一種植物根組織活體組織切片的熒光染色技術及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種植物根組織活體組織切片的熒光染色技術及其應用。本發明公開的一種對植物根組織進行染色的方法，包括如下步驟：將植物根組織置于PI水溶液中，進行染色，即得被染上色的植物根組織。本發明提供的一種植物根組織活體組織切片的熒光染色技術，克服了常規切片過程中高溫或低溫固定包埋對根尖幼嫩組織產生的損傷，并且操作流程簡單，極大的節省了切片制作的時間，利用本發明的方法可以實現快速便捷的制作植物根組織活體組織切片的目的。
【專利說明】一種植物根組織活體組織切片的熒光染色技術及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物根組織活體組織切片的熒光染色技術及其應用。
【背景技術】
[0002]切片技術是組織學常規制片技術中最為廣泛應用的方法。該種技術不僅用于觀察 正常細胞組織的形態結構，也是病理學和植物學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的 形態變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。組織切片伴 隨著顯微鏡技術和免疫實驗等的發展而得到廣泛的應用。但是在切片(如石蠟切片、冰凍切 片)制作過程中，材料經常會要經過高溫或低溫固定包埋，導致材料組織變形或破碎。同時 現有的切片技術，固定包埋的步驟繁瑣，時間周期過長。為了快速簡單的得到形態完整的組 織切片，活體切片是最簡單有效的切片方法。
[0003]研究表明，由于根尖是透明的，并且涵蓋了根系生長成熟的不同位點，是研究植物 發育的很好材料。同時根系除了支持植物的地上部分，還是植物吸收水分和養分的主要器 官，根系發育直接關系到作物的產量。由于根系的重要性，根尖的結構引起越來越多的研究 人員的重視。根尖是植物根系中最“柔軟脆弱”的組織，高溫或低溫情況下，根尖細胞極易 變形或破碎。現有的應用于根尖的切片技術還存在很多不完善的地方，主要表現在以下三 方面:一是組織切片流程繁瑣，耗費的時間和經費大；二是制作過程中，通常對材料高溫或 低溫處理，對于“鮮嫩”的新生組織，尤其是根尖組織細胞極易變形或破碎；三是根尖樣品長 度相對長(超過5_)，切片很難保持樣品的連續性和完整性。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種植物根組織活體組織切片的熒光染色技術及其應用。
[0005]本發明提供的一種對植物根組織進行染色的方法，包括如下步驟:將植物根組織 置于PI水溶液中，進行染色，即得被染上色的植物根組織。
[0006]上述方法中，所述PI水溶液中PI的濃度為l_50mM。
[0007]上述任一所述的方法中，所述染色的時間為l_60min。
[0008]上述任一所述的方法中，所述根組織包括根尖組織和/或根的成熟區。
[0009]上述任一所述的方法中，所述根組織的直徑為10-1050 u m,所述直徑為所述根組 織根基部方向一端的直徑。
[0010]上述任一所述的方法中，所述根組織的長度為2cm。
[0011]上述任一所述的方法中，所述根組織的直徑為10-300 iim時，染色條件如下:PI濃 度為l-5mM，染色時間1-1Omin ;所述根組織的直徑為300-600 y m時，染色條件如下:PI濃 度為5-15mM，染色時間10-20min ;所述根組織的直徑為600-1050 y m時，染色條件如下:PI 濃度為15-50mM，染色時間20-60min，在上述各根段直徑范圍內，隨著根段直徑的增大染色 時間和PI濃度都隨之增大。
[0012]上述任一所述的方法中，所述植物為玉米。[0013]所述方法中，在將植物根組織置于PI水溶液中之前，包括如下步驟:
[0014](I)取植物的根組織，將根組織的分泌物吸取干凈，然后吸干根組織的表面水分；
[0015](2)在環境溫度下，將根組織放到0.1M的磷酸鈉緩沖液或高純水中清洗，清洗后吸干根組織的表面水分；
[0016]所述環境溫度為10_30°C ；
[0017]所述0.1M的磷酸鈉緩沖液的pH為5.8-7.0 ；
[0018]和/ 或，
[0019]上述方法中，在將植物根組織置于PI水溶液中進行染色之后，包括如下步驟:
[0020]( I)把根組織放到高純水中，搖床漂洗；
[0021]所述漂洗的時間為15_30min ；
[0022]上述步驟也屬于本發明的保護范圍。
[0023]上述任一所述的方法中，將根組織放到0.1M的磷酸鈉緩沖液中清洗的條件是所述根組織取材于非中性環境。
[0024]上述任一所述的方法中，將根組織放到高純水中清洗的條件是所述根組織取材于中性環境。
[0025]一種對植物根組織進行染色制片觀察的方法也屬于本發明的保護范圍，包括如下步驟:按照上述任一所述的方法，得到染色后的根組織；再將根組織放到載玻片上，滴上高純水，蓋上蓋玻片，制成切片；然后在熒光共聚焦顯微鏡下對切片進行鏡檢，在535nm或氙燈或汞燈或氬離子激光器下488通道激發，617nm檢測熒光，連續拍攝圖片，將圖片拼接，即得到根組織完整的染色圖片；
[0026]上述方法中，所述根組織包括根尖組織和/或根的成熟區。
[0027]上述任一所述的方法中，所述根組織的直徑為10-1050 μ m，所述直徑為所述根組
織根基部方向一端的直徑。
[0028]上述任一所述的方法中，所述根組織的長度為2cm。
[0029]上述步驟均保持在黑暗環境下完成。
[0030]上述任一所述的方法在觀察植物根組織中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0031 ] 上述應用中，所述根組織包括根尖組織和/或根的成熟區。
[0032]上述任一所述的應用中，所述根組織的直徑為10-1050 μ m，所述直徑為所述根組織根基部方向一端的直徑。
[0033]上述任一所述的應用中，所述根組織的長度為2cm。
[0034]上述任一所述的應用中，所述植物為玉米。
[0035]本發明提供的一種植物根組織活體組織切片的熒光染色技術，克服了常規切片過程中高溫或低溫固定包埋對根尖幼嫩組織產生的損傷，并且操作流程簡單，極大的節省了切片制作的時間，利用本發明的方法可以實現快速便捷的制作植物根組織活體組織切片的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036]圖1為不同直徑的玉米幼苗根尖組織的活體組織切片。
[0037]圖2為玉米幼苗根尖組織的活體組織切片。[0038]圖3為玉米幼苗根的成熟區活體組織切片。
【具體實施方式】
[0039]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0040]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0041]PI (碘化丙唳，Propidium 1dide)購自 Sigma 公司，貨號為 P4170。
[0042]PI染色劑母液的配制:
[0043]避光條件下，取PI加入高純水，混勻，使混合液中PI的濃度為10mg/ml，配制成 10mg/ml的PI母液，用離心管分裝后，避光保存于-20°C，注意避免反復凍融使用。
[0044]磷酸鈉緩沖液的配制:
[0045]IM磷酸氫二鈉母液配制:Na2HP04分子量358，購自國藥，稱取358g溶解在高純水 中，定容至1L，即配制成IM的磷酸氫二鈉溶液。
[0046]IM磷酸二氫鈉母液配制=NaH2PO4分子量156，購自國藥，稱取156g溶解在高純水 中，定容至1L，即配制成IM的磷酸二氫鈉溶液。
[0047]pH=5.8的0.1M磷酸鈉緩沖液配制:將IM磷酸氫二鈉母液和IM磷酸二氫鈉母液 以體積比7.9ml:92.1ml混合。
[0048]pH=6.0的0.1M磷酸鈉緩沖液配制:將IM磷酸氫二鈉母液和IM磷酸二氫鈉母液 以體積比12.0ml:88.0ml混合。
[0049]pH=7.0的0.1M磷酸鈉緩沖液配制:將IM磷酸氫二鈉母液和IM磷酸二氫鈉母液 以體積比57.1ml:42.3ml混合。
[0050](注:配制方法源自《分子克隆》，pH值計算根據Henderson-Hasselbalch方程式: pH=pK’ +Log{質子受體 / 質子供體}，pK，=6.86 (25 °C )。)
[0051]實施例1、植物根組織活體組織切片的制作及鏡檢
[0052]一、切片的制作
[0053](一)取一定體積的PI母液加入到2ml高純水中，配制成一定濃度的PI染色劑，均 勻混合。
[0054](二)用手術刀片切取植物自根末梢開始到根基部方向2cm的根段，用Iml的移液 槍將根段的分泌物吸取干凈，然后將用吸水紙吸干。
[0055](三)在環境溫度10_30°C下，將根段放到0.1M的磷酸鈉緩沖液中或高純水中清洗 3遍，每次清洗后都用吸水紙吸干。
[0056](四)然后將根段放入一定濃度的PI染色劑中，在lOOr/min的轉速的搖床上染色。
[0057](五)把根段放到高純水中，在100r/min轉速的搖床上漂洗15_30min。
[0058](六)將根段放到載玻片上，滴2-3滴高純水，蓋上蓋玻片。
[0059]二、切片鏡檢
[0060]玉米根尖組織容易破碎，自發熒光為藍色，PI染料能結合活體細胞壁膠質發射出 紅色熒光。
[0061]在突光共聚焦顯微鏡下對切片進行鏡檢,最大激發光為535nm,最大發射光為 617nm，可以觀測到PI發射出的紅色光(PI也可以在氙燈或汞燈下激發，也可以在氬離子激 光器下488通道激發)。[0062]鏡檢過程:首先在明場10倍鏡下迅速找到清晰的視野，然后換到熒光界面，在1024的像素下拍攝圖片，每張圖片大約能拍攝750 μ m的根段，在每個圖片上設定標記，然后拍攝下一張圖片，如此連續拍攝。
[0063]注意:在染色和鏡檢過程要保持在黑暗環境下完成，在轉移根段的過程中要保持根段表面不被移液器，吸水紙，鑷子和其它物品碰傷，因為輕微碰傷后根段在鏡檢過程中會出現黑色。
[0064]實施例2、不同直徑玉米幼苗根段活體切片的制作及鏡檢
[0065]一、用手術刀片切取不同直徑的玉米幼苗根段(自根末稍開始到根基部方向長度為2cm，直徑指根段的根基部方向一端的直徑)，用Iml的移液器將根段的分泌物吸取干凈，然后用吸水紙吸干。
[0066]二、在環境溫度10_30°C下，將植物材料放到高純水中清洗3遍，每次清洗后都用吸收紙吸干。
[0067]三、然后將各直徑的根段分別放入不同濃度的PI染色劑中，在lOOr/min的轉速的搖床上染色，染色時間為l_60min。
[0068]四、把染色后的各根段放到高純水中，在lOOr/min的轉速的搖床上漂洗15_30min。
[0069]五、將各根段放到載玻片上，滴2-3滴高純水，蓋上蓋玻片。
[0070]六、按照實施例1的切片鏡檢方法觀測根段
[0071]根據鏡檢和觀察到的切片結果。
[0072]各組根段的染色條件如表1所示。染色濃度和染色時間根據根段的直徑變化而增加。
[0073]表1不同直徑的根段染色條件
[0074]
【權利要求】
1.一種對植物根組織進行染色的方法，包括如下步驟:將植物根組織置于PI水溶液中，進行染色，即得被染上色的植物根組織。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述PI水溶液中PI的濃度為l_50mM。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述染色的時間為l-60min。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述根組織包括根尖組織和/或根的成熟區。
5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述根組織的直徑為10-1050μ m，所述直徑為所述根組織的根基部方向一端的直徑； 所述根組織的直徑為10-300μπι時，染色條件如下:ΡΙ濃度為l_5mM，染色時間1-1Omin ;所述根組織的直徑為300-600 μ m時，染色條件如下:PI濃度為5_15mM，染色時間10-20min ;所述根組織的直徑為600-1050 μ m時，染色條件如下:PI濃度為15_50mM，染色時間 20-60min。
6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于:所述植物為玉米。
7.根據權利要求1-6任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，在將植物根組織置于PI水溶液中之前，包括如下步驟: (1)取植物的根組織，將根組織的分泌物吸取干凈，然后吸干根組織的表面水分； (2)在環境溫度下，將根組織放到0.1M的磷酸鈉緩沖液或高純水中清洗，清洗后吸干根組織的表面水分； 所述環境溫度為10-30°C ； 所述0.1M的磷酸鈉緩沖液的pH為5.8-7.0 ； 和/或， 所述方法中，在將植物根組織置于PI水溶液中進行染色之后，包括如下步驟: (I)把根組織放到高純水中，搖床漂洗； 所述漂洗的時間為15-30min。
8.—種對植物根組織進行染色制片觀察的方法，包括如下步驟:按照權利要求1-7任一所述的方法，得到染色后的根組織；再將根組織放到載玻片上，滴上高純水，蓋上蓋玻片，制成切片；然后在熒光共聚焦顯微鏡下對切片進行鏡檢，在535nm或氙燈或汞燈或氬離子激光器下488通道激發，617nm檢測熒光，連續拍攝圖片，將圖片拼接，即得到根組織完整的染色圖片； 所述根組織包括根尖組織和/或根的成熟區。
9.權利要求1-8任一所述的方法在觀察植物根組織中的應用； 所述根組織包括根尖組織和/或根的成熟區。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于:所述植物為玉米。
【文檔編號】G01N21/64GK103528872SQ201310478787
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月14日 優先權日:2013年10月14日
【發明者】米國華, 高坤 申請人:中國農業大學