一種檢測蛋白質烷基化修飾劑peg修飾能力的試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種可用于檢測蛋白質烷基化修飾劑PEG修飾能力的試劑盒及其使用方法。本試劑盒內包括有陽性對照谷胱甘肽粉劑、蛋白質與修飾劑反應Buffer緩沖液、NaH2PO4溶液、5,5－二硫代對二硝基苯甲酸（DTNB）顯色液。該試劑盒的使用方法是設置蛋白質經修飾劑修飾與蛋白質不經修飾劑修飾兩組，分別用5,5－二硫代對二硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑，利用分光光度計測定在波長412nm下兩組反應體系的吸光值，根據兩組吸光值的差異來檢測蛋白質烷基化修飾劑PEG的修飾能力。該試劑盒整個檢測過程在60min內可完成，快速，簡便，并且穩定性好、保存期長，具有重要的推廣應用價值。
【專利說明】一種檢測蛋白質烷基化修飾劑PEG修飾能力的試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測試劑盒及其使用方法。更具體地，涉及ー種可用于檢測蛋白質烷基化修飾劑PEG修飾能力的試劑盒及其使用方法。
【背景技術】
[0002]蛋白質化學修飾具有十分重要的作用，它使蛋白質的結構更為復雜，功能更為完善，調節更為精細，作用更為專一。20世紀50年代末期，用化學修飾的方法研究蛋白質分子的結構與功能的關系成為生物化學和分子生物學領域的熱點。蛋白質化學修飾的目的是用于生物醫學和生物技術方面。在生物醫學方面，化學修飾可以降低免疫原性的免疫反應性、抑制免疫球蛋白E的產生等；在生物【技術領域】，酶經過化學修飾后能夠在有機溶劑中高效地發揮催化作用，并表現出新穎的催化性能。
[0003]蛋白質修飾劑與蛋白質發生反應的性質，主要可以分為四種類型:(I)酰化及其相關反應，這類修飾劑可以與蛋白質的側鏈基團發生酰基化反應；(2)烷基化反應，這類修飾劑的特點是帶有活潑的鹵素原子，由于鹵素原子的電負性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導致蛋白質分子的親核基團發生烷基化；(3)氧化和還原反應，這類修飾劑具有氧化性，能將側鏈基團氧化；(4)芳香環取代反應，蛋白質氨基酸殘基的酚羥基在3和5位上很容易發生親電取代的碘化和硝化反應。有代表性的修飾劑有こ酰咪唑、鹵代こ酸、N-乙基馬來酰亞胺、碳化二亞胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-鹵代琥珀酰亞胺、こ二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/順丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、環糊精、聚 乙二醇(PEG )等。其中，PEG溶解性好，毒性低，無免疫原性，蛋白質經其修飾后不但保持了水溶性而且在有機溶劑中的溶解性也増加了，因此PEG類修飾劑應用最多。
[0004]由于PEG的醇羥基化學性質不活潑，所以必須通過特定的活化劑與其反應使之活化。其中氰尿酰氯法是比較經典的方法。該法具有活化反應操作簡單、所活化的PEG修飾能力強、修飾蛋白質穩定性高等優點，是目前最常用的PEG活化方法之一。經氰尿酰氯活化后的PEG帶上^!素原子，由于鹵素原子的電負性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導致蛋白質分子的親核基團(例如-SH，-NH2等)發生烷基化反應，且巰基基團是蛋白質分子中最容易反應的側鏈基團。因此活化的PEG修飾劑很容易與蛋白質中的巰基與氨基發生反應。
[0005]但是氰尿酰氯也存在著易水解的問題，水解后的氰尿酰氯即失去活化PEG的能力，此外活化后修飾劑的放置時間對其修飾能力產生很大影響，通常情況下，隨著活化PEG在冰箱中放置時間的延長，其修飾蛋白質的能力會越來越低，并最終失去修飾能力。另外在制備PEG修飾劑的過程中，隨著操作及反應條件的變化，PEG修飾能力也會有較大的差異。所以及時了解和掌握PEG修飾劑修飾蛋白質的能力具有重要的意義。
[0006]目前還沒有理想有效的測定各種活化PEG修飾蛋白質的能力的方法的相關報道。常遠等(1996)以牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白，采用凝膠電泳法來測定各種活化PEG的修飾能力，但該方法操作麻煩、操作時間長、結果不理想，而且不能定量的檢測活化PEG修飾蛋白質的能力。
[0007]本試劑盒發明人發現可以利用修飾劑與蛋白質在一定比例和一定的條件下進行反應，反應結束后，用5，5 —二硫代對二硝基苯甲酸(DTNB)為顯色劑，利用分光光度計測定反應后反應體系的吸光值，根據蛋白質經PEG修飾與不經修飾兩組反應體系吸光值的差異來檢測蛋白質烷基化修飾劑PEG的修飾能力。
[0008]該方法利用氰尿酰氯法活化的蛋白質烷基化修飾劑(例如活化的PEG)帶有活潑的鹵素原子，由于鹵素原子的電負性，使烷基帶有部分正電荷，很容易導致蛋白質分子的親核基團(例如-NH2, -SH等)發生烷基化反應，因此蛋白質分子的側鏈基團氨基、巰基等在一定的條件下可以與活化的PEG反應，生成PEG-蛋白。以GSH為例，GSH與活化的PEG修飾劑的反應式如下:
【權利要求】
1.一種檢測蛋白質烷基化修飾劑修飾能力的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內包括有谷胱甘肽粉劑、蛋白質與修飾劑反應Buffer緩沖液、NaH2PO4溶液、5，5 一二硫代對二硝基苯甲酸顯色液。
2.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒內包括: 谷胱甘肽粉劑1.536mgX 10支； Buffer 緩沖液0.lmol/L , 16OmL ； NaH2PO4 溶液3.2mol/L, 250mL ； .5,5 —二硫代對二硝基苯甲酸顯色液 1.0mmol/L, 25mL。
3.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述的蛋白質烷基化修飾劑為聚乙二醇。
4.根據權利要求1或2所述試劑盒，其特征在于，所述的反應Buffer緩沖液按如下組分配制得到: .0.04mol/L 巴比妥鈉50.0mL ； .0.2mol/L HCl0.825mL ； 蒸餾水定容至IOOmL ； 然后用PH計調節pH值至9.0。
5.根據權利要求1或2所述試劑盒，其特征在于，所述的5，5一二硫代對二硝基苯甲酸顯色液按如下組分配制得到: DTNB20mg ； 檸檬酸三鈉500mg ； 雙蒸水溶解并稀釋定容至50mL，置于棕色瓶避光4°C保存。
6.根據權利要求1或2所述試劑盒，其特征在于，所述谷胱甘肽粉劑在每次測定前，取I支用buffer緩沖液定容至5mL，得到1.0mmol/L的GSH溶液。
7.權利要求1或2所述試劑盒的使用方法，其特征在于，使用步驟如下: .51.準備活化的待檢測修飾劑和待修飾的蛋白質溶液； .52.檢測實驗分為兩組:按照2:1的摩爾比分別準備SI準備好的修飾劑與蛋白質溶液作為測定組，蛋白質溶液作為對照組； .53.分別將S2測定組中加入權利要求3所述Buffer緩沖液，修飾劑與蛋白質溶液進行反應，反應體系的pH值為9.0、，反應溫度為35°C~55°C、反應時間為3(T50min ； .54.分別往S3所述反應體系和對照組中加入5，5一二硫代對二硝基苯甲酸顯色液，利用分光光度計測定在波長412nm下兩組反應體系的吸光值； .55.根據S4測定的兩組吸光值的差異來判斷和/或計算出待檢測修飾劑對待修飾蛋白質的修飾能力；計算公式為:
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8.根據權利要求7所述使用方法，其特征在于，SI所述活化的待檢測修飾劑優選的活化方法如下: . 511.用無水苯重結晶三聚氰氯； .512.取Sll處理的三聚氰氯溶解于含無水碳酸鈉的無水苯中，加入修飾劑，室溫下攪拌過夜后過濾； 取濾液在攪拌下加入乙醚，得白色沉淀，繼續攪拌后抽濾，所得沉淀用無水苯溶解；上述沉淀、溶解重復操作多次，直到紫外檢測無三聚氰氯的吸收峰為止； S13.將S12處理的修飾劑真空抽干后密封冷藏保存備用。
9.根據權利要求7所述使用方法，其特征在于，S3所述反應溫度為45°C、反應時間為40mino
10.根據權利要求7所述使用方法，其特征在于，所述待修飾的蛋白質溶液濃度為。1.0mmol/L，使用Buffer緩沖 液配制；以谷胱甘肽作為待修飾蛋白質的陽性對照。
【文檔編號】G01N21/78GK103575730SQ201310494929
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月21日 優先權日:2013年10月21日
【發明者】陳芳艷, 王林川, 馮定遠 申請人:華南農業大學