一種基于單克隆抗體的檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌的雙抗體夾心法
【專利摘要】一種基于單克隆抗體的檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌的雙抗體夾心法，屬于免疫分析【技術領域】。本發明應用鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311和光滑型的鼠傷寒沙門氏菌LPS混合免疫7周齡BALB/c小鼠，經免疫、融合、篩選得10株LPS單克隆抗體，分別標記HRP，并以鼠傷寒沙門氏菌進行兩兩配對。以6E2CGMCCNo.7206單抗作為包被抗體和酶標抗體，以鼠傷寒沙門氏菌為標準品建立了夾心ELISA方法，LOD為500cfu/mL。用理化性質高度均一、特異性好、可大量制備的單克隆抗體建立的夾心法靈敏度高，成本低，與腸炎沙門氏菌、亞利桑那沙門氏菌、E.coli、E.coliO157:H7、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌無交叉反應，為食品中鼠傷寒沙門氏菌檢測提供了快速高效的分析手段。
【專利說明】一種基于單克隆抗體的檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌的雙抗體夾心法
【技術領域】
[0001]本發明涉及了一種基于單克隆抗體的檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌的雙抗體夾心法，屬于免疫分析【技術領域】。
【背景技術】
[0002]沙門氏菌(Salmonella)是一種全球性的食源性致病菌。生物學上沙門氏菌是一類兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌，無芽孢，一般無莢膜，主要抗原有O抗原、H抗原、Vi抗原。動物性食品如禽肉、蛋類、乳品容易污染沙門氏菌。人體攝入含菌食物后會引起急性腸胃炎、傷寒，免疫力低下的兒童等人群中甚至出現敗血癥等癥狀。
[0003]沙門氏菌有2000多種血清型，臨床中常見的血清型主要是腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌等。良好規范的生產操作過程和危害分析與關鍵點控制(HACCP)等管理體系的應用可以很大程度上減少食源性致病菌的發生。然而對原料和生產過程、產品的質量監測也是保障食品生物安全的重要過程。
[0004]目前檢測沙門氏菌的方法主要有培養法、免疫學檢測方法、分子檢測方法。傳統的生化培養法是檢測沙門氏菌的國標方法，盡管權威可靠，但一般需要5-10天得到結果，且操作過程繁瑣，不能適應快速檢測的要求；分子檢測方法是基于沙門氏菌脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶鏈式反應(PCR)建立起來的。目前發展為傳統PCR、實時熒光定量PCR(RT-PCR)、環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。與傳統PCR相比，RT-PCR具有實現定量檢測目標DNA、特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。LAMP方法具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等方面不亞于常規PCR技術，不依賴專門的儀器設備，可以現場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低于熒光定量PCR。然而，有文獻報道LAMP方法在檢測牛乳中的沙門氏菌時，會出現假陰性的問題。這可能是與引物受到樣品基質影響所引起的。同樣常規PCR和實時PCR也面臨著檢測成本高、對操作人員技術要求較高的問題。
[0005]免疫學檢測方法主要有酶聯免疫反應(ELISA)、免疫層析試紙條(Immunochromatographic test strip)。ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點成為食源性致病菌的常規檢測方法。抗體的親和力、交叉反應、穩定性對于ELISA方法的靈敏度和特異性有著關鍵性的決定作用。雖然膠體金試紙條具有操作簡單、穩定性高、不需要借助專門儀器、適合現場快速檢測的優點，但一般而言，ELISA比膠體金試紙條具有更好的靈敏度，而且更適合高通量檢測，因此ELISA也具有相當廣泛的應用空間。
[0006]作為食品安全事件中常見的致病血清型，鼠傷寒沙門氏菌的檢測也是非常重要的。本發明首次采用LPS和菌體混合免疫的方法，成功制備了高靈敏的鼠傷寒沙門氏菌LPS的單克隆抗體并應用一株單克隆抗體就實現了鼠傷寒沙門氏菌的雙抗體夾心法檢測。成功制備抗體與采用的免疫原是密不可分的，單純的通過菌體免疫制備沙門氏菌的單克隆抗體是比較困難的。作為沙門氏菌的主要抗原，LPS是有潛力的檢測抗原，但LPS的免疫原性較弱，在小鼠體內很難引起足夠的免疫應答。而沙門氏菌菌體表面均勻分布著大量的LPS，因此我們將鼠傷寒沙門氏菌LPS和鼠傷寒沙門氏菌菌體混合免疫取得了較好的效果。應用一個單克隆抗體即可實現高靈敏的雙抗體夾心法檢測這是與抗體較高的親和力以及沙門氏菌表面分布大量LPS所決定的。
【發明內容】
[0007](一 )要解決的技術問題
本發明的目的在于建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯免疫吸附檢測方法，用于食品中鼠傷寒沙門氏菌的批量、快速檢測。
[0008]( 二 )技術方案
為實現上述目的，本發明的技術方案:一種基于單克隆抗體的檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌的雙抗體夾心法，步驟為:
(O鼠傷寒沙門氏菌LPS單克隆抗體的制備
以混合后的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311菌體和光滑型的鼠傷寒沙門氏菌LPS為免疫原，免疫7周齡的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周進行首免，(10~8cfu鼠傷寒沙門氏菌菌體+100 μ g鼠傷寒沙門氏菌LPS) /只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第四周進行二免，(10~8cfu鼠傷寒沙門氏菌菌體+100 μ g鼠傷寒沙門氏菌LPS)/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第六周進行三免，(10~7cfU鼠傷寒沙門氏菌菌體+50 μ g鼠傷寒沙門氏菌LPS)/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第七周尾部采血測效價，挑選對鼠傷寒沙門氏菌LPS效價最高的老鼠；第九周進行沖刺免疫，30 Ug鼠傷寒沙門氏菌LPS/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺免疫3天后眼眶采血后進行融合、篩選，共篩選得10株LPS單克隆抗體；
我們購買的菌株是CICC 10420 (CICC為中國工業微生物菌種保藏中心)，菌株對應的ATCC編號為ATCC 13311，該沙門氏菌為ATCC 13311.從網站信息可見所購菌株為salmonella typhimurium即專利中的鼠傷寒沙門氏菌。
[0009]LPS購于sigma公司，貨號為L6511。詳細信息可見公司網站:
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/1651l?lang=zh®ion=CN
(2)單克隆抗體的配對篩選
將純化后的10株LPS單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標記成功后進行夾心法配對；配對參數如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為pH9.6、0.01M的碳酸鹽緩沖液；標品濃度10~7cfu/mL ;標品稀釋液pH7.2,0.01M的PBS ;酶標抗體稀釋1000倍使用；在此條件下，實驗成功得到了 40對P/N值>5的配對；
(3)夾心法的建立
選擇檢測限穩定、靈敏的配對，以6E2抗體即CGMCC N0.7206分別為包被抗體和酶標抗體建立夾心法；具體參數如下:
抗體包被濃度:5 μ g/mL,
包被液:pH9.6、0.01M的碳酸鹽緩沖液，
標品稀釋液:pH7.2、0.01M 的 PBS+0.l%Tween,
檢測抗體濃度:1.6 μ g/mL,反應時間:包被、封閉:37°C、2h ;標準品:37°C、lh ;檢測抗體:37°C、lh ;顯色IOmin ； 優化后鼠傷寒沙門氏菌夾心法LOD:500cfu/mL。
[0010]建立了一種食品中鼠傷寒沙門氏菌LPS的雙抗體夾心檢測方法，該方法包括對檢測方法的優化。
[0011]其中，單克隆抗體是采用鼠傷寒沙門氏菌LPS與鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 13311)菌體混合，經過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經雜交瘤技術融合、篩選得到的。
[0012]其中，用于配對的抗體是通過優化參數下夾心法配對，并通過多次試驗篩選確定的，具有穩定性好、靈敏度高的特點。
[0013]其中，建立的夾心法優化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標準品稀釋液，酶標抗體稀釋液，酶標抗體稀釋濃度。LOD達到500cfu/mL，R2為0.99。
[0014]本發明方法的檢測分析原理是:
酶標板上包被了捕獲抗體6E2，合適的濃度下可以最大限度捕獲鼠傷寒沙門氏菌；洗板3次，洗去未結合的抗體，加入封閉液220 μ L封閉板孔上多余結合位點；洗板3次，加入樣品或對照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標抗體6E2-HRP，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色12min。如果樣品有足夠的鼠傷寒沙門氏菌，那么鼠傷寒沙門氏菌被捕獲抗體捕獲并與酶標抗體6E2-HRP結合，并催化底物在450nm產生吸收值(P/N ^ 2.1),并被判定為陽性；如果樣品鼠傷寒沙門氏菌濃度太低(P/N < 2.1)那么樣品不被捕獲或者捕獲數量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性。
[0015](三)有益效果
本發明提供的鼠傷寒沙門氏菌雙抗體夾心檢測方法采用了理化性質高度均一、特異性好、可以大量制備的鼠傷寒沙門氏菌LPS單克隆抗體，建立的夾心法靈敏度高、穩定性好、成本低，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測大量樣品，適合食品行業大規模、高通量、快速、靈敏的檢測要求，具有推廣`和應用價值。
[0016]生物材料樣品保藏:
單克隆細胞株6號，即6E2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC N0.7206，保藏日期2013年I月23日。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1鼠傷寒沙門氏菌雙抗體夾心法的標準曲線。
具體實施方案
[0018]以下通過實施例進一步說明本發明。
[0019]一、儀器:
TGL - 40B臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠
KFLOff純水機，凱佛隆公司
ZD - 9556水平搖床，太倉科教器材廠
96孔8X 12可拆酶標板，廈門怡佳美實驗器材有限公司
MuLtiska Mks 酶標儀，Thermo Labsystems 公司 可調試移液器，Thermo Labsystems公司 渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠
二、試劑:
四甲基聯苯胺(TMB)，上海晶純實業有限公司 其他試劑均為分析純試劑
三、步驟
1.單克隆抗體的制備
Cl)實驗動物:選5只7周齡的BALB/c小鼠進行免疫。
[0020](2)抗原配置:將免疫原(混合后的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311菌體和光滑型的鼠傷寒沙門氏菌LPS)用生理鹽水稀釋，渦旋混合均勻。
[0021](3)乳化:將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全后皮下多點注射小鼠。
[0022]免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用間接競爭法測定效價，效價達到要求后，進行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進行融合。
[0023](4)采血:第三次免疫后I周進行斷尾采血，采用間接非競爭酶聯免疫法測定抗血清效價。
[0024](5)融合、篩選:采用雜交瘤技術進行融合，采用間接ELISA篩選陽性細胞孔，采用有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆。
[0025](6)抗體的純化和保存:采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，透析后得到單克隆抗體，采用微量紫外方法測定其濃度后分裝后放入-20°C保存。
[0026]2、ELISA 反應過程:
抗體效價測定步驟:
(I)將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標板，100 μ L/孔，于4 °C冰箱過夜。次日取出酶標板回至室溫，每孔注入200 UL PBST溶液，搖床上振蕩3 min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續洗滌2次。以下洗滌方法相同。
[0027](2)充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標板，200 UL/孔，于37 °C溫育箱內溫育2h后取出烘干待用。
[0028](3)將陽性血清系列稀釋對應加入到酶標板的前7行列，第8行加入陰性血清，100μ L/孔，37 °C孵育I h后洗滌、拍干。
[0029](4)每孔加入100 μ L、1:3000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37 °C孵育I h后洗
漆、拍干。
[0030](5)每孔加入100 μ L顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37 °C反應15 min，取出后每孔加入100 μ L終止液(2 mo I/L的硫酸)，用酶標儀測定吸光值A45(l。
[0031]鼠傷寒沙門氏菌雙抗體夾心法測定步驟:
a、包被:用5 μ g/mL的6E2包被酶標板，100 μ L /孔，4°C過夜。
[0032]b、洗滌:用PBST洗滌反應板三次，每次3min，200 μ L/孔，然后甩干反應板。
[0033]C、封閉:含 0.2% 明膠的 CBS, 200 μ L / 孔，37°C封閉 2h。
[0034]d、洗滌:同 b。
[0035]e、樣品:用PBST將鼠傷寒沙門氏菌稀釋成3.70 X ΙΟ6、1.23 X ΙΟ6、4.11 X ΙΟ5、1.37Χ105、4.57Χ104、1.52Χ104、5.08Χ103、1.69Χ103、5.64X IO2 cfu/mL 系列濃度，另設一個PBST空白對照。每孔加入100 μ L樣品，于37°C溫育lh。
[0036]f、洗滌:同 b。
[0037]g、加酶標抗體(6E2-HRP，2y g/mL)，100 μ L / 孔，37 C 反應 lh。
[0038]h、洗滌:同 b。
[0039]1、顯色:加底物 TMBlOO μ L / 孔，顯色 lOmin。
[0040]j、終止:加終止液50 μ L /孔。
[0041]k、測定:用酶標儀檢測0D45(lnm
3、交叉率的測定
將腸炎沙門氏菌、亞利桑那沙門氏菌、E.col1、E.coli 0157:H7、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌精確稀釋成IO8 cfu/mL>IO7 cfu/mL>IO6 cfu/mL、105cfu/mL,在建立的鼠傷寒沙門氏菌雙抗體夾心法體系中檢測吸光值，并設空白孔和鼠傷寒沙門氏菌陽性對照，每個濃度做6次測定平均值，做3次重復實驗。
[0042]試驗結果如下:
1、標準曲線:本發明所獲得的抗原檢測的檢測范圍為IO4?106cfu/mL，R2=0.99具體請見說明書附圖。
[0043]2、LOD =LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的標準偏差對應的抗原濃度，鼠傷寒沙門氏菌雙抗體夾心法LOD為500cfu/mL。
[0044]3、交叉反應率(CR%)
結果:鼠傷寒沙門氏菌正常顯色，而IO8 Cfu/mL及以下濃度的其它測試菌株均不顯色(0D〈 0.15)。說明建立的鼠傷寒沙門氏菌夾心法與腸炎沙門氏菌、亞利桑那沙門氏菌、E.col1、E.coli 0157:H7、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌無交叉反應，特異性良好。
【權利要求】
1.一種基于單克隆抗體的檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌的雙抗體夾心法，其特征在于步驟為: (O鼠傷寒沙門氏菌LPS單克隆抗體的制備
以混合后的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311菌體和光滑型的鼠傷寒沙門氏菌LPS為免疫原，免疫7周齡的BALB/c小鼠，經免疫、融合、篩選，得10株LPS單克隆抗體； (2)單克隆抗體的配對篩選 將純化后的10株LPS單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標記成功后進行夾心法配對；配對參數如下:包被抗體5 μ g/mL ;包被液為pH9.6、0.01M的碳酸鹽緩沖液；標品濃度10~7cfu/mL ;標品稀釋液pH7.2,0.01M的PBS ;酶標抗體稀釋1000倍使用；在此條件下，實驗成功得到了 40對P/N值>5的配對； (3)夾心法的建立 選擇檢測限穩定、靈敏的配對，以6E2抗體即CGMCC N0.7206分別為包被抗體和酶標抗體建立夾心法；具體參數如下: 抗體包被濃度:5 μ g/mL, 包被液:pH9.6、0.01M的碳酸鹽緩沖液， 標品稀釋液:pH7.2、0.0 1M 的 PBS+0.l%Tween, 檢測抗體濃度:1.6 μ g/mL, 反應時間:包被、封閉:37°C、2h ;標準品:37°C、lh ;檢測抗體:37°C、lh ;顯色IOmin ； 優化后鼠傷寒沙門氏菌夾心法LOD:500cfu/mL。
【文檔編號】G01N33/577GK103558388SQ201310506513
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】胥傳來, 王文彬, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強 申請人:江南大學