一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法
【專利摘要】一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，它涉及一種基因突變的電化學檢測方法。本發明是要解決現有方法在檢測細胞株基因突變時僅能通過檢測遺傳學終點來確定結果，手段繁復、費用高、誤差大，且會對試驗人員健康造成傷害的問題。本發明的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法步驟如下：一：制備納米復合工作電極；二：使用上述制備的納米復合工作電極分別檢測細胞裂解液、嘌呤堿基單體、嘌呤堿基混合液的電化學信號，分析并確定嘌呤堿基電化學信號所在的峰位；三：用致突變劑使細胞發生突變后，每12h進行電化學檢測，以不同時間電化學信號變化為指標，建立HGPRT基因突變電化學試驗方法。本發明用于電化學檢測方法領域。
【專利說明】—種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種哺乳類動物細胞株基因突變的電化學檢測方法，尤其涉及對核糖轉移基酶基因位點的基因突變電化學檢測。
【背景技術】
[0002]哺乳動物細胞致突變試驗是國際評價致突因素的重要傳統方法，它以哺乳動物細胞為材料，通過檢測細胞中特定基因的突變確定受試物的致突性。次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移基酶(HGPRT )基因是理想的突變生物標志物，它作為內源性結構基因，編碼產生嘌呤代謝補救途徑的關鍵酶，因其具有對各種致突因素敏感、自發突變率低等優點，已成為基因突變研究中的 重要靶基因。在哺乳動物細胞HGPRT基因突變試驗中，HGPRT基因突變會引發嘌呤代謝補救途徑中的關鍵酶一HGPRT活性下降甚至消失，引起相關通路中核苷酸代謝異常，進而導致嘌呤堿基及尿酸含量關系發生特征性變化。因而，如果能夠實時跟蹤檢測這種變化，必然可以及時反映HGPRT基因位點突變情況。
[0003]目前，對傳統的哺乳動物細胞株基因突變的檢測方法僅能通過檢測遺傳學終點來確定基因突變結果，周期較長，一般需要15天以上，易造成假陰性結果，而且手段繁復，費用高、誤差大。另外，試驗中需要熒光和放射性標記，會對試驗人員健康造成傷害。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是為了解決現有方法在檢測傳統的哺乳動物細胞株基因突變時僅能通過檢測遺傳學終點來確定基因突變結果，周期長，手段繁復，費用高、誤差大，易出現由于表達不完全而造成的假陰性結果，而且試驗中需要熒光和放射性標記，會對試驗人員健康造成傷害的問題，而提供的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法。
[0005]本發明的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，它是按以下步驟進行:
[0006]步驟一:將經酸化處理的多壁碳納米管與離子液體研磨混合20_30min，直至形成均勻的電極修飾液，按0.01-0.07uL/mm2的滴涂量將電極修飾液均勻涂敷于玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復合工作電極；其中，碳納米管與離子液體的質量體積比為Img:(15μ L-25y L)；
[0007]步驟二:按4.5X104-5.5 X IO4個/cm2的接種量將模型細胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細胞完全培養液的η個培養皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養箱中培養48h-50h后，取出培養皿，棄去DMEM細胞完全培養液，用pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每個培養皿中按21-24 μ L/cm2的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液，在45_55°C水浴中原位裂解細胞25-35min，獲得細胞裂解液；
[0008]步驟三:用步驟一制備的納米復合工作電極分別檢測嘌呤堿基單體溶液、嘌呤堿基混合溶液和步驟二中得到的細胞裂解液的電化學信號，確定細胞裂解液的電化學信號中嘌呤堿基電化學信號所在的峰位；其中，納米復合工作電極工作條件為溫度25°C、pH=7.2、掃描速度lOOmv/s ;所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為5 X 10_6-9 X 10_6M，溶劑為pH=7.0-7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.0-7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為5 X 10-6-9 X I(T6M ；
[0009]步驟四:按4.5X104-5.5 X IO4個/cm2的接種量將模型細胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細胞完全培養液的η個培養皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養箱中培培養24-26h后，棄去DMEM細胞完全培養液，然后將η個培養皿隨機均分成二組，一組加入含有質量百分含量為0.03-0.13%的致突變劑的無血清DMEM培養液對細胞進行培養l_3h，做為加藥組；另一組用含有0.1%-0.5%DMS0的無血清DMEM培養液對細胞進行培養l_3h，做為陰性對照組；其中，二組無血清DMEM培養液的加入量均為0.2-0.25mL/cm2 ；
[0010] 步驟五:將步驟四的兩組培養的細胞用緩沖液分別沖洗2-3次，然后加入DMEM完全培養液培養，放于37°C、C02體積百分含量為5%的培養箱中培養7-9天，每12h或24h進行電化學檢測，然后以電化學檢測時間為橫坐標，以在步驟三中嘌呤堿基電化學信號所確認的峰位對應的電壓下所測得的基因突變前和突變過程中細胞嘌呤核苷酸代謝電流信號為縱坐標，建立HGPRT基因突變電化學信號變化規律圖，即完成一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法；其中，DMEM細胞完全培養液加入量為0.2-0.25mL/cm2。
[0011]本發明包含以下有益效果:
[0012]本發明建立的HGPRT基因突變電化學試驗方法，以細胞內嘌呤含量為檢測指標，在基因突變表達期7天內，便可觀察到明顯的兩個電化學信號的變化，其中信號一(0.7V左右)，在第四天對照組和加藥組開始有明顯變化，而信號二(1.0V左右)在表達期第三天開始即有明顯變化，說明采用電化學方法檢測基因突變在表達期7天內即可完成基因突變檢測。
[0013]本發明的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法利用電化學靈敏、快速、客觀的特點，突破了傳統生物學方法僅能檢測基因突變遺傳學終點的限制，通過采用電化學手段檢測細胞中嘌呤含量變化來指示基因突變的情況，首次建立了無標記、快速、原位、實時檢測基因突變的試驗新方法，手段簡單，費用低、誤差小，而且不需要熒光和放射性標記，不會對試驗人員健康造成傷害。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為實施例一中四種標準品與v79細胞循環伏安結果圖；其中，a為鳥嘌呤，b為黃嘌呤，c為腺嘌呤，d為次黃嘌呤，e為四種嘌呤混合物，f為V79細胞；I為信號一，2為信
號二 ;
[0015]圖2為實施例一中V79細胞加藥組峰值與對照組峰信號一電流強度變化趨勢；其中，I為加藥組，2為對照組；
[0016]圖3為實施例一中V79細胞加藥組峰值與對照組峰信號二電流強度變化趨勢；其中，I為加藥組，2為對照組。
【具體實施方式】
[0017]【具體實施方式】一:本實施方式的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于它是按以下步驟進行:[0018]步驟一:將經酸化處理的多壁碳納米管與離子液體研磨混合20_30min，直至形成均勻的電極修飾液，按0.01-0.07uL/mm2的滴涂量將電極修飾液均勻涂敷于玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復合工作電極；其中，碳納米管與離子液體的質量體積比為Img:(15μ L-25y L)；
[0019]步驟二:按4.5X104-5.5 X IO4個/cm2的接種量將模型細胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細胞完全培養液的η個培養皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養箱中培養48h-50h后，取出培養皿，棄去DMEM細胞完全培養液，用pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每個培養皿中按21-24 μ L/cm2的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液，在45_55°C水浴中原位裂解細胞25-35min，獲得細胞裂解液；
[0020]其中，接種量是根據培養皿總面積內所接種細胞總數量計算得到，DMEM細胞完全培養液含量是根據培養皿總面積內所加入DMEM細胞完全培養液的總量計算得到，加入PBS緩沖溶液的量是根據培養皿總面積內所加入PBS緩沖溶液的總量計算得到。
[0021]步驟三:用步驟一制備的納米復合工作電極分別檢測嘌呤堿基單體溶液、嘌呤堿基混合溶液和步驟二中得到的細胞裂解液的電化學信號，分析對比獲得的電化學檢測數據，確定細胞裂解液的電化學信號中嘌呤堿基電化學信號所在的峰位；其中，檢測前將所得納米復合工作電極置于pH=7.0~7.4的PBS溶液中，在0.0~1.1V范圍內循環伏安法掃描至背景穩定；納米復合工作電極工作條件為溫度25V、pH=7.2、掃描速度lOOmv/s ；所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為5X 10_6-9X 10_6M，溶劑為pH=7.0-7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.0-7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為5Χ10-6-9Χ10-6Μ ；
[0022]其中，各嘌呤堿基 單體均購自百靈威科技有限公司。
[0023]步驟四:按4.5X104-5.5 X IO4個/cm2的接種量將模型細胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細胞完全培養液的η個培養皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養箱中培養24-26h后，棄去DMEM細胞完全培養液，然后將η個培養皿隨機均分成二組，一組加入含有質量百分含量為0.03-0.13%的致突變劑的無血清DMEM培養液對細胞進行培養l_3h，做為加藥組；另一組用4-6mL含有0.1%-0.5%DMS0的無血清DMEM培養液對細胞進行培養l_3h，做為陰性對照組；其中，二組無血清DMEM培養液的加入量均為0.2-0.25mL/cm2 ；
[0024]步驟五:將步驟四的兩組培養的細胞用緩沖液分別沖洗2-3次，然后加入DMEM完全培養液培養，放于37°C、C02體積百分含量為5%的培養箱中培養7-9天，每12h或24h進行電化學檢測，然后以電化學檢測時間為橫坐標，以在步驟三中嘌呤堿基電化學信號所確認的峰位對應的電壓下所測得的基因突變前和突變過程中細胞嘌呤核苷酸代謝電流信號為縱坐標，建立HGPRT基因突變電化學信號變化規律圖，即完成一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法；其中，DMEM細胞完全培養液加入量為0.2-0.25mL/cm2。
[0025]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中所述的研磨混合時間為30min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0026]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:步驟一中所述的電極修飾液滴涂量為0.02uL/mm2。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0027]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟一中所述的檢碳納米管與離子液體的質量體積比為lmg:20y I。其它與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0028]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟二中所述的放于CO2培養箱中培養時間為48h。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0029]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是:步驟二中所述的原位裂解細胞加入的PBS緩沖溶液的加入量為24μ L/cm2，pH=7.4，裂解溫度為50°C，時間為30min。其它與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0030]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一不同的是:步驟三中所述的嘌呤堿基單體濃度均為8 X 10_6M，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為8X 10_6M。其它與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0031]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是:步驟二和步驟四中所述的模型細胞為中國倉鼠肺V79細胞或中國倉鼠卵巢CHO細胞為模型細胞系。其它與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0032]其中，中國倉鼠肺V 79細胞或中國倉鼠卵巢CHO細胞購買自中科院上海細胞庫。
[0033]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一不同的是:步驟四中所述的模型細胞在DMEM細胞完全培養液中培養時間為24h，加藥組和陰性對照組培養時間均為3h。其它與【具體實施方式】一至八之一相同。
[0034]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】一至九之一不同的是:步驟四中所述的致突變劑為ENU或EMS，百分含量為0.06%, DMSO百分含量為0.1%。其它與【具體實施方式】一至九之一相同。
[0035]【具體實施方式】^:本實施方式與【具體實施方式】一至十之一不同的是:步驟五中所述的培養時間為8天，每隔24h進行電化學檢測。其它與【具體實施方式】一至十之一相同。
[0036]【具體實施方式】十二:本實施方式與【具體實施方式】一至i 之一不同的是:步驟五中所述的緩沖液為D-Hanks液或PBS緩沖溶液。其它與【具體實施方式】一至十一之一相同。
[0037]【具體實施方式】十三:本實施方式與【具體實施方式】一至十二之一不同的是:步驟五中所述的緩沖液沖洗次數為2次。其它與【具體實施方式】一至十二之一相同。
[0038]【具體實施方式】十四:本實施方式與【具體實施方式】一至十三之一不同的是:步驟二、步驟四和步驟五中所述的接種量均為5X IO4個/cm2，步驟四中所述的二組無血清DMEM培養液的加入量均為0.23mL/cm2,步驟二和步驟五中所述的DMEM完全培養液加入量均為0.23mL/cm2。其它與【具體實施方式】一至十三之一相同。
[0039]實施例1
[0040]本實施例的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，按以下步驟進行:
[0041]步驟一:將5mg碳納米管與100 μ I離子液體混合,對其研磨20min直至形成均勻的電極修飾液，將0.07 μ I電極修飾液均勻涂敷于直徑為3mm的玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復合工作電極；
[0042]步驟二:按5 X IO4個/cm2的接種量將v79模型細胞接種于含5mL DMEM細胞完全培養液的規格為60mm細胞培養皿中，放于37°C、5%C02培養箱中培養48h后，取出培養皿，棄去DMEM細胞完全培養液，用pH=7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每皿加入500 μ I pH=7.4的PBS緩沖溶液，在50°C水浴中原位裂解細胞30min，獲得細胞裂解液；[0043]其中，中國倉鼠肺V79模型細胞購買自中科院上海細胞庫。
[0044]步驟三:使步驟一制備的納米復合工作電極分別檢測細胞裂解液、嘌呤堿基單體、嘌呤堿基混合液的電化學信號，分析對比獲得的電化學檢測數據，確定細胞裂解液的電化學信號中嘌呤堿基電化學信號所在的峰位；其中，檢測前將所得納米復合工作電極置于pH=7.4的PBS溶液中，在0.0~1.1V范圍內循環伏安法掃描至背景穩定；納米復合工作電極工作條件為溫度25V、pH=7.2、掃描速度lOOmv/s ;所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、為黃嘌呤、為腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為8X 10_6M，溶劑為pH=7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為8X 10_6M。
[0045]其中，各嘌呤堿基單體均購自百靈威科技有限公司。
[0046]步驟四:按5X104個/cm2的接種量將v79模型細胞接種于6個含5mL DMEM細胞完全培養液的規格為60mm細胞培養皿中，培養24h后，隨機均分成二組，一組用5ml含
0.043%致突變劑的無血清DMEM培養液對細胞進行培養3h，做為加藥組；另一組用5ml含有
0.1%DMS0的無血清DMEM培養液對細胞進行培養3h，做為陰性對照組。
[0047]步驟五:將步驟四的兩組培養的細胞分別用pH=7.4的PBS緩沖液沖洗2次，然后每皿加入5mL DMEM完全培養液培養，放于37°C、5%C02培養箱中培養8天，每24h進行電化學檢測，根據步驟三中嘌呤堿基電化學信號所確認的峰位以及基因突變前和突變過程中細胞嘌呤核苷酸代謝電化學信號變化規律，以時間為橫坐標，電流信號為縱坐標，建立HGPRT基因突變電化學信號變化規律圖，即完成一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法。
[0048]與常規哺乳動物突變試驗結果進行比較，驗證EMS致基因突變的電化學檢測方法的可靠性，常規哺乳動物HGPRT位點基因突變試驗按照國標法(GB15193.12-200，體外哺乳類細胞(V79/HGPRT)基因突變試驗)進行。結果如下表所示:
[0049]表1EMS對V79細胞HGPRT基因位點突變頻率的影響
【權利要求】
1.一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于它是按以下步驟進行: 步驟一:將經酸化處理的多壁碳納米管與離子液體研磨混合20-30min，直至形成均勻的電極修飾液，按0.01-0.07uL/mm2的滴涂量將電極修飾液均勻涂敷于玻碳電極表面，室溫下干燥，即得納米復合工作電極；其中，碳納米管與離子液體的質量體積比為Img:(15μ L-25y L)； 步驟二:按4.5X104-5.5X IO4個/cm2的接種量將模型細胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細胞完全培養液的η個培養皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養箱中培養48h-50h后，取出培養皿，棄去DMEM細胞完全培養液，用pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液漂洗；然后每個培養皿中按21-24 μ L/cm2的加入量加入pH=7.0-7.4的PBS緩沖溶液，在45_55°C水浴中原位裂解細胞25-35min，獲得細胞裂解液； 步驟三:用步驟一制備的納米復合工作電極分別檢測嘌呤堿基單體溶液、嘌呤堿基混合溶液和步驟二中得到的細胞裂解液的電化學信號，確定細胞裂解液的電化學信號中嘌呤堿基電化學信號所在的峰位；其中，納米復合工作電極工作條件為溫度25°C、pH=7.2、掃描速度lOOmv/s ;所述的嘌呤堿基單體為鳥嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤或次黃嘌呤中的一種，嘌呤堿基單體溶液濃度為5X 10-6-9X IO-6M,溶劑為pH=7.0-7.4的PBS緩沖液；嘌呤堿基混合液由各嘌呤堿基單體和pH=7.0-7.4的PBS緩沖液混合制成，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為5 X 10-6-9 X I(T6M ； 步驟四:按4.5Χ104-5.5Χ IO4個/cm2的接種量將模型細胞接種于含0.2-0.25mL/Cm2DMEM細胞完全培養液的η個培養皿中，放于37°C、C02體積百分含量為5%培養箱中培養24-26h后，棄去DMEM細胞完全培養液，然后將η個培養皿隨機均分成二組，一組加入含有質量百分含量為0.03-0.13%的致突變劑的無血清DMEM培養液對細胞進行培養l_3h，做為加藥組；另一組用含 有0.1%-0.5%DMS0的無血清DMEM培養液對細胞進行培養l_3h，做為陰性對照組；其中，二組無血清DMEM培養液的加入量均為0.2-0.25mL/cm2 ； 步驟五:將步驟四的兩組培養的細胞用緩沖液分別沖洗2-3次，然后加入DMEM完全培養液培養，放于37°C、C02體積百分含量為5%的培養箱中培養7-9天，每12h或24h進行電化學檢測，然后以電化學檢測時間為橫坐標，以在步驟三中嘌呤堿基電化學信號所確認的峰位對應的電壓下所測得的基因突變前和突變過程中細胞嘌呤核苷酸代謝電流信號為縱坐標，建立HGPRT基因突變電化學信號變化規律圖，即完成一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法；其中，DMEM細胞完全培養液加入量為0.2-0.25mL/cm2。
2.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟一中所述的碳納米管與離子液體的質量體積比為lmg:20y L。
3.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟二中所述的原位裂解細胞加入的PBS緩沖溶液的加入量為24μ L/cm2，pH=7.4，裂解溫度為50°C，時間為30min。
4.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟三中所述的嘌呤堿基單體濃度均為8 X 10_6M，各嘌呤堿基單體在混合液中的終濃度均為 8Χ10-6Μ。
5.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟四中所述的致突變劑為ENU或EMS，質量百分含量均為0.06%, DMSO質量百分含量為.0.1%。
6.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟二和步驟四中所述的模型細胞為中國倉鼠肺V79細胞或中國倉鼠卵巢CHO細胞為模型細胞系。
7.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟四中所述的模型細胞在DMEM細胞完全培養液中培養時間為24h，加藥組和陰性對照組培養時間均為3h。
8.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟五中所述的培養時間為8天，每隔24h進行電化學檢測。
9.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟五中所述的緩沖液為D-Hanks液或PBS緩沖溶液。
10.根據權利要求1所述的一種核糖轉移基酶基因突變的電化學檢測方法，其特征在于步驟二、步驟四和步驟五中所述的接種量均為5X IO4個/cm2，步驟四中所述的二組無血清DMEM培養液的加入量均為0.23mL/cm2,步驟二和步驟五中所述的DMEM完全培養液加入量均為 0.23mL/cm 2。
【文檔編號】G01N27/26GK103540661SQ201310487581
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月17日 優先權日:2013年10月17日
【發明者】李錦蓮, 武冬梅, 藺潤先, 劉繼光, 王景濤, 朱金玲, 高廣剛 申請人:佳木斯大學