一種用于檢測(cè)早期乳腺癌的試劑盒的制作方法
【專利摘要】用于檢測(cè)早期乳腺癌的試劑盒，其特征在于，包括試劑A、B、C、D、E、F和標(biāo)準(zhǔn)液，具體試劑如下：試劑A的組成為碘化鈉(NaI)和碘(I2)；試劑B的組成為氫氧化鈉,試劑C為2-（N-嗎啉代）乙磺酸,PH值為弱堿性,試劑D為去離子純凈水,試劑E為氯化氫,試劑F為Tris,borate,EDTA；標(biāo)準(zhǔn)液為黃蝶呤溶于2-（N-嗎啉代）乙磺酸，有益效果：成本降低,靈敏度大大提升,無需昂貴儀器的支持,儀器維護(hù)費(fèi)用降低,所需要的溶劑量減少,需要的樣品量較小,且樣品處理過程簡化.整個(gè)測(cè)試時(shí)間減少。
【專利說明】—種用于檢測(cè)早期乳腺癌的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一組癌癥標(biāo)記物分子及其檢測(cè)設(shè)備，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及癌癥早期分子診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是全球死亡的第二大原因，也是全世界所有死亡的13%左右的原因。癌癥死亡率每年類型的癌癥是肺癌(140萬例/年)，胃癌(866，000例/年)，肝癌(653，000例/年)，結(jié)腸癌(677，000例/年)，和乳腺癌(548，000例/年)。全世界癌癥死亡人數(shù)預(yù)計(jì)將繼續(xù)上升，估計(jì)2030年有1200萬人死于癌癥。這些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)充分表明了在全球范圍癌癥發(fā)生的密度和強(qiáng)度.許多研究機(jī)構(gòu)和科學(xué)家專注于癌癥研究，因?yàn)樗乾F(xiàn)代世界的最嚴(yán)重的健康問題之一。
[0003]癌癥發(fā)生時(shí)，在身體的一部分細(xì)胞開始生長失控。正常的細(xì)胞分裂和生長在一種有序的方式，但癌細(xì)胞沒有，他們排擠正常細(xì)胞。雖然有許多種癌癥，都有著共同的特點(diǎn)。癌癥發(fā)展迅速，早期診斷和治療的機(jī)會(huì)大大提高，病人將生存和生活的積極和富有成效的生活。此外，如果在早期階段癌癥診斷，病人將有一個(gè)更大的機(jī)會(huì)成功的治療和更多的治療選擇。目前，在過去的幾十年中，癌癥的診斷主要依據(jù)影像學(xué)評(píng)估，如乳房X光檢查，X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)，磁共振成像(MRI )，正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和腫瘤的病理形態(tài)學(xué)檢查活檢標(biāo)本。但這種方法有顯著的局限性，不能為早期診斷和預(yù)測(cè)腫瘤的潛在的進(jìn)展提供相對(duì)應(yīng)治療的反應(yīng)。
[0004]而通常情況下，病人由于害怕在疾病的診斷過程中給樣品會(huì)損害他們的器官和組織。他們也可能是不愿意給血液診斷測(cè)試。因此，早期癌癥篩查的非侵入性診斷技術(shù)的發(fā)展是非常重要的，所有的人群。非侵入性診斷涉及到程序不穿透人體的機(jī)械，也不會(huì)刺破皮膚或涉及穿透體腔內(nèi)。它不要求進(jìn)入人體或切除生物組織的切口。目前，許多研究人員都專注于通過分析癌癥生物標(biāo)志物在尿，這樣更容易比組織或血液樣本收集非侵入性的方式來診斷癌癥。
[0005]而在癌癥檢測(cè)中利用生物標(biāo)志物，是良好的潛在的早期診斷工具。能對(duì)癌癥早期診斷和預(yù)測(cè)腫瘤的潛在的進(jìn)展提供更好的治療反應(yīng)。
[0006]在這些生物和生理指標(biāo)可包括范圍廣泛的的生化實(shí)體，如核酸，蛋白質(zhì)，糖類，脂類，和小的代謝物，以及全細(xì)胞，在任一特定的組織或流通。今天，循環(huán)腫瘤細(xì)胞正在成為一個(gè)強(qiáng)大的工具，在“微觀”癌癥篩查。檢測(cè)的生物標(biāo)志物，單獨(dú)或作為較大的數(shù)據(jù)集或圖案，可以通過各種各樣的方法，包括從血液或組織樣品的生化分析，生物醫(yī)學(xué)成像。
[0007]蝶啶癌癥篩選研究在過去的二十年中成為焦點(diǎn)，因?yàn)槟繕?biāo)蝶啶水平已被證明反映不同的的癌癥患者代謝產(chǎn)物中。這些蝶啶分布在生物體。蝶啶及其衍生物的某些維生素的合成中起重要作用，它們是細(xì)胞代謝過程中的重要輔助因子。蝶啶人尿中排出體外，它們可以作為潛在生物標(biāo)志物在臨床診斷。通過分析從癌癥患者尿樣中異黃蝶呤和比較它們從健康受試者沒有癌癥的證據(jù)。蝶啶水平要顯著升高時(shí)，細(xì)胞免疫系統(tǒng)被激活的某些疾病，如癌癥，病毒感染，和腎臟病已報(bào)告。在腫瘤相關(guān)的疾病中不同的蝶啶衍生物可以扮演各種角色。每種類型的腫瘤很可能會(huì)導(dǎo)致不同模式的蝶啶濃度的變化。高性能液相色譜(HPLC)的方法已被用于蝶啶分析。但是，它費(fèi)時(shí)昂貴，并導(dǎo)致了不能令人滿意的分離，尤其是對(duì)真實(shí)的尿液樣本，從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確率和靈敏度。另一方面，高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)是快速而有效的，只需要一個(gè)小的樣本大小。此專利開發(fā)并優(yōu)化了高效毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光的檢測(cè)方法來定量分析尿樣中的異黃蝶呤。
[0008]目前針對(duì)蝶呤類分子檢測(cè)的手段多使用高性能液相色譜(HPLC)和高性能液相色譜連用質(zhì)譜(LC-MS).無論是HPLC或者LC-MS，有以下缺點(diǎn)
[0009]I)昂貴的儀器作為支持，平均HPLC體系需要20萬人民幣，LC-MS聞達(dá)百萬人民幣。
[0010]2)儀器維護(hù)費(fèi)用高，每年儀器維護(hù)費(fèi)用高到儀器價(jià)格的10-15%。
[0011]3)所需要的溶劑量巨大，給環(huán)境帶來很大污染.分析同樣一個(gè)樣品，本發(fā)明需要的溶劑量是HPLC LC-MS的1/4。
[0012]4)需要的樣品量較大。
[0013]5)因?yàn)樾枰合嗌V的分離，所以要求相對(duì)簡單的樣品，也就是說需要預(yù)處理樣品，把樣品中的其他雜質(zhì)在分析前除去，這就加大了樣品準(zhǔn)備的難度，增加了分析時(shí)間和成本，因?yàn)樾枰~外的工具和耗材來處理樣品。
[0014]6)靈敏度偏低。
[0015]7)每個(gè)樣品的分析時(shí)間偏長。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0016]發(fā)明目的:解決蝶呤類分子檢測(cè)過程過程中污染大，需樣大，時(shí)間長，長本高，檢測(cè)結(jié)果靈敏底偏底等問題。
[0017]用于檢測(cè)早期乳腺癌的試劑盒，其特征在于，包括試劑A、B、C、D、E、F和標(biāo)準(zhǔn)液，具體試劑如下:
[0018]試劑A的組成為2% - 4%碘化鈉(NaI)和4% — 2%的碘(12)兩處百分比均為質(zhì)量/體積.[0019]試劑B的組成為2摩爾每升的氫氧化鈉，
[0020]試劑C為50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸，PH值為弱堿性，
[0021]試劑D為500微升去離子純凈水，
[0022]試劑E為500微升I 一 2摩爾每升的氯化氫，
[0023]試劑F為500微升0.1摩爾每升Tris, 0.1摩爾每升borate, 2摩爾每升EDTA ；
[0024]標(biāo)準(zhǔn)液為黃蝶呤溶于2- (N-嗎啉代)乙磺酸。
[0025]標(biāo)準(zhǔn)液配方如下:
[0026]標(biāo)準(zhǔn)溶液I為0.01克每升的異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0027]標(biāo)準(zhǔn)溶液2為1x10-3克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0028]標(biāo)準(zhǔn)溶液3為1x10-4克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0029]標(biāo)準(zhǔn)溶液4為1x10-5克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0030]標(biāo)準(zhǔn)溶液5為1x10-6克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸。
[0031]其制備方法如下:
[0032]制備方法，其特征在于，
[0033]試劑A:首先溶解碘化鈉在I升電離水中，充分交辦至全部溶解，再將碘加入到溶液，在37攝氏度下中速攪拌45分鐘.最終溶液需分裝在放鋁箔紙包裹的2毫升樣品罐中，每個(gè)2毫升樣品罐中存有500微升處理試劑.試劑需放置在4攝氏度冰箱中.[0034]試劑B:2摩爾每升的氫氧化鉀，儲(chǔ)存形式為200微升每2毫升樣品罐中.[0035]試劑C: 50微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值為弱堿性，300微升每2毫升樣品罐中存放.[0036]試劑D:500微升去離子純凈水，同樣存于2毫升樣品罐中.[0037]試劑E:500微升2摩爾每升的氯化氫，同樣存于2毫升樣品罐中.[0038]試劑F:500微升0.1摩爾每升Tris, 0.1摩爾每升borate, 2摩爾每升EDTA同樣存于2毫升樣品--中.[0039]標(biāo)準(zhǔn)溶液I為0.01克每升的異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0040]標(biāo)準(zhǔn)溶液2為1 x10-3克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0041]標(biāo)準(zhǔn)溶液3為1x10-4克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0042]標(biāo)準(zhǔn)溶液4為1x10-5克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0043]標(biāo)準(zhǔn)溶液5為1x10-6克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸。
[0044]有益效果:成本降低，靈敏度大大提升，無需昂貴儀器的支持，儀器維護(hù)費(fèi)用降低，所需要的溶劑量減少，需要的樣品量較小，且樣品處理過程簡化.整個(gè)測(cè)試時(shí)間減少。
[0045]說明書附圖
[0046]圖1高效毛細(xì)管電泳一激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)設(shè)備結(jié)構(gòu)圖；
[0047]圖2異黃蝶呤標(biāo)準(zhǔn)樣品的電泳圖；
[0048]圖3患者與健康人尿樣中異黃蝶呤含量圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]一種高效毛細(xì)管電泳一激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)設(shè)備，如圖1所示。365納米波帶濾波片、聚焦鏡頭、樣品檢測(cè)窗、樣品池、濾光片、信號(hào)放大器、光電信號(hào)電壓轉(zhuǎn)換器、數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換器、顯示器，365納米波帶濾波片后按順序間隔一定距離設(shè)置I厘米聚焦鏡頭、樣品檢測(cè)窗、濾光片、聚焦鏡頭、信號(hào)放大器，樣品池通過毛細(xì)管連接于樣品檢測(cè)窗上，毛細(xì)管長50厘米，內(nèi)直徑50微米，材質(zhì)為二氧化硅。毛細(xì)管中段距離陽極25厘米設(shè)有一個(gè)I平方厘米的視窗。信號(hào)放大器后按順序連接光電信號(hào)電壓轉(zhuǎn)換器、數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換器、顯示器。為了降低雜散光和散射光的干擾，提升有效波段激光的強(qiáng)度，我們使用了一個(gè)365納米的濾波器.然后激光信號(hào)通過一個(gè)I厘米的聚焦鏡頭聚焦在毛細(xì)管的樣品檢測(cè)窗口，樣品中的異黃蝶呤受到激發(fā)后會(huì)發(fā)射特殊發(fā)射波，光波通過一個(gè)慮波片和聚焦鏡頭聚焦在光電倍增管的接收器上，光信號(hào)被放大并通過光電倍增管的電流所產(chǎn)生的輸出轉(zhuǎn)換到電壓信號(hào)，然后該模擬信號(hào)被數(shù)字化，并呈現(xiàn)在顯示儀器界面。
[0050]用于檢測(cè)早期乳腺癌的試劑盒，其特征在于，包括試劑A、B、C、D、E、F和標(biāo)準(zhǔn)液，具體試劑如下:
[0051]試劑A的組成為2% - 4%碘化鈉(NaI)和4% — 2%的碘(12)兩處百分比均為質(zhì)量/體積.[0052]試劑B的組成為2摩爾每升的氫氧化鈉，
[0053]試劑C為50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸，PH值為弱堿性，
[0054]試劑D為500微升去離子純凈水，
[0055]試劑E為500微升I 一 2摩爾每升的氯化氫，
[0056]試劑F為500微升0.1摩爾每升Tris, 0.1摩爾每升borate, 2摩爾每升EDTA ；
[0057]標(biāo)準(zhǔn)液為黃蝶呤溶于2- (N-嗎啉代)乙磺酸。
[0058]標(biāo)準(zhǔn)液配方如下:
[0059]標(biāo)準(zhǔn)溶液I為0.01克每升的異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0060]標(biāo)準(zhǔn)溶液2為1x10-3克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0061]標(biāo)準(zhǔn)溶液3為1x10-4克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0062]標(biāo)準(zhǔn)溶液4為1x10-5克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸；
[0063]標(biāo)準(zhǔn)溶液5為1x10-6克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2_ (N-嗎啉代)乙磺酸。標(biāo)準(zhǔn)液的電泳圖如圖2所示。
[0064]人體尿樣結(jié)果:乳腺癌患者的10個(gè)人體尿樣來自于Ellis Fischel CancerCenter, Columbia MO USA,患者均未接受過化學(xué)或者放射治療的，患者的地域分布為美國密蘇里州，年齡在26-70歲之間，期間沒有對(duì)患者的飲食和運(yùn)動(dòng)有任何限制.18個(gè)健康人體的尿液樣本來自于美國密蘇里大學(xué)的在校學(xué)生志愿者，沒有采取任何藥物包括維生素補(bǔ)充劑，年齡范圍在22-45歲。如圖3所示。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)早期乳腺癌的試劑盒，其特征在于，包括試劑A、B、C、D、E、F和標(biāo)準(zhǔn)液，具體試劑如下: 試劑A的組成為2% - 4%碘化鈉(NaI)和4% — 2%的碘(12)兩處百分比均為質(zhì)量/體積.試劑B的組成為2摩爾每升的氫氧化鈉， 試劑C為50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸，PH值為弱堿性， 試劑D為500微升去離子純凈水， 試劑E為500微升I 一 2摩爾每升的氯化氫， 試劑F為500微升0.1摩爾每升Tris, 0.1摩爾每升borate, 2摩爾每升EDTA ； 標(biāo)準(zhǔn)液為黃蝶呤溶于2- (N-嗎啉代)乙磺酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)早期乳腺癌的試劑盒，其特征在于，標(biāo)準(zhǔn)液配方如下: 標(biāo)準(zhǔn)溶液I為0.01克每升的異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸； 標(biāo)準(zhǔn)溶液2為1x10-3克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸； 標(biāo)準(zhǔn)溶液3為1x10-4克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸； 標(biāo)準(zhǔn)溶液4為1x10-5克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸； 標(biāo)準(zhǔn)溶液5為1x10-6克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸。
3.權(quán)利要求1或2的制備方法，其特征在于， 試劑A:首先溶解碘化鈉在I升電離水中，充分交辦至全部溶解，再將碘加入到溶液，在37攝氏度下中速攪拌45分鐘.最終溶液需分裝在放鋁箔紙包裹的2毫升樣品罐中，每個(gè)2毫升樣品罐中存有500微升處理試劑.試劑需放置在4攝氏度冰箱中.試劑B:2摩爾每升的氫氧化鉀，儲(chǔ)存形式為200微升每2毫升樣品罐中.試劑C:50微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HPO4)和磷酸的混合物，PH值為弱堿性，300微升每2毫升樣品罐中存放.試劑D:500微升去離子純凈水，同樣存于2毫升樣品罐中.試劑E:500微升2摩爾每升的氯化氫，同樣存于2毫升樣品罐中.試劑F: 500微升0.1摩爾每升Tris, 0.1摩爾每升borate, 2摩爾每升EDTA同樣存于2暈升樣品iiS中.標(biāo)準(zhǔn)溶液I為0.01克每升的異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸； 標(biāo)準(zhǔn)溶液2為1x10-3克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸； 標(biāo)準(zhǔn)溶液3為1x10-4克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸； 標(biāo)準(zhǔn)溶液4為1x10-5克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸； 標(biāo)準(zhǔn)溶液5為1x10-6克每升異黃蝶呤溶于50微摩爾每升的2- (N-嗎啉代)乙磺酸。
【文檔編號(hào)】G01N33/52GK103529196SQ201310484456
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】成曉亮, 季軍, 馬銀法 申請(qǐng)人:江蘇禾爾思生物科技有限公司