胞按權利要求1?7任意一項所述方法制備得到。
9.根據權利要求8所述的IBV間接血凝試劑盒，其特征在于:稀釋液為含有體積比為1%新生牛血清的ρΗ7.0 PBS液。
【文檔編號】G01N33/569GK103543257SQ201310511369
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月25日 優先權日:2013年10月25日
【發明者】王鑫, 葉賀佳, 羅開健, 許麗娜, 李敏, 仇微紅, 梁昭平 申請人:廣州市華南農大生物藥品有限公司