基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋成像的方法

基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋成像的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋成像的方法，包括：將指印轉移到基底上，得到指印樣本；往所述指印樣本的指印上加入手指代謝物的抗體溶液進行孵育，孵育完成后用緩沖液進行沖洗；將所述的指印樣本干燥，然后向指印上加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育；孵育后，用所述的緩沖液沖洗指印樣本，干燥后將指印樣本置于化學發光反應底物溶液中，采集指紋圖像。本發明的方法簡單、快速、發光強度高，成像效果好。
【專利說明】基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋成像的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學和指紋檢測【技術領域】，尤其涉及一種基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋成像的方法。
【背景技術】
[0002]潛在指紋是經身體自然分泌物(如汗液)轉移形成的指紋紋路，目視不易發現，是案發現場中最常見的指紋。據我國各地不完全統計，警方偵破的刑事案件中，利用指紋破案占七成以上，并且比例正在逐年上升。通常情況下，指紋是犯罪分子在現場留下的最直接物證，所以，研究潛在指紋的顯現技術，是提高指紋物證的采取率和利用率的重要環節。
[0003]現代指紋學的發展已經具有上百年的歷史，按照顯現原理的不同，傳統的潛在指紋顯現方法主要分為三類:光學顯現法、化學顯現法以及物理吸附法。其基本原理是使用一種光線或物質作用于指紋印痕的汗液物質，使不能看見的潛在指紋變為可見的。發展至今，指紋檢測不僅在法醫鑒定、個體識別方面起著重要作用，同時廣泛應用于日常生活中的安全檢驗、訪問控制、個人認證等領域。近年來隨著分析科學的發展，人們對指紋的研究已不僅僅停留在利用傳統物理或化學手段對其形貌進行觀察，同時更加致力于發展各種新興技術如質譜成像、紅外/拉曼成像、掃描電化學顯微鏡以及熒光免疫成像等，對指紋中的成分進行分析檢測，從而發掘出更多有價值的生物學和醫學信息。比如，恐怖分子是否接觸過爆炸物、一個人是否具有吸煙的習慣，科學家都可以通過指紋檢測來獲取相關信息。
[0004]盡管指紋顯現技術在刑偵及分析科學中發揮著重大作用，但是目前在指紋顯現領域中仍然存在諸多困難。例如，在傳統方法中，大多要引用一種外源物質來對潛在指紋進行顯現，處理過程較為繁瑣復雜，同時對樣本具有破壞性。目前廣泛使用的煙熏法和刷粉法中采用的小粒度粉末對技術人員存在一定的身體損傷。而新興的指紋技術如質譜成像法和紅外/拉曼成像法，則需要用到昂貴的大型儀器和專業的操作知識，不利于普及。因此目前仍然需要一種簡單、快速、適用范圍廣的方法對潛在指紋進行顯現。
[0005]化學發光酶聯免疫分析是將抗原與抗體的高特異性免疫反應與高靈敏的化學發光檢測技術相結合的分析方法。它克服了放射性免疫因使用放射性同位素而引起的放射性危害及污染問題，克服了熒光免疫分析中所需儀器復雜、背景干擾大的缺點，具有靈敏度高、儀器價格低、使用簡便、安全、無放射性污染等獨特的優勢，已成為標記免疫的重要研究方向。伴隨著高靈敏度、高分辨率CCD檢測裝置的出現，化學發光成像檢測技術有了顯著進步。與常規化學發光分析技術相比，化學發光成像技術可以提供直觀圖像，能產生光學圖像的動態信息，用于生物分祈、醫學臨床診斷時也顯得更為方便。目前并未有利用化學發光酶聯免疫分析來對指紋進行檢測和成像的報道。

【發明內容】

[0006]本發明提供了一種基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋成像的方法，該方法簡單、快速、靈敏且發光強度高，能夠對指紋進行清晰的成像。[0007]—種基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋檢測與成像的方法，包括:
[0008](I)將指印轉移到基底上，得到指印樣本；
[0009](2)往所述指印樣本的指印上加入手指代謝物的抗體溶液進行孵育，孵育完成后用緩沖液進行沖洗；
[0010](3)將所述的指印樣本干燥，然后向指印上加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行
孵育；
[0011](4)孵育后，用所述的緩沖液沖洗指印樣本，干燥后將指印樣本置于化學發光反應底物溶液中，采集指紋圖像。
[0012]人類指紋皮膚表面布滿汗腺，觸物留痕。一般來說留在客體表面的指紋物質較少，一般為0.llmg，其中99%為水分，會迅速蒸發掉；固體物質只占1%，其中2/3是有機物質，如:氨基酸、蛋白質、脂肪酸、尿素等；剩余1/3是無機物質。首先選擇手指代謝物的抗體(一抗)，以及辣根過氧化氫酶(HRP)標記的二抗，通過抗體與代謝物的特異性免疫反應，使HRP間接標記到指紋上，然后通過化學發光反應，即可顯示出指紋紋路。
[0013]步驟(I)中，所述的指印可以為血指印或汗潛指印。
[0014]所述的基底并沒有特殊要求，可以為玻璃板、塑料板、不銹鋼板、錫箔、紙片、膠帶
坐寸ο
[0015]當所述的指印為血指印時，所述的手指代謝物具體可以為IgG。
[0016]當所述的指印為汗潛指印時，所述的手指代謝物為表皮生長因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽 Dermcidin。
[0017]試驗發現，以IgG、表皮生長因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽Dermcidin四種代謝物為目標對象進行檢測，可成功對指紋成像，且指紋紋理清晰。
[0018]其中，IgG的抗體為羊抗人IgG，具體可購自生工生物工程有限公司，貨號為DAC1011 ;表皮生長因子抗體具體可購自生工生物工程有限公司，貨號為DA1709 ;溶菌酶抗體可購自生工生物工程有限公司，貨號為DA2322 ;人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體可購自百奇生物科技有限公司，貨號AP6 718b。
[0019]所述抗體溶液的濃度為0.05?0.2mg/mL,優選的，所述抗體溶液的濃度為0.1mg/mL。抗體溶液的濃度過高不僅浪費試劑，還會導致非特異性結合，或顯色背景重，而濃度過低，則會導致抗原與抗體的反應不完全，化學發光強度弱，從而影響指紋成像效果。
[0020]為使反應充分進行，加入抗體溶液后，所述孵育的時間為25?35min,優選為30mino
[0021]所述辣根過氧化物酶標記的二抗的濃度為0.005?0.015mg/mL,優選為0.0lmg/mL。二抗濃度過高會增加非特異性結合，且發光強度也不會無限增強，二抗濃度過低則導致化學發光強度弱，指紋成像不清晰。
[0022]為使反應充分進行，加入辣根過氧化物酶標記的二抗后，所述孵育的時間為25?35min,優選為 30min。
[0023]步驟(2)和(4)中，所述的緩沖液為含0.1%吐溫-20的PBS緩沖液。
[0024]所述的化學發光反應底物溶液為含0.15M似(:1、3.0\10-%魯米諾、1.4X10_4M對碘苯酚和1.2X 10_3M過氧化氫的Tris-HCl緩沖溶液，Tris-HCl緩沖溶液的pH為8.5。在辣根過氧化物酶的催化作用下，化學發光反應底物溶液中的H2O2與魯米諾在指紋上產生波長425nm的化學發光，從而顯現出指紋紋路。采用該種化學發光反應底物溶液可達到較好的發光效果。
[0025]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0026](I)本發明的方法簡單、檢測迅速，只需數秒鐘即可得到完整的指紋圖像，遠遠快于掃描電化學顯微鏡技術(十幾至幾十小時)。
[0027](2)本發明的方法不需要昂貴儀器，便于現場快速實時檢測，且發光試劑具有造價低、環境友好的優點。
[0028](3)本發明以酶聯免疫分析為檢測手段、化學發光成像為信號獲取方式，與廣泛使用的熒光法相比，本發明的方法不需要外加激發光源，因此不存在背景光干擾，指紋圖像更加顯著清晰。
[0029](4)本發明方法的靈敏度高，可實現汗潛指印中痕量代謝物(表皮生長因子、溶菌酶、人汗腺抗菌肽Dermcidin等)的特異性檢測，能夠在進行個體識別的同時還能實現汗潛指印成分分析的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是化學發光反應池的結構示意圖；
[0031]其中，1、底座；2、池體；3、凹槽；4、0型密封圈；5、螺栓；6、樣本；
[0032]圖2a為羊抗人IgG濃度為0.0lmg/mL時檢測的血指印化學發光圖；
[0033]圖2b為羊抗人IgG濃度為0.lmg/mL時檢測的血指印化學發光圖；
[0034]圖2c為羊抗人IgG濃度為0.2mg/mL時檢測的血指印化學發光圖；
[0035]圖3a為兔抗羊IgG/HRP濃度為0.0Olmg/mL時檢測的血指印化學發光圖；
[0036]圖3b為兔抗羊IgG/HRP濃度為0.0lmg/mL時檢測的血指印化學發光圖；
[0037]圖3c為兔抗羊IgG/HRP為0.05mg/mL時檢測的血指印化學發光圖；
[0038]圖4a為一抗孵育時間為IOmin時檢測的血指印化學發光圖；
[0039]圖4b為一抗孵育時間為30min時檢測的血指印化學發光圖；
[0040]圖4c為一抗孵育時間為45min時檢測的血指印化學發光圖；
[0041]圖5為采用優化后的試驗條件，用羊抗人IgG檢測得到的血指印化學發光圖；
[0042]圖6a為直接標記法檢測的血指印化學發光圖；
[0043]圖6b為間接標記法檢測的血指印化學發光圖；
[0044]圖7為用表皮生長因子抗體檢測得到的潛在指紋化學發光圖；
[0045]圖8為用溶菌酶抗體檢測得到的潛在指紋化學發光圖；
[0046]圖9為用人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體檢測得到的潛在指紋化學發光圖。
【具體實施方式】
[0047]下面結合【具體實施方式】進一步闡釋本發明。
[0048]本發明采用的裝置為化學發光反應池。如圖1所示，該化學發光反應池包括底座I和池體2，均可采用聚四氟乙烯材料，底座I上具有用于容納樣本6的凹槽3。
[0049]池體2通過螺栓5固定在底座I上,池體2中空,池體2的中空部位正對凹槽3，且該中空部位設有O型密封圈4。[0050]使用時，將樣本置于凹槽3內，向池體內加入化學發光底物溶液，樣本上產生的化學發光會被高靈敏CCD照相機捕獲，由此得到指紋圖像。
[0051]值得注意的是，本發明的實現并不依賴于該裝置。
[0052]試劑溶液
[0053](I)表皮生長因子抗體:購自生工生物工程有限公司，貨號為DA1709 ；
[0054](2)溶菌酶抗體:購自生工生物工程有限公司，貨號為DA2322 ；
[0055](3)人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體:購自百奇生物科技有限公司，貨號為AP6718b ；
[0056](4)羊抗人IgG:購自生工生物工程有限公司，貨號為DAC1011 ；
[0057](5)兔抗羊 IgG/HRP:購自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.,貨號為305-065-003 ；
[0058](6)羊抗兔IgG/HRP:購自北京博奧森生物技術有限公司，貨號為bsb-0295G ；
[0059](7) PBS-T:0.1% 吐溫-20 的 PBS 緩沖液，pH 為 7.4。
[0060](8)化學發光反應底物溶液:含0.15M NaCl、3.0父10-%魯米諾、1.4父10-%對碘苯酚和1.2X 10-3M過氧化氫的Tris-HCl緩沖溶液，Tris-HCl緩沖溶液的pH為8.5。
[0061]實施例1 [0062]1、不同羊抗人IgG濃度對指紋采集的影響
[0063](I)手指上蘸少量新鮮血液，在載玻片上按一枚血指印；
[0064](2)免疫標記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴散，將100 μ L羊抗人IgG (抗體溶解時的溶劑均為含2%BSA，0.1%吐溫-20的PBS)滴在指印上，于室溫培養30min,用PBS-T沖洗以洗去未結合的抗體，用IS氣將表面吹干，再將100 μ L0.01mg/mL兔抗羊IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0065](3)化學發光成像:將上述處理的載玻片(即樣本)安裝在化學發光反應池中，加入化學發光反應底物溶液，CCD照相機采集指紋圖像。
[0066]按照上述方法，采用不同的一抗(羊抗人IgG)的濃度(分別為0.01、0.1、0.211^/mL)進行試驗,如圖2a-2c所示,一抗濃度太低(0.01mg/mL)時化學發光較弱,指紋某些部位不夠清晰，而一抗濃度為0.lmg/mL可以使反應充分,繼續提高一抗的濃度(0.2mg/mL)也不會使化學發光更強，所以一抗的濃度選用0.lmg/mL時效果較佳。
[0067]2、不同二抗濃度對指紋采集的影響
[0068]按照“1、不同羊抗人IgG濃度對指紋采集的影響”的方法，羊抗人IgG的濃度為0.lmg/mL，二抗(兔抗羊IgG/HRP)的濃度分別為0.001,0.01,0.05mg/mL，其余條件不變。
[0069]采集的指紋圖像如圖3a_3c所示,可以看出二抗的濃度(0.001mg/mL)太低時化學發光較弱，指紋圖像不清晰，二抗的濃度為0.01mg/mL可以使反應充分,繼續提高二抗的濃度(0.05mg/mL)也不會使化學發光更強,所以二抗的濃度為0.01mg/mL時效果較佳。
[0070]3、一抗孵育時間對指紋采集的影響
[0071]按照“1、不同羊抗人IgG濃度對指紋采集的影響”的方法，羊抗人IgG的濃度為0.lmg/mL, 二抗(兔抗羊IgG/HRP)的濃度為0.01mg/mL,加入一抗后，室溫培養時間分別為10min、30min、45min,其余條件不變。[0072]采集的指紋圖像如圖4a_4c所示，可以看出室溫培養時間為IOmin時，反應不夠充分，化學發光較弱，指紋圖像不夠清晰，室溫培養時間為30min時反應充分，繼續提高反應時間（45min)也不會使化學發光更強,所以反應時間優選為30min。
[0073]二抗的孵育時間可采用與一抗相同的孵育時間。
[0074]4、最優條件
[0075](I)手指上蘸少量新鮮血液，在載玻片上按一枚血指印；
[0076](2)免疫標記：用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴散，將100 μ L O. lmg/mL羊抗人IgG滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗以洗去未結合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L 0.05mg/mL兔抗羊IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0077](3)化學發光成像：將上述處理的載玻片安裝在化學發光反應池中，加入化學發光反應底物溶液，CCD照相機采集指紋圖像。[0078]圖5示出了采用優化后的反應條件后采集的化學發光圖像，指紋的紋線清晰分明。
[0079]對比例
[0080](I)手指上蘸少量新鮮血液，在載玻片上按一枚血指印；
[0081](2)免疫標記：用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴散，將100 μ L O. lmg/mL羊抗人IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0082](3)化學發光成像：將上述處理的載玻片安裝在化學發光反應池中，加入化學發光反應底物溶液，CCD照相機采集指紋圖像。
[0083]如圖6a所示，直接用HRP標記的一抗進行處理指紋后成像(直接標記)，指紋不清晰，而采用間接標記（即按照“4、最優條件”方法依次用一抗、HRP標記的二抗處理后成像）后，起到了明顯的信號放大作用，發光更強（圖6b)。
[0084]實施例2
[0085](I)在載玻片上按一枚汗潛指印；
[0086](2)免疫標記：用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴散，將100 μ L O. lmg/mL表皮生長因子抗體滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗以洗去未結合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L O. Olmg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0087](3)化學發光成像：將上述處理的載玻片安裝在化學發光反應池中，加入化學發光反應底物溶液，CCD照相機采集指紋圖像，得到圖7所示的化學發光圖像。
[0088]圖7示出了本實施例采集的化學發光圖像，指紋的紋線清晰分明。
[0089]實施例3
[0090](I)在載玻片上按一枚汗潛指印；
[0091](2)免疫標記：用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴散，將100 μ L O. lmg/mL溶菌酶抗體滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗以洗去未結合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L O. Olmg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。[0092](3)化學發光成像:將上述處理的載玻片安裝在化學發光反應池中，加入化學發光反應底物溶液，CCD照相機采集指紋圖像。
[0093]圖8示出了本實施例采集的化學發光圖像，指紋的紋線清晰分明。
[0094]實施例4
[0095](I)在載玻片上按一枚汗潛指印；
[0096](2)免疫標記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴散，將100 μ L 0.05mg/mL人汗腺抗菌肽Dermcidin抗體滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗以洗去未結合的抗體，用氬氣將表面吹干，再將100 μ L 0.01mg/mL羊抗兔IgG/HRP滴在指印上，于室溫培養30min，用PBS-T沖洗后氬氣吹干。
[0097](3)化學發光成像:將上述處理的載玻片安裝在化學發光反應池中，加入化學發光反應底物溶液，CCD照相機采集指紋圖像。
[0098]圖9示出了本實施例采集的化學發光圖像，指紋的紋線清晰分明。
[0099]上述實施例用來解釋說明本發明，而不是對本發明進行限制，在本發明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發明作出的任何修改和改變，都落入本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種基于化學發光酶聯免疫分析的潛在指紋成像的方法，其特征在于，包括: (1)將指印轉移到基底上，得到指印樣本； (2)往所述指印樣本的指印上加入手指代謝物的抗體溶液進行孵育，孵育完成后用緩沖液進行沖洗； (3)將所述的指印樣本干燥，然后向指印上加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育； (4)孵育后，用所述的緩沖液沖洗指印樣本，干燥后將指印樣本置于化學發光反應底物溶液中，采集指紋圖像。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基底為玻璃板、塑料板、不銹鋼板、錫箔、紙片或膠帶。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的指印為血指印或汗潛指印。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的指印為血指印時，所述的手指代謝物為 IgG。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的指印為汗潛指印時，所述的手指代謝物為表皮生長因子、溶菌酶或汗腺抗菌肽Dermcidin。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體溶液的濃度為0.05~0.2mg/mL。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述辣根過氧化物酶標記的二抗的濃度為0.005 ~0.015mg/mL。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)和(4)中，所述孵育的時間為25~35min。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液為含0.1%吐溫-20的PBS緩沖液。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的化學發光反應底物溶液為含0.15MNaCl、3.0X 10-4Μ魯米諾、1.4X 10-4Μ對碘苯酚和1.2 X 10-3Μ過氧化氫的Tris-HCl緩沖溶液。
【文檔編號】G01N33/68GK103543145SQ201310493609
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】蘇彬, 許林茹 申請人:浙江大學