一種量子點標記免疫球蛋白的方法

一種量子點標記免疫球蛋白的方法
【專利摘要】本發明屬于納米生物【技術領域】，具體為一種量子點標記免疫球蛋白的方法，包括清洗量子點、活化、二次清洗量子點、清洗免疫球蛋白、偶聯和分離步驟。本發明利用了水溶性量子點的結構特征和EDC活化羧基的反應特點，以及縮合反應的反應特點，通過優化各個步驟的條件，使量子點表面的羧基得到充分的活化并處于合適的標記環境中；通過優化偶聯步驟的條件，使量子點通過縮合反應均能結合到免疫球蛋白的表面，標記效率高。通過排阻層析分離純化經偶聯步驟所得的反應液，可回收未反應的免疫球蛋白繼續進行標記，提高免疫球蛋白的利用率，節約成本。由本發明制備的蛋白-量子點偶聯物的活性高，并且操作及使用的設備簡單，可工業化放大生產。
【專利說明】一種量子點標記免疫球蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及納米生物【技術領域】，尤其涉及一種量子點標記免疫球蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]量子點(QDs)是一種由一定數量的實際原子組成的聚集體，且三維尺寸均小于IOOnm的半導體化合物。量子點具有發光強度高、激發光譜寬、發射光譜窄、熒光壽命長、表面修飾多功能化和穩定性好等眾多優點，在熒光檢測領域具有取代傳統有機熒光染料的潛力，已成為新一代生物熒光標記物。在各種免疫實驗中，通過在蛋白上標記熒光分子以達到跟蹤蛋白和檢測蛋白含量為目的的方法已經被廣泛應用。
[0003]2009年張國華等在《食品科學》(2009，Vol.30, N0.12P254-257)發表了用水溶性量子點標記萊克多巴胺抗體的方法。申請號為201110451644.9的中國專利“一種定量檢測人心急肌鈣蛋白I的熒光免疫層析方法及其試劑盒”和申請號200810048733.7的中國專利“一種檢測乳腺癌石蠟包埋組織抗原的量子點免疫熒光試劑盒”，分別提出了類似的量子點標記免疫球蛋白的方法。但是，這些文獻的中僅描述了量子點標記蛋白的基本原理，僅適用于實驗室科研中量子點的研究，不適于工業化放大生產。此外，現有的量子點標記蛋白的方法存在標記后活性大幅降低、蛋白原料損失過大，標記效率低等問題。

【發明內容】

[0004]本發明解決的技術問題是提供一種可放大工業化生產的量子點標記免疫球蛋白的方法，且解決了免疫球蛋白標記后活性大幅降低、免疫球蛋白損耗大、效率低和成本高的問題。
[0005]為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:一種量子點標記免疫球蛋白的方法，包括以下步驟:
[0006](I)清洗量子點:用pH=7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液清洗量子點至保存量子點的原緩沖液完全除去，用pH=7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液保存量子點并超濾濃縮。
[0007]所述pH=7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液的濃度為10mmol/L。
[0008]所述超濾濃縮為在20-25°C和5000-7000r/min的條件下，用100K的超濾管離心6-8min。
[0009]所述量子點為羧基水溶性量子點；所述羧基水溶性量子點為核殼型量子點或單一化合物形成的量子點。
[0010]所述核殼型量子點為ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子點。
[0011]所述單一化合物為以下化合物中的任一種:第IIIA族元素和第VA族元素形成的化合物、第IIA族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IIB族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IVA族元素和第IVA族元素組成的化合物、第IVA族元素和第VIA族元素組成的化合物。具體地，所述單一化合物為 GaSb、InAs> InP、InGaAs> InAlAs、MgSe、MgTe、CaS>CaSe、CaTe、SrS, SrSe, SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS, CdSe、CdTe、SiC、SiGe、SiSe、SiTe和SiS中的任一種。
[0012](2)活化:按比例分別稱取EDC (1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)，并將EDC和NHS直接加入步驟(I)所得的量子點溶液中，用振蕩器混合5-8次后在23-25°C下反應50-70min，得活化量子點；所述EDC、NHS和量子點的物質的量之比為(20000-25000):5000:1。優選地，EDC、NHS和量子點的摩爾比為25000:5000:1。優選地，在0-4°C且空氣濕度小于或等于30%的條件下稱取EDC和NHS，并將其迅速加入反應液中。更優選地，在0-4°C的冰盒中稱取EDC和NHS。
[0013](3) 二次清洗量子點:用pH=8.3-8.5的硼酸鹽緩沖液清洗步驟(2)所得活化量子點至EDC、NHS和磷酸鹽緩沖液完全除去，用pH=8.3-8.5硼酸鹽緩沖液保存活化量子點并超濾濃縮，備用。
[0014]所述PH=8.5的硼酸鹽緩沖液的濃度為50mmol/L ;所述超濾濃縮為在20_25°C和5000-7000r/min的條件下，用100K的超濾管離心6_8min。
[0015](4)清洗免疫球蛋白:用pH=8.3-8.5的硼酸鹽緩沖液清洗免疫球蛋白并超濾濃縮除去免疫球蛋白原保存液中的NaN3，用pH=8.3-8.5硼酸鹽緩沖液保存免疫球蛋白，備用。
[0016]所述pH=8.3-8.5的硼酸鹽緩沖液的濃度為50mmol/L ;所述超濾濃縮為在1_4°C和3000-5000r/min的條件下，用50K的超濾管離心8_10min。
[0017](5)偶聯:將步驟(3)所得活化量子點溶液與步驟(4)所得免疫球蛋白溶液混合均勻,在23-25°C及不斷搖動下反應5-7h,得蛋白-量子點偶聯物反應液；活化量子點與免疫球蛋白的摩爾比為1:8-10。優選地，活化量子點與免疫球蛋白的摩爾比為1:10，活化量子點的濃度為0.8μπιΟ1/1。
[0018](6)分離:通過排阻層析分離步驟(5)的反應液得蛋白-量子點偶聯物溶液和免疫球蛋白回收液；蛋白-量子點偶聯物溶液經超濾濃縮后加入封閉液并在4°C下保存；免疫球蛋白回收液經超濾濃縮后回收再利用。排阻層析中使用的排阻層析柱的填料為superdex200 或 Sephacryl300,流速為 1.5ml/min,柱長為 40_60cm。所述封閉液為 Gly 封閉液，Gly的濃度為lmg/mL，溶劑為50mmol/L、pH=8.3-8.5的硼酸鹽緩沖液。
[0019]步驟(6)中濃縮后的蛋白-量子點偶聯物溶液中加入NaN3，使蛋白-量子點偶聯物溶液中NaN3的濃度為0.01-0.05mg/mL,以使蛋白-量子點偶聯物溶液可長期保存。
[0020]與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明利用了水溶性量子點的結構特征和EDC活化羧基的反應特點，以及縮合反應的反應特點，通過優化各個步驟的條件，使量子點表面的羧基得到充分的活化并處于合適的標記環境中；通過優化偶聯步驟的條件，使量子點通過縮合反應均能結合到免疫球蛋白的表面，標記效率高。通過排阻層析分離純化經偶聯步驟所得的反應液，可回收未反應的免疫球蛋白繼續進行標記，提高免疫球蛋白的利用率，節約成本。由本發明制備的蛋白-量子點偶聯物的活性高，并且操作及使用的設備簡單,可工業化放大生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為毛細管電泳鑒定實施例1-3的量子點標記效率；
[0022]圖2為實施例2制備的PCT-QDs放置不同時間后的熒光光譜圖；
[0023]圖3為毛細管電泳鑒定實施例5的量子點標記效率。【具體實施方式】
[0024]為了更充分理解本發明的技術內容，下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步介紹和說明。
[0025]實施例1
[0026]選用熒光波長為525nm的CdTe/ZnS核殼型量子點標記降鈣素原(Procalcitonin，PCT)抗體。
[0027](I)清洗量子點:取10 μ L8 μ mol/mL的CdTe/ZnS核殼型量子點于EP(eppendorf)管中，并向EP管中加入2mL10mmol/L，pH=7.2磷酸鹽緩沖液，混勻后用100K超濾管在5000r/min, 25°C條件下離心6min，回收量子點于EP管中。重復以上步驟三次，并使最后一次量子點溶液的總體積不超過50 μ L0用微量pH計檢測量子點溶液的pH并調節pH值至
7.2。
[0028](2)活化:在濕度小于或等于30%及0-4°C的冰盒中稱取2mmol的EDC和0.5mmol的NHS并迅速加入經步驟(I)所得的量子點溶液中，用渦旋振蕩器震蕩均勻后置于搖床上反應50min,反應溫度為23°C,得活化量子點溶液。
[0029](3) 二次清洗量子點:向步驟(2)的活化量子點溶液中加入2mL50mmol/L、pH=8.3的硼酸鹽緩沖液，混勻后用100K超濾管在5000r/min、20°C條件下離心6min，回收量子點于EP管中。重復以上步驟三次，使最后一次活化量子點溶液的總體積不超過200 μ L。用微量PH計檢測活化量子點溶液的pH并調節pH值至8.3。
[0030](4)清洗免疫球蛋白:取0.8 μ mol的PCT抗體于EP管中，加入2mL50mmol/L、pH=8.3硼酸鹽緩沖液，混勻后用50K超濾管在3000r/min、l°C條件下離心8min。重復以上步驟三次，使最后一次PCT抗體溶液總體積不超過50 μ L0用微量pH計檢測PCT抗體溶液的pH并調節pH值至8.3。
[0031](5)偶聯:將步驟(3)的活化量子點溶液與步驟(4)的PCT抗體溶液混合，混勻后置于搖床上反應5h，反應溫度23°C，得PCT抗體-QDs反應液，PCT抗體-QDs簡稱PCT-QDs。用毛細管電泳檢測量子點和PCT抗體的偶聯情況，如圖1所示。
[0032](6)分離:通過排阻層析分離步驟(5)的PCT-QDs反應液，得PCT-QDs溶液和PCT回收溶液。排阻層析柱的填料為superdex200,流速為1.5mL/min,凝膠長40cm。
[0033]用100K超濾管將PCT-QDs溶液超濾濃縮至200 μ L以內，測PCT-QDs溶液的濃度后向其加入Gly (甘氨酸)濃度為lmg/mL的Gly封閉液，然后置于4°C下保存；需長期保存時，還需向其中加入NaN3,使蛋白-量子點偶聯物溶液中NaN3的濃度為0.05mg/mL,嚴禁凍存。將PCT回收液置于EP管中后，用50K超濾管在3000r/min，4°C條件下離心lOmin，檢測濃度后可再次用于相同量子點的標記。
[0034]Gly封閉液的溶劑為50mmol/L、pH=8.3-8.5的硼酸鹽緩沖液。
[0035]實施例2
[0036](I)清洗量子點:取IOyLSy mol/mL的CdTe/ZnS核殼型量子點于EP管中，并向EP管中加入2mL10mmol/L，pH=7.5磷酸鹽緩沖液，混勻后用100K超濾管在8000r/min，25°C條件下離心8min，回收量子點于EP管中。重復以上步驟三次，并使最后一次量子點溶液的總體積不超過50 μ L0用微量pH計檢測量子點溶液的pH并調節pH值至7.5。[0037](2)活化:在濕度小于或等于30%及0-4 V的冰盒中稱取2.5mmolEDC和
0.5mmolNHS并迅速加入經步驟(I)所得的量子點溶液中，用渦旋振蕩器震蕩均勻后置于搖床上反應80min,反應溫度為25°C,得活化量子點溶液。
[0038](3) 二次清洗量子點:向步驟(2)的活化量子點溶液中加入2mL50mmol/L、pH=8.5的硼酸鹽緩沖液，混勻后用100K超濾管在8000r/min、25°C條件下離心8min，回收量子點于EP管中。重復以上步驟三次，使最后一次活化量子點溶液的總體積不超過200 μ L。用微量PH計檢測活化量子點溶液的pH并調節pH值至8.5。
[0039](4)清洗免疫球蛋白:取0.8 μ mol的PCT抗體于EP管中，加入2mL50mmol/L>pH=8.5硼酸鹽緩沖液，混勻后用50K超濾管在5000r/min、4°C條件下離心lOmin。重復以上步驟三次，使最后一次PCT抗體溶液總體積不超過50 μ L0用微量pH計檢測PCT抗體溶液的pH并調節pH值至8.5。
[0040](5)偶聯:將步驟(3)的活化量子點溶液與步驟(4)的PCT抗體溶液混合，混勻后置于搖床上反應7h，反應溫度25°C，得PCT抗體-QDs反應液，PCT抗體-QDs簡稱PCT-QDs。用毛細管電泳檢測量子點和PCT抗體的偶聯情況，如圖1所示。
[0041](6)分離:通過排阻層析分離步驟(5)的PCT-QDs反應液，得PCT-QDs溶液和PCT回收溶液。排阻層析柱的填料為superdex200,流速為1.5mL/min,凝膠長60cm。
[0042]用100K超濾管將PCT-QDs溶液超濾濃縮至200 μ L以內，測PCT-QDs溶液的濃度后向其加入Gly濃度為lmg/mL的Gly封閉液，然后置于4°C下保存；長期保存時，還需向其中加入NaN3,使蛋白-量子點偶聯物溶液中NaN3的濃度為0.05mg/mL，嚴禁凍存。將PCT回收液置于EP管中后，用50K超濾管在3000r/min，4°C條件下離心lOmin，測定濃度后可再次用于相同量子點的標記。
[0043]實施例3
[0044]本實施與實施例1和2的不同之處在于:采用說明書中關鍵參數范圍外的標記條件進行標記，標記效率顯著下降。
[0045](I)清洗量子點-M 10 μ L，8 μ mol/mL的CdTe/ZnS核殼型量子點于EP管中，并向EP管中加入2mL，10mmol/L,pH=7.4磷酸鹽緩沖液，混勻后用100K超濾管在7000r/min，25°C條件下離心8min，回收量子點于EP管中。重復以上步驟三次，并使最后一次量子點溶液的總體積不超過50 μ L0用微量pH計檢測量子點溶液的pH并調節pH值至7.5。
[0046](2)活化:在濕度小于或等于30%及0-4 V的冰盒中稱取2.5mmolEDC和
0.5mmolNHS并迅速加入經步驟(I)所得的量子點溶液中，用渦旋振蕩器震蕩均勻后置于搖床上反應80min,反應溫度為25°C,得活化量子點溶液。
[0047](3)偶聯:將步驟(2)的活化量子點溶液與PCT抗體溶液混合，混勻后置于搖床上反應7h，反應溫度23-25°C，得PCT抗體-QDs反應液，PCT抗體-QDs簡稱PCT-QDs。用毛細管電泳檢測量子點與PCT抗體的偶聯情況，如圖1所示。
[0048]實施例4
[0049]本實施與實施例1的不同之處在于:量子點選用突光波長為650nm的GaSb。
[0050]實施例5
[0051]本實施與實施例1的不同之處在于:實施例1中的各物質的用量均放大5000倍。用毛細管電泳檢測量子點與PCT抗體的偶聯情況，如圖3所示。[0052]驗證實驗:
[0053]通過毛細管電泳鑒定實施例1、2和3制備的PCT-QDs的量子點標記效率，檢測結果如圖1所示。實施例3制備PCT-QDs的方法，QDs的峰面積最大，明顯大于實施例1和實施例2的峰面積。即實施例1和實施例2的方法制備PCT-QDs，量子點與免疫球蛋白的標記率高；實施例3的方法制備PCT-QDs，量子點殘留量大。通過公式PCT-QDs/(PCT-QDs+QDs)計算實施例1-3的量子點標記效率，實施例1的標記效率為98.4%，實施例2的標記效率為97.7%，實施例3的標記效率為81.2%。
[0054]用熒光分光光度計分別檢測實施例1制備的純化后PCT-QDs在放置5min、lh、24h、3d、IOd和30d時的熒光光譜，檢測結果如圖2所示，圖中I為QDs的曲線；2為QDs-PCT，5min的曲線；3為QDs-PCT，Ih的曲線；4為QDs-PCT，3h的曲線；5為QDs-PCT，IOd的曲線；6為QDs-PCT，30d的曲線。放置不同時間段的PCT-QDs的熒光輕度峰值有降低的趨勢，但變化很慢，表明所得PCT-QDs比較穩定。
[0055]通過毛細管電泳鑒定實施例5放大5000倍制備的PCT-QDs的量子點標記效率，檢測結果如圖3所示，QDs的峰面積較小。由此可見，即使放大5000倍進行制備，本方法仍然保持很高的標記效率。
[0056]以上所述僅以實施例來進一步說明本發明的技術內容，以便于讀者更容易理解，但不代表本發明的實施方式僅限于此，任何依本發明所做的技術延伸或再創造，均受本發明的保護。
【權利要求】
1.一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)清洗量子點:用PH=7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液清洗量子點至保存量子點的原緩沖液除去，并用pH=7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液保存量子點；所述量子點為羧基水溶性量子點； (2)活化:向步驟(I)所得的量子點溶液中加入EDC和NHS并混合均勻，在23-25°C下反應50-70min得活化量子點；所述EDC、NHS和量子點的物質的量之比為20000-25000:5000:1 ； (3)二次清洗量子點:用pH=8.3-8.5的硼酸鹽緩沖液清洗步驟(2)所得活化量子點至EDC、NHS和磷酸鹽緩沖液除去，并用pH=8.3-8.5硼酸鹽緩沖液保存活化量子點，備用； (4)清洗免疫球蛋白:用pH=8.3-8.5的硼酸鹽緩沖液清洗免疫球蛋白并超濾濃縮除去免疫球蛋白原保存液中的NaN3，用pH=8.3-8.5硼酸鹽緩沖液保存免疫球蛋白，備用； (5)偶聯:將步驟(3)所得活化量子點溶液與步驟(4)所得免疫球蛋白溶液混合均勻，在23-25°C反應5-7h得反應液；活化量子點與免疫球蛋白的摩爾比為1:8-10 ； (6)分離:通過排阻層析分離步驟(5)的反應液得蛋白-量子點偶聯物溶液和免疫球蛋白回收液；蛋白-量子點偶聯物溶液經超濾濃縮后加入封閉液并在4°C下保存；免疫球蛋白回收液經超濾濃縮后回收再利用。
2.根據權利要求1所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(6)中濃縮后的蛋白-量子點偶聯物溶液中還加入NaN3,使蛋白-量子點偶聯物溶液中NaN3的濃度為 0.01-0.05mg/mL。
3.根據權利要求1所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，EDC、NHS和量子點的摩爾比為25000:5000:1。
4.根據權利要求1所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，活化量子點與免疫球蛋白的摩爾比為1:10。
5.根據權利要求4所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，活化量子點的濃度為0.8μπι01/1。
6.根據權利要求5所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，活化量子點溶液與免疫球蛋白溶液混合后在不斷搖動中反應。
7.根據權利要求1所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(6)中，排阻層析柱的填料為superdex200或Sephacryl300,流速為1.5ml/min,柱長為40_60cm。
8.根據權利要求1所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述封閉液為Gly封閉液，Gly的濃度為lmg/mL，溶劑為50mmol/L、pH=8.3-8.5的硼酸鹽緩沖液。
9.根據權利要求1所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述羧基水溶性量子點為核殼型量子點或單一化合物形成的量子點。
10.根據權利要求9所述一種量子點標記免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述核殼型量子點為ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子點；所述單一化合物為以下化合物中的任一種:第IIIA族元素和第VA族元素形成的化合物、第IIA族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IIB族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IVA族元素和第IVA族元素組成的化合物、第IVA族元素和第VIA族元素組成的化合物。
【文檔編號】G01N33/533GK103487574SQ201310485455
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月16日 優先權日:2013年10月16日
【發明者】張二盈, 章國建 申請人:深圳市大愛醫療科技有限公司