黃曲霉特異性單鏈抗體的制備方法和應用的制作方法【專利摘要】本發明屬于食品有害生物分子檢測領域，涉及一種黃曲霉特異單鏈抗體的制備方法及應用。將黃曲霉菌絲細胞壁蛋白分別免疫雞和小鼠，提取免疫后的雞脾臟淋巴細胞的信使RNA，構建雞源單鏈抗體文庫，通過噬菌體表面展示技術篩選文庫后得到了對黃曲霉具有高親和力的曲霉屬特異性單鏈抗體基因。將該抗體基因亞克隆至堿性磷酸酶蛋白表達載體中并在大腸桿菌中表達純化，得到融合蛋白和分泌黃曲霉特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞2A8。以單抗為捕獲抗體，AfSA4-AP融合蛋白為檢測抗體，建立SandWich?ELISA免疫學檢測系統可檢測作物及儲藏植物源產品中黃曲霉污染。【專利說明】黃曲霉特異性單鏈抗體的制備方法和應用【
技術領域：
】[0001]本發明屬于食品有害微生物分子檢測【
技術領域：
】，具體涉及一種黃曲霉特異單鏈抗體和單克隆抗體的制備方法及其在黃曲霉免疫學檢測中的應用。【
背景技術：
】[0002]黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)是廣泛分布的產生黃曲霉毒素的絲狀真菌,可以侵染花生(ArachishypogaeaL.)、玉米(ZeamaysL.)、棉花(Gossypiumspp.)等引起多種作物的病害,危害糧食和經濟作物的生產,造成嚴重的經濟損失。在糧食儲減以及食品和詞料的加工、運輸等環節也及易發生黃曲霉和寄生曲霉的污染，導致黃曲霉毒素的積累，從而嚴重威脅人畜健康及食品安全。黃曲霉毒素主要有AFB1,AFB2,AFG1,AFG2四種類型，主要由黃曲霉和寄生曲霉產生，在我國華南、華中、華北地區產毒菌株分布較廣。黃曲霉毒素是真菌生長過程中的次級代謝產物，具有強烈的急性毒性和強烈的致癌、致畸作應，被國際癌癥研究機構(IARC)認定為I類致癌物。此外，黃曲霉菌是僅次于煙曲霉(A.fumigatus)的可引起人畜侵襲性曲霉病的第二大類病原菌，嚴重危害人畜健康。黃曲霉毒素非常穩定，高溫(200°C)處理、紫外照射都不能使其分解，一旦發生污染很難進行除去。因此，快速有效的對黃曲霉、寄生曲霉檢測方法對于監測農作物病害發生、從源頭上控制黃曲霉毒素的污染具有重要意義。本發明選用的抗原制備菌株是高產毒的黃曲霉囷株。[0003]目前對黃曲霉、寄生曲霉的監測方法主要是傳統生物學方法(如:傳統培養基法)、分子檢測(如:PCR)、免疫學檢測(如:ELISA)。傳統培養基法耗時太長，PCR分子檢測方法需要特殊的儀器和器材，需專門提取樣品的DNA，樣品前處理步驟繁瑣，操作人員需要具備專門技能。此外，這些傳統檢測方法的現場實時監測及檢測方法的微型化都受到限制。酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測具有較高的特異性和靈敏度，樣品不需要復雜的前處理，便于微型化操作和進行現場實時監測，不受儀器設備和專業操作人員的限制。ELISA檢測中常用的酶標二抗為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)標記的抗體，一般通過化學交聯的方法將催化酶標記到抗體上。具有隨機反應特點的化學交聯過程所產生的交聯位點可能會影響抗體與抗原的結合，導致抗體特異性和親和力下降，`對交聯反應的優化和酶標抗體的質量檢測也會導致生產成本的提高。利用生物技術得到的單鏈抗體(scFv)具有單克隆抗體的同質性的特點并且基因編碼序列明確，同時可以通過微生物發酵進行大量生產。此外，還可以通過基因工程手段對單鏈抗體進行改造，可以得到抗體和酶的融合蛋白，這種同時具有抗原識別能力和酶催化活性的雙功能蛋白可以極大促進ELISA檢測方法的應用。本發明通過免疫雞，在克隆雞的抗體基因基礎上構建了單鏈抗體噬菌體展示文庫，利用噬菌體展示方法對文庫進行了篩選之后得到了可以識別黃曲霉和寄生曲霉的單鏈抗體基因。通過免疫小鼠制備了一株可分泌黃曲霉特異單克隆抗體的雜交瘤細胞株。通過對單鏈抗體基因進行基因工程改造得到了scFv-AP融合蛋白并在大腸桿菌中進行大量表達。該scFv-AP融合蛋白可以與黃曲霉特異單克隆抗體配套使用在雙抗體夾心ELISA檢測當中。該檢測方法靈敏度高，不需要額外的酶標二抗操作簡便迅速，可以應用于農作物種植、糧食儲藏、食品和飼料加工等領域中的對黃曲霉和寄生曲霉污染的檢測。【
發明內容】[0004]本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，其目的之一在于提供一種黃曲霉特異單鏈抗體基因，該基因利用噬菌體展示技術從免疫后的雞源單鏈抗體文庫中獲得，申請人:將該基因命名為AfSA4，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示(長度為756bp)，其編碼的蛋白質的氨基酸的序列如序列表SEQIDNO:2所示。本發明的黃曲霉特異單鏈抗體基因由輕鏈可變區和重鏈可變區組成，輕鏈可變區\由312個核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示(長度為390bp);重鏈可變區V11由390個核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示(長度為312bp)。[0005]本發明的目的之二在于提供了一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白，其蛋白質的序列如SEQIDNO:2所示，其輕鏈可變區\由104個氨基酸編碼，序列如SEQIDNO:4所示；重鏈可變區V11由130個氨基酸編碼，其序列如SEQIDNO:6所示，輕鏈可變區和重鏈可變區由連接肽(GGSSRSSSSGGGGSGGGG)連接。[0006]本發明的目的之三在于提供了一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白與堿性磷酸酶的融合基因，申請人:將其命名為AfSA4-AP，其序列如SEQIDNO:7所示(長度為2175bp)。[0007]本發明的目的之四在于提供了一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白與堿性磷酸酶的融合蛋白，其編碼序列如SEQIDNO:8所示(編碼725個氨基酸)。單鏈抗體和堿性磷酸酶之間通過連接肽(SSGSTSGSGKPGSGEGST)連接。[0008]本發明的目的之五在于提供了一種能夠分泌抗黃曲霉的單克隆抗體雜交瘤細胞株2A8。[0009]本發明的目的之六在于提供了一種新型的黃曲霉和寄生曲霉的雙抗體夾心酶聯免疫檢測方法(SandwichELISA)，以單克隆抗體2A8作為捕獲抗體，以融合蛋白AfSA4_AP作為檢測抗體。[0010]具體地，為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案:[0011]從黃曲霉菌菌絲細胞壁中提取可溶性細胞壁蛋白(SCWPs)，用細胞壁蛋白免疫來亨母雞，利用分子克隆的技術和方法構建了雞源單鏈抗體噬菌體展示文`庫，然后利用噬菌體展示技術篩選得到了高親和力單鏈抗體AfSA4，并進一步構建了融合蛋白AfSA4-AP。與此同時，用`細胞壁蛋白免疫的Balb/c小鼠后，利用雜交瘤細胞融合技術篩選得到了抗黃曲霉的單克隆抗體雜交瘤細胞株2A8。單克隆抗體2A8(捕獲抗體)和單鏈抗體融合蛋白AfSA4-AP(檢測抗體)可以配套應用與黃曲霉菌的檢測當中。[0012]一種黃曲霉特異單鏈抗體基因，其制備過程如下:[0013]從培養的黃曲霉菌絲中制備可溶性細胞壁蛋白SCWPs，然后免疫來亨母雞，在獲得滿意抗體效價后提取脾臟和骨髓淋巴細胞的mRNA并逆轉錄成cDNA，然后從cDNA中經PCR擴增得到雞抗體的重鏈可變區基因(V11)和輕鏈可變區基因(')片段，以及單鏈抗體基因(scFv)。將scFv基因亞克隆至噬菌粒載體pComb3X上，電轉化至大腸桿菌XLl-BlueMRF’得到單鏈抗體曬菌體展示文庫。單鏈抗體曬菌體展示文庫經過曬菌體展示篩選、表達ELISA鑒定和單鏈抗體基因序列分析后得到一種高親和力單鏈抗體基因，將其命名為AfSA4，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所不，序列長度為756bp。[0014]一種黃曲霉特異單鏈抗體蛋白，其制備過程如下:[0015]將含有黃曲霉特異單鏈抗體基因AfSA4的pComb3X載體(pComb3X_AfSA4)轉化至大腸桿菌TOP10中，經誘導物異丙基-P-D-硫代半乳糖苷誘導表達后，利用N1-NTA親和層析純化獲得AfSA4抗體蛋白。SDS-PAGE電泳檢測結果(圖6)表明AfSA4抗體蛋白分子量大小約為35kD，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。[0016]一種黃曲霉特異單鏈抗體在黃曲霉菌和寄生曲霉菌檢測中的應用，其應用過程如下:[0017]將達到純化的AfSA4抗體通過間接酶聯免疫反應(IndirectELISA)檢測方法或制備成檢測試劑盒、試紙條和蛋白芯片等應用于黃曲霉菌和寄生曲霉菌的檢測。[0018]I)將100黃曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs(制備方法見實施例1)(IOiig/ml)加入ELISA板孔中，37°C溫浴2h或4°C放置過夜，進行抗原包被。[0019]2)每個ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0020]3)將300ill封閉液(含2%(ff/V)脫脂奶粉的PBS溶液(成分:137mMNaCl，2.7mMKCl,IOmMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.2~7.4)，加入到抗原包被孔和空白對照孔中，于37°C封閉2h。[0021]4)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0022]5)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的AfSA4抗體(200nM)，37°C溫浴2h。[0023]6)每孔用300UIPBST(含0.05%Tween20的PBS)洗滌3次，每次30sec。[0024]7)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的鼠抗HA標簽抗體(購自北京康為世紀生物科技有限公司，體積比為1:10，000)，371:溫浴211。[0025]8)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0026]9)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的AP標記羊抗鼠IgG抗體(購自美國Sigma公司，體積比為1:10，000)，371:溫浴211。[0027]10)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0028]11)每孔加入IOOuI顯色液[0.2%(W/V，)對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)溶液(0.1Mglycinebuffer,pH10.4,ImMMgCl2,ImMZnC12)],避光反應15~30min,用酶標儀測定0D405nm值。[0029]根據ELISA結果顯示，AfSA4抗體對黃曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高親和力，酶標儀測定的OD4tl5nm平均值為1.560(黃曲霉)和2.188(寄生曲霉)，分別比陰性對照高出36.3倍和47.6倍。在實際檢測過程中樣品前處理方法簡單，將樣品直接研磨后即可進行檢測。[0030]一種黃曲霉特異單鏈抗體的融合蛋白，其制備過程如下:[0031]將黃曲霉特異單鏈抗體基因AfSA4亞克隆到pDAP2/S載體上，重組載體pDAP2/S-AfSA4轉化至大腸桿菌XLl-BlueMRF’中，經異丙基-P-D-硫代半乳糖苷誘導表達后，利用N1-NTA親和層析純化(HuZQ,LiHP,etal.Anal.Chim.Acta2013，764:84-92.)獲得AfSA4-AP抗體融合蛋白。純化后的AfSA4-AP融合蛋白經SDS-PAGE電泳檢測發現其分子量約為80kD(圖9)，其序列如SEQIDNO:8所示。[0032]一株黃曲霉特異的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其制備過程如下:[0033]用黃曲霉可溶性細胞壁蛋白SCWPs免疫Balb/c小鼠后，取小鼠的脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0進行融合，經篩選得到雜交瘤細胞后，利用SCWPs抗原對雜交瘤細胞進行ELISA篩選，經過亞克隆后獲得I株能夠穩定分泌抗黃曲霉的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，申請人:將其命名為2A8。從接種雜交瘤細胞的小鼠腹水中利用硫酸銨沉淀法純化得到單克隆抗體2A8，通過ELISA鑒定抗體的效價和特異性。[0034]申請人:已于2013年8月12日將獲得的黃曲霉特異的單克隆抗體的雜交瘤細胞株2A8送中國.武漢.武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCCNO:C2013101。[0035]一種黃曲霉特異單鏈抗體融合蛋白和單克隆抗體在黃曲霉菌和寄生曲霉菌檢測中的應用，其應用過程如下:[0036]將純化的單克隆抗體2A8和融合蛋白AfSA4-AP通過雙抗體夾心酶聯免疫(SandwichELISA)檢測方法(BoscoloS,PelinM,etal.Environ.Sc1.Technol.2013，47:2034-2042.)或制備成檢測試劑盒、試紙條和蛋白芯片等應用于黃曲霉菌和寄生曲霉菌的檢測。[0037]I)將100ill稀釋在PBS中的單克隆抗體2A8(20iig/ml)加入ELISA板孔中，4°C放置過夜,進行包被。[0038]2)每個ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0039]3)每孔加入300UI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)37°C封閉2h。[0040]4)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0041]5)每孔加入IOOiU黃曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs(10iig/ml)，37°C溫浴2h。空白對照加入PBS。[0042]6)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0043]7)每孔加入IOOiU稀釋在封閉液中的AfSA4-AP融合蛋白(200nM)，37°C溫浴2h。[0044]8)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0045]9)每孔加入IOOiUpNPP顯色液，避光反應15~30min，用酶標儀測定OD4tl5nm值。[0046]根據ELISA結果顯示，本發明的單克隆抗體2A8和融合蛋白AfSA4_AP對黃曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高親和力，酶標儀測定的OD4tl5nm平均值為2.346(黃曲霉)和2.322(寄生曲霉)，分別比陰性對照高出33.0倍和39.4倍。在實際檢測過程中樣品前處理方法簡單，將樣品直接研磨后即可進行檢測。[0047]本發明的有益效果:[0048]1、本發明的有益效果之一是利用單鏈抗體噬菌體展示文庫技術，構建了黃曲霉特異單鏈抗體文庫，利用噬菌體展示技術從抗體文庫中篩選得到一個高親和力的黃曲霉特異單鏈抗體及其編碼基因AfSA4。[0049]2、本發明的有益效果之二是黃曲霉特異單鏈抗體AfSA4在大腸桿菌中誘導表達后形成可溶性蛋白，并可進行純化，易于操作和大規模生產。[0050]3、本發明的有益效果之三是從大腸桿菌中純化的AfSA4抗體可應用于黃曲霉菌和寄生曲霉菌的間接酶聯免疫(IndirectELISA)檢測，包括制備檢測試劑盒、試紙條和蛋白芯片等，可用在農作物生產、飼料加工、糧食儲藏和食品加工等領域中的黃曲霉菌和寄生曲霉菌污染檢測。[0051]4、本發明的有益效果之四是AfSA4抗體與AP的融合蛋白可以在大腸桿菌中可溶性表達和純化，AfSA4-AP融合蛋白可進行大規模生產，制備流程簡單且成本低。[0052]5、本發明的有益效果之五是獲得的一株黃曲霉特異單克隆抗體雜交瘤細胞株2A8能夠用于高親和力單克隆抗體的大規模生產。[0053]6、本發明的有益效果之六是黃曲霉特異單克隆抗體2A8可從小鼠腹水中大量獲得，經硫酸銨沉淀純化的抗體具有良好的特異性和親和力。[0054]7、本發明的有益效果之七是黃曲霉特異單克隆抗體2A8和AfSA4_AP融合蛋白可配套進行對黃曲霉菌和寄生曲霉菌的雙抗體夾心酶聯免疫檢測(SandwichELISA)，包括制備檢測試劑盒、試紙條和蛋白芯片等，可用在農作物生產、飼料加工、糧食儲藏和食品加工等領域中的黃曲霉菌和寄生曲霉菌污染檢測。【專利附圖】【附圖說明】[0055]圖1:為發明的總體技術流程圖。[0056]圖2:為V11,Vl基因片段的凝膠電泳圖。[0057]圖中:M:DNA分子質量標準；泳道1:重鏈可變區片段(V11);泳道2:輕鏈可變區片段(Vl)。[0058]圖3:為scFv基因片段的凝膠電泳圖。[0059]圖中:M:DNA分子質量標準；泳道1:scFv基因片段。[0060]圖4:為一種pComb3X載體結構圖。[0061]圖5:為一種表達ELISA鑒定篩選后的單鏈抗體噬菌體展示文庫。[0062]圖中:★標記為AfSA4,?標記為AfSA5,▲標記為AfSA8,+標記為AfSDIO。[0063]圖6:為一種SDS-PAGE電泳檢測純化的AfSA4、AfSA5、AfSA8、AfSDlO單鏈抗體示意圖。[0064]圖中:M:蛋白分子量標準；泳道1:AfSA4;泳道2:AfSA5;泳道3:AfSA8;泳道4:AfSDlO0[0065]圖7=ELISA檢測AfSA4、AfSA5、AfSA8、AfSDlO四種單鏈抗體對黃曲霉、寄生曲霉親和力示意圖。[0066]圖中:不同的字母(a,(6,y)表不顯著性差異(p〈0.05)。[0067]圖8:為一種AfSA4抗體對黃曲霉、寄生曲霉的孢子和菌絲免疫熒光檢測的照片。[0068]圖中:a和c:顯微鏡明場模式下的黃曲霉菌絲^和g:顯微鏡明場模式下的黃曲霉孢子；i和k:顯微鏡明場模式下的寄生曲霉菌絲；111和O:顯微鏡明場模式下的寄生曲霉孢子；b，f，i，n:用AfSA4抗體檢測a，e,i，m中的菌絲和孢子；d，h，I,p:用PIPP抗體檢測c,g,k,O中的菌絲和孢子。[0069]圖9:為一種AfSA5、AfSA8、AfSD10抗體對黃曲霉孢子、菌絲免疫熒光檢測的照片。[0070]圖中:a,c,e:顯微鏡明場模式下的黃曲霉菌絲；g，i，k:顯微鏡明場模式下的黃曲霉孢子；b，h:用AfSA5抗體檢測a，g中的菌絲和孢子；d，j:用AfSA8抗體檢測c，i中的菌絲和孢子；f，1:用AfSDlO抗體檢測e，k中的菌絲和孢子。[0071]圖10:為一種SDS-PAGE電泳檢測純化的AfSA4_AP融合蛋白示意圖。[0072]圖中:M:蛋白分子量標準；泳道1:AfSA4_AP融合蛋白。[0073]圖11:為一種Westernblot分析AfSA4、AfSA4_AP融合蛋白識別黃曲霉和寄生曲霉細胞壁蛋白的不意圖。[0074]圖中:M:蛋白分子量標準；a:AfSA4識別的黃曲霉和寄生曲霉細胞壁蛋白；b:AfSA4-AP識別的黃曲霉和寄生曲霉細胞壁蛋白。[0075]圖12:為一種表面等離子共振(SPR)分析AfSA4抗體及AfSA4_AP融合蛋白與黃曲霉SCWPs結合能力的示意圖。[0076]圖中:a:AfSA4抗體與黃曲霉SCWPs結合的動力學曲線(AfSA4抗體濃度為50~400nM)；b:AfSA4-AP融合蛋白與黃曲霉SCWPs結合的動力學曲線(AfSA4_AP融合蛋白濃度為6.25~50nM)；c:AfSA4抗體與AfSA4_AP融合蛋白在50nM濃度下動力學曲線的比較。[0077]圖13:為一種雙抗體夾心ELISA法對黃曲霉、寄生曲霉最低檢測限的示意圖。[0078]圖中:?標記為雙抗體夾心ELISA法對黃曲霉的最低檢測限；▲標記為雙抗體夾心ELISA法對寄生曲霉的最低檢測限。[0079]圖14:為一種雙抗體夾心ELISA法對黃曲霉、寄生曲霉最低定量限的示意圖。[0080]圖中:?標記為雙抗體夾心ELISA法對黃曲霉在玉米中的定量限；▲標記為雙抗體夾心ELISA法對黃曲霉在花生中的定量限；〇標記為雙抗體夾心ELISA法對寄生曲霉在玉米中的定量限；A標記為雙抗體夾心ELISA法對寄生曲霉在花生中的定量限。【具體實施方式】[0081]實施例1:黃曲霉菌細胞壁蛋白(SCWPs)制備[0082]I)用滅菌牙簽挑取黃曲霉(Aspergillusflavus)菌株wh_l(采集自中國,湖北，武漢)該菌株經形態鑒定為黃曲霉，其產生黃曲霉毒素的能力經過LC-MS/MS進行測定(HanZ，RenY，etal.J.Agric.FoodChem.2012，60，8233-8247)，在接種花生8天后AFB1和AFB2的含量分別為775.39iig/kg和26iig/kg;在接種玉米8天后AFB1和AFB2的含量分別為1056.8iig/kg和55.04iig/kg)，接種于PDA培養基(成分:20%(W/V)馬鈴薯，2%(ff/V)葡萄糖，1.5%(ff/V)瓊脂)上，28°C培養5天，用含有0.05%Tween-20的無菌水將菌絲表面的分生孢子洗下，收集孢子液。[0083]2)取上述步驟I)制備的孢子液Iml(IXIO5/ml)接種于160mlCzapek培養基(成分:3%(ff/V)蔗糖，0.3%(ff/V)NaNO3,0.1%(ff/V)K2HPO4j0.05%(ff/V)MgSO4*7H20,0.05%(ff/V)KCl，0.001%(ff/V)FeSO4,pH9.0)中，28°C，200r/min振蕩培養5天。[0084]3)將培養液用2層滅菌紗布過濾收集菌絲，并用滅菌水洗滌3次后將菌絲冷凍干燥。[0085]4)用液氮冷凍菌絲并在研缽中研磨，轉移至50ml離心管中，置于冰上。[0086]5)向離心管中加入40mlCWP緩沖液(IOmMTris-HCl，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)，PH7.8)將菌絲重懸。[0087]6)4°C,50r/min旋轉洗漆30min。[0088]7)4°C,4600r/min離心IOmin,棄上清。[0089]8)用預冷的CWP清洗液(IMNaCl，ImMPMSF)洗滌3次，每次洗滌同步驟6，然后同步驟7)的方法離心。[0090]9)加入40ml含ImMPMSF的滅菌水重懸洗滌3次，每次洗滌同步驟6)，然后用步驟7)的方法離心。[0091]10)力卩AIOml提取液(50mMTris-HCl(pH8.0)，0.1MEDTA，2%(ff/V)SDS,IOmMDTT)重懸沉淀，煮沸lOmin。[0092]11)室溫15000r/min離心IOmin0[0093]12)吸取上清，加入4倍體積的10%(V/V)TCA/丙酮，充分混勻后_20°C沉淀30min以上。[0094]13)4°C,15000r/min離心IOmin,棄上清。[0095]14)加入25ml預冷丙酮重懸沉淀后用步驟13的方法離心。[0096]15)重復步驟5)操作2次。[0097]16)棄上清，干燥5~IOmin直至丙酮完全揮發。[0098]17)力卩入2mlPBS(成分:137mMNaCl，2.7mMKCl,IOmMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.2~7.4)，超聲波助溶30min。[0099]18)4°C,12000r/min離心lOmin,保留上清。[0100]19)重復步驟17)和18)，合并上清。[0101]20)4°C,12000r/min離心lOmin，取上清加入3kD超濾管，再加入IOmlPBS至超濾管中，4°C,4000r/min離心30~60min進行濃縮,重復該步驟2~3次。[0102]21)吸取濃縮后的CWPs至離心管中保存于_20°C備用。[0103]實施例2:用SCffPs免疫來亨母雞[0104]用制備的黃曲霉SCWPs免疫來亨母雞(購自華中農業大學養雞場)6次，采取肌肉注射免疫方法，每隔14天免疫一次。第一次取實施例1制備的SCWPs500uI(200ug)作為抗原與500uI弗氏完全佐劑混合后免疫,第二至第五次加強免疫:取500uI抗原與500uI弗氏不完全佐劑混合后免疫。第三次和第五次免疫I周后靜脈取血,將血清從1:200倍比稀釋，采用間接ELISA法檢測雞血清中抗體的效價(參照林巧愛、董海艷主編，《醫學免疫學與微生物學實驗指導》，浙江大學出版社，2006年)。結果表明免疫后的雞血清中黃曲霉特異抗體效價達到1:204，800。[0105]實施例3:提取雞脾臟總RNA、純化mRNA以及合成cDNA第一鏈[0106]I)最后一次免疫7天后取抗體效價最高的雞的脾臟，分離脾臟細胞。[0107]2)利用TRIzol總RNA提取試劑(購自Invitrogen公司，按照說明書操作)提取雞脾臟總RNA。[0108]3)用mRNA純化試劑盒(購自QIAGEN公司，按說明書操作)，從步驟2)提取的總RNA中純化mRNA。[0109]4)用SuperScript?III逆轉錄試劑盒(購自Invitrogen公司，按照說明書操作)，以步驟3)得到的mRNA為模板，用引物oligo(dT)12_18(購自Invitrogen公司的商業引物)合成cDNA第一鏈。[0110]實施例4:PCR擴增重鏈可變區(Vn)、輕鏈可變區(VL)及單鏈抗體(ScFv)基因[0111]I)PCR擴增Vi^PVl基因[0112]以實施例3得到的反轉錄合成的cDNA為模板，用正向引物CSCVHo-FL(GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGGCGGTGGTGGCAGCTCCGGTGGTGGCGGTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG)和反向引物CSCG-B(CTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC)進行PCR擴增獲得VII片段；以實施例3反轉錄合成的cDNA為模板，用正向引物CSCVK(GTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC)和反向引物CKJo-B(GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG)進行PCR擴增獲得VI片段。在50illPCR反應體系中，加入0.5illcDNA，5ill10XPCR緩沖液(含Mg2+)，IuIlOmMdNTPs,0.5uI正向引物CSCVHo-FL或CSCVK(100yM)，0.5yI反向引物CSCG-B或CKJo-B(IOOiiM)，2.5UTaq聚合酶。PCR反應條件為:94°C5min；94°C15sec，56°C15sec,72°C45sec，30個循環;最后72°CIOmin0PCR產物通過1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結果如圖2所示，V11和VL片段大小與預期相一致。[0113]2)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按說明書操作)從凝膠中回收步驟1)擴增得到的VII和VL片段。[0114]3)SOE-PCR擴增scFv基因[0115]以等量的V11和VL片段作為模板，用正向引物CSC-F(GAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG)和反向引物CSC-B(GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGG)進行SOE-PCR擴增，獲得scFv基因。在50PCR反應體系中，加入V11和\片段各50ng，5ii110XPCR緩沖液(含Mg2+)，liiIlOmMdNTPs,0.3uI正向引物CSC_F(100yM)，0.3ill反向引物CSC-B(100uM),2.5UTaq聚合酶。PCR反應條件為:94V5min；94°C15sec,56°C15sec,72°C90sec，25個循環；最后72°CIOmin0PCR產物通過1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結果如圖3所示，所得scFv片段大小與預期相一致。[0116]4)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按說明書操作)從凝膠中回收步驟步驟3)獲得的scFv片段。[0117]實施例5:ScFv片段連接到pComb3X載體[0118]I)用SfiI限制性內切酶(購自NEB公司，按說明書進行操作)酶切實施例4得到的scFv片段和載體pComb3X(Andris-WidhopfJ,RaderC,etal.Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay.J.1mmunol.Methods,2000,242:159_181，如圖4所示)。[0119]2)用DNA凝膠回收試劑盒(購自QIAGEN公司，按說明書操作)從凝膠中回收步驟I)酶切過后的scFv片段和載體pComb3X。[0120]3)用T4DNA連接酶(購自NEB公司，按說明書操作)連接步驟2)回收的scFv片段和pComb3X載體,得到重組質粒pComb3X_scFv。[0121]4)對步驟3得到的重組質粒pComb3X_scFv進行乙醇沉淀和除鹽(參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，2003年，第三版介紹的方法)。[0122]實施例6:單鏈抗體噬菌體展示文庫的構建[0123]I)大腸桿菌XLl-BlueMRF’感受態細胞制備[0124]用無菌牙簽蘸取大腸桿菌甘油凍存菌株XLl-BlueMRF’(購自Stratagene公司)，在LB固體培養基(成分:1%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，1%(W/V)NaCl，1.5%(W/V)瓊脂，pH7.0)上37°C劃線培養16h。挑取一單克隆菌落接種到15mlSB液體培養基(成分:3%(W/V)胰蛋白胨，2%(W/V)酵母提取物，1%(W/V)3-(N-嗎啡啉)丙磺酸(簡稱M0PS，pH7.0)中，37°C，200r/min培養16h。將2.5ml大腸桿菌XLl-BlueMRF’菌液加入到500mlSB液體培養基中，并同時添加10ml20%(w/v)葡萄糖和5mllMMgCl2,于37°C搖床(200r/min)中培養至OD6tltol達到0.7左右時，迅速置于冰上冷卻15min。將菌液分裝于離心管中，4°C,4000r/min離心20min,棄上清，然后用500ml預冷的10%(V/V)甘油洗滌菌體沉淀兩次(4°C，4000r/min離心20min后棄上清)。向離心管中加入2.5ml預冷的10%(V/V)甘油并將菌體重懸，分裝至1.5ml離心管(100uI/管)，立即保存于-800C。[0125]2)重組質粒電轉化至大腸桿菌[0126]將5管_80°C保存的大腸桿菌XLl-BlueMRF’感受態細胞取出，置冰上融化lOmin，每管感受態細胞(IOOiiI)中加入Iiig重組質粒pComb3X-scFv,混勻后冰上靜置2min,然后將感受態細胞轉移至冰上預冷的電轉化杯(0.2cm厚)(購自BIO-RAD公司)中，用MicroPulser?電轉化儀(購自BIO-RAD公司，使用BacteriaEc2程序)進行電轉化，然后立即加入37C預熱的ImlSOC培養基(成分:2%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(ff/V)酵母提取物，0.05%(ff/V)NaCl，20mM葡萄糖，pH7.0)到電轉化杯中重懸菌體，將所有電轉化杯中的菌液混合并轉移至離心管中并在37°C搖床(240r/min)中培養lh。培養Ih后,加入10ml37°C預熱的SB培養基、3iil羧芐青霉素(IOOmg/ml)和30四環素(5mg/ml)，從中取出2uI菌液加入到200uISB中，然后從中分別取10和100uI涂含有100yg/ml羧芐青霉素的LB平板37°C培養過夜后計數。將上述15ml菌液于37°C搖床(240r/min)中培養Ih后再加入4.5yI羧節青霉素(IOOmg/ml)繼續培養Ih,然后按照實施例8進行單鏈抗體的篩選。[0127]實施例7:單鏈抗體噬菌體展示文庫的鑒定[0128]I)通過計數實施例6步驟2)中所培養LB平板上的大腸桿菌克隆，然后乘以稀釋倍數和菌液的體積計算得到的單鏈抗體噬菌體展示文庫庫容量約為1.2X107cfu。[0129]2)從實施例6步驟2)中所培養LB平板上隨機挑選25個大腸桿菌克隆，接種到IOOug/ml羧芐青霉素的LB液體培養基中于37°C搖床(200r/min)中培養過夜。[0130]3)煮沸裂解法提取過夜培養菌液的質粒DNA(參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，2003年)。[0131]4)以步驟3)得到的質粒DNA為模板，用正向引物ompseq(AAGACAGCTATCGCGATTGCAG)和反向引物gback(GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC)進行PCR擴增。在25illPCR反應體系中，含有50ng質粒DNA，2.5iilPCR緩沖液(含Mg2+)，2u11.25mMdNTPs,IiiI正向引物ompseq(IOuM)，I反向引物gback(IOuM)，1.25UTaq聚合酶。PCR反應條件為:94°C5min;94°C15sec，56°C15sec，72°C90sec，30個循環；最后72°CIOmin0PCR產物通過I%(ff/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測單鏈抗體噬菌體展示文庫的陽性率。[0132]5)用BstNI限制性內切酶(購自NEB公司，按說明書操作)酶切步驟4)得到的PCR產物，將酶切產物進行1.5%(ff/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測噬菌體展示文庫的多樣性。[0133]對文庫進行的鑒定表明，所構建的單鏈抗體噬菌體展示文庫陽性率達到96%，多樣性高于50%，說明所構建的文庫質量較高，可進行篩選特異性的單鏈抗體。[0134]實施例8:篩選單鏈單鏈抗體噬菌`體展示文庫[0135]I)向實施例6最后獲得的15ml菌液中加入10ml3.7X10ncfu/ml的VCSMl3輔助噬菌體(購自Stratagene公司，輔助噬菌體的繁殖和保存參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，2003年，第三版中介紹的方法)。[0136]2)將25ml菌液轉移到裝有175ml預熱的500ml三角瓶中，并加入92.5illIOOmg/ml的羧芐青霉素和370u15mg/ml的四環素于37°C搖床(240r/min)中培養1.5~2h，然后加入280ill卡那霉素(50mg/ml)，37°C繼續培養過夜(12~15h)。[0137]3)用黃曲霉SCWPs(200iig/ml)包被ELISA板(共4孔，每孔100yl)，4°C放置過夜。[0138]4)將步驟2)中培養過夜的大腸桿菌菌液4°C，3000g離心15min，然后保留上清。[0139]5)向上清中加入50ml5XPEG/NaCl溶液(20%(ff/V)聚乙二醇(PEG)6000，2.5MNaCl)，充分混勻后分裝至50ml離心管，冰上放置30min~lh。[0140]6)4°C，15000g離心15min，將上清丟棄，然后將離心管倒立于吸水紙上lOmin，使管內殘留的[0141]PEG/NaCl溶液全部流出。[0142]7)向離心管中加入2ml溶解在TBS(50mMTris-HCl,pH7.5，150mMNaCl)中的1%(w/v)BSA，將所有的噬菌體沉淀重懸，然后轉移到2ml離心管中，4°C，14000r/min離心5min后取上清于4°C保存并馬上取一部分進行篩選。[0143]8)將步驟3)中包被好的ELISA板中的抗原溶液甩出，加入250UI溶于TBS中的3%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)，37°C封閉lh。[0144]9)將封閉液甩出，每個孔中加入50iU步驟7)中收集的新鮮噬菌體，37°C溫浴2h。[0145]10)將噬菌體溶液甩出，每孔中加入250illTBST(0.05%Tween)，洗滌5次，每次Imin(第二輪和第三輪淘選時增加洗滌次數至10次和15次，Tween濃度增加至0.5%)。[0146]11)每孔加入IOOuIGlycine-HCl(100m,pH2.2)，室溫放置lOmin，用槍劇烈吹吸10次，然后吸出并加入3iilTris(2M)中和。[0147]12)將洗脫的噬菌體加入到2ml在SB中培養(37°C，200r/min)至OD6tltol約為0.5的XLl-BlueMRF，菌液中，室溫侵染15min。[0148]13)加入6ml37°C預熱的SB培養基、1.6iil羧芐青霉素(IOOmg/ml)和12yl四環素(5mg/ml)。[0149]14)從中取10ill用SB培養基稀釋至10_4，然后取100UI涂含有羧芐青霉素的LB平板37°C培養過夜，次日通過計數大腸桿菌克隆來計算淘選后的噬菌體滴度。[0150]15)將步驟13中的8ml菌液在37°C搖床(240r/min)中培養Ih。[0151]16)加入2.4iil羧芐青霉素(IOOmg/ml)再繼續培養lh。[0152]17)加入5mlVCSM13輔助卩遼菌體(購自Stratagene公司)，將菌液轉移至87ml預熱的SB中，并添加46iiI羧節青霉素(IOOmg/ml)和184UI四環素(5mg/ml),于37°C搖床(240r/min)中培養1.5~2h。[0153]18)加入140UI卡那霉素(50mg/ml),240r/min，37°C培養過夜。[0154]19)按照步驟4~7的方法收集噬菌體，并進行下一輪篩選。[0155]實施例9:表達ELISA鑒定淘選抗體庫[0156]I)最后一輪淘選完成后從實施例8步驟14)的LB平板上隨機挑選35個克隆，接種至3ml含有羧芐青霉素(50iig/ml)的SB培養基中，在37°C搖床(240r/min)中培養至OD6tltlnm約為0.5。[0157]2)加入終濃度為2mM的異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，繼續培養20h。[0158]3)黃曲霉SCWPs按實施例8步驟3)包被到ELISA板上，空白對照用3%(w/v)BSA包被。[0159]4)將步驟3)中包被好的ELISA板中的抗原溶液甩出，加入250UI溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的5%(w/v)脫脂奶粉，37°C封閉lh。[0160]5)將過夜培養的大腸桿菌菌液于4°C，2800g離心15min，保留上清。[0161]6)取50ill步驟5)中的上清與501115%(w/v)脫脂奶粉混勻后加入到封閉過后的ELISA板孔中，37°C溫浴2h。[0162]7)用300ii10.05%PBST洗滌3次，每次30sec。[0163]8)將鼠抗HA標簽抗體(購自北京康為世紀生物科技有限公司)按體積比為1:4000稀釋到封閉液中，每孔加入100yl，37°C溫浴lh。[0164]9)用300ii10.05%PBST洗滌3次，每次30sec。[0165]10)將HRP標記的羊抗鼠抗體(購自北京康為世紀生物科技有限公司)按體積比為1:4000稀釋到封閉液中，每孔加入l)0iU，37°C溫浴lh。[0166]11)用300U10.05%PBST和PBS各洗滌3次，每次30sec。[0167]12)每孔加入100UI可溶性單組份TMB底物(購自北京天根生化科技有限公司)避光反應15~30min。[0168]13)加入100UIH2SO4溶液(2M)終止反應，用酶標儀測OD45tlnm值。[0169]表達ELISA鑒定結果顯示，35個單克隆樣品中有10個顯色值高于1.8(圖5)，將這10個顯色值高的樣品送到上海立菲生物技術有限公司，將他們的重組質粒中的插入序列進行測序(測序引物同實施例7中的引物)。測序測序結果經分析表明它們具有四種不同類型核苷酸序列，分別命名為AfSA4(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)、AfSA5、AfSA8和AfSDIO。含有這四種基因的大腸桿菌命名為重組大腸桿菌XLl-BlueMRF’/pComb3X_AfSA4、XLl-BlueMRF’/pComb3X_AfSA5、XLl-BlueMRF’/pComb3X-AfSA8、XLl-BlueMRF’/pComb3X_AfSD10將菌液加入等體積50%(V/V)甘油后保存于_80°C。[0170]實施例10:單鏈抗體的大量表達與純化[0171]I)用煮沸裂解法提取過實施例9中四種含有抗體基因的四種重組大腸桿菌中的重組質粒DNA。[0172]2)通過熱激轉化至大腸桿菌T0P10感受態細胞中(熱激感受態細胞的制備和熱激轉化方法參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，2003年)。[0173]3)將含有四種重組質粒的大腸桿菌T0P10克隆接種至5ml含有100iig/ml羧芐青霉素的SB培養基中，于37°C搖床中(200r/min)培養過夜(12h)。[0174]4)取2ml過夜培養菌液加入200ml含100yg/ml羧芐青霉素、20mMMgCl2的SB培養基中，于37°C搖床中(200r/min)培養至OD6tltlnm達到0.5左右。[0175]5)加入終濃度為ImM的IPTG，置于37°C搖床中(200r/min)培養過夜。[0176]6)將過夜培養的菌液4°C，5000r/min離心20min，棄上清。[0177]7)用重懸緩沖液(50mMNaH2P04，300mMNaCl,IOmM咪唑，ImMPMSFpH8.0)將菌體重懸。[0178]8)用高壓細胞破碎儀(購自意大利GEA尼魯索爾維公司，按說明書操作)將大腸桿菌細胞破碎。[0179]9)細胞裂解液4°C，15000r/min離心30min，上清保留。[0180]10)將400uI充分混勻的N1-NTA基質(購自QIAGEN公司)加入到純化柱(購自BIO-RAD公司)使其沉降30min以上。[0181]11)剪去純化柱下端封口，加入5ml步驟7中的重懸緩沖液平衡純化柱。[0182]12)加入步驟9)得到的大腸桿菌細胞裂解液上清，收集樣品流穿液。[0183]13)加入50ml緩沖液B(50mMNaH2P04，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0)洗脫純化柱I~2次，收集流穿液(含有雜蛋白)。[0184]14)加入400uI緩沖液C(50mMNaH2P04，3OOmMNaCI,25OmM咪唑，pH8.0)洗脫純化柱3次，分別收集洗脫液為Cl、C2、C3(含有目的蛋白)。[0185]15)加5ml去離子水平衡純化柱。[0186]16)加入lml30%(v/v)酒精并將純化柱保存在4°C。[0187]17)純化的單鏈抗體通過SDS-PAGE電泳檢測(見實施例11)后用PBS透析后加終濃度50%(v/v)甘油保存在_20°C。[0188]實施例11=SDS-PAGE電泳檢測純化的單鏈抗體[0189]I)取約Iiig實施例10純化的單鏈抗體，加入5倍濃縮的十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液(250mMTris-HCl(pH6.8),10%(ff/V)SDS(電泳級)，0.5%(ff/V)溴酚藍，50%(V/V)甘油，5%(ff/V)(6-巰基乙醇)，混勻后煮沸5min，置于冰上備用。[0190]2)配制分離膠和濃縮膠(參照J.薩姆布魯克等[美]，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，2003年，第三版介紹的方法制備)。[0191]3)將IXTris-Glycine電泳緩沖液(25mMTris，250mM甘氨酸，0.1%(ff/V)SDS)加入到蛋白垂直電泳系統(購自BIO-RAD公司)，將步驟I準備的樣品加入到點樣孔中。[0192]4)用80伏低電壓電泳20min后，再用120伏高電壓電泳80~120min至溴酚藍電泳至分離膠底端。[0193]5)將凝膠取出并切掉濃縮膠，用染色液(0.1%(ff/V)考馬斯亮藍R-250，25%(V/V)異丙醇，10%(V/V)冰醋酸)染色lh。[0194]6)將凝膠置于脫色液(5%(V/V)甲醇，7.5%(V/V)冰醋酸)中脫色30min以上。[0195]SDS-PAGE電泳檢測結果如圖6所示，四種單鏈抗體分子量大小約為35kD。[0196]實施例12:利用ELISA方法檢測四種單鏈抗體對黃曲霉、寄生曲霉的親和力[0197]I)用黃曲霉和寄生曲霉的SCWPs(購自北京，中國普通微生物菌種保藏管理中心，Img/ml)分別包被ELISA板孔(100UI/孔)，37°C溫浴包被2h或4°C包被過夜。[0198]2)每個ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0199]3)將300UI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)加入到抗原包被孔和空白對照孔中，于37°C封閉2h。[0200]4)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0201]5)分別加入100uI稀釋在封閉液中的四種單鏈抗體(200nM)，37°C溫浴2h。[0202]6)每孔用300uIPBST洗滌3次，每次30sec。[0203]7)每孔加入100UI稀釋(I:4000)在封閉液中的鼠抗HA標簽抗體(購自北京康為世紀生物科技有限公司)，37°C溫浴2h。[0204]8)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0205]9)每孔加入100UI稀釋(I:4000)在封閉液中的HRP標記的羊抗鼠抗體(購自北京康為世紀生物科技有限公司)，37°C溫浴2h。[0206]10)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0207]11)每孔加入100UI可溶性單組份TMB底物(購自北京天根生化科技有限公司)避光反應15~30min。[0208]12)加入100UIH2SO4溶液(2M)終止反應，用酶標儀測OD45tlnm值。[0209]ELISA結果顯示(圖7)，單鏈抗體AfSA4對黃曲霉和寄生曲霉SCWPs均具有很強的結合能力，且明顯高于另外三種單鏈抗體對兩種菌株的親和力，其差異達到了顯著水平(p〈0.05)。[0210]實施例13:免疫熒光檢測四種單鏈抗體對黃曲霉、寄生曲霉的結合特性[0211]I)按實施例1的步驟I)制備黃曲霉、寄生曲霉孢子。[0212]2)接種Iml孢子液(IO5/mi)于20mlYPG培養基(成分:0.3%(ff/V)酵母提取物，1%(ff/V)蛋白胨，2%(ff/V)葡萄糖)中，28°C，200r/min培養8h至大部分孢子萌發。[0213]3)蓋玻片浸泡于2MNa0H中2h，蒸餾水清洗后再浸泡于70%乙醇中2h。[0214]4)蓋玻片浸泡于多聚賴氨酸溶液中5min后取出晾干。[0215]5)向12孔細胞培養板孔中加入2ml2%(ff/V)小牛血清白蛋白(BSA，購自Sigma公司)溶液，37°C封閉2h。[0216]6)每孔用2mlPBS洗滌3次。[0217]7)將步驟4中的蓋玻片置于細胞培養板孔中，加入Iml步驟2中的萌發的孢子液。[0218]8)將細胞培養板室溫離心(2800r/min)15min。[0219]9)用2mlPBS洗滌3次。[0220]10)加入500UI實施例10純化的四種單鏈抗體(封閉液中稀釋至IUg/ml)，37°C放置2h。[0221]11)用2mlPBST洗滌3次。[0222]12)加入500ii11:4000(v/v)封閉液中稀釋稀釋的鼠抗HA單克隆抗體，37°C放置2h。[0223]13)用2mlPBST洗滌3次。[0224]14)加入500U11:100(V/V)封閉液中稀釋的Cy3標記羊抗鼠IgG(H+L)抗體(購自美國ProteinTechGroup公司)，37°C避光放置lh。[0225]15)用2mlPBST和PBS分別洗滌3次。[0226]16)在載玻片上滴加封片劑，蓋上附著有菌絲和孢子的蓋玻片(有菌絲和孢子的一面貼在載玻片上)，在突光顯微鏡下觀察。[0227]免疫熒光實驗結果如圖8所示，AfSA4抗體對黃曲霉和寄生曲霉孢子和菌絲的表面都有很強的熒光信號(圖a，b，e,f，i，j,m,n)，而陰性對照的非特異性單鏈抗體PIPP(KathuriaS,SriramanR,etal.Efficacyofplant-producedrecombinantantibodiesagainstHCG.Hum.Reprod.,2002,17:2054-2061.)與菌絲或抱子均未見任何突光反應(圖c，d，g，h，k，l,o,p)，說明AfSA4抗體能與黃曲霉和寄生曲霉孢子和菌絲細胞壁表面抗原特異結合。而4€345、4€348、々€3010與黃曲霉孢子和菌絲細胞壁表面未觀察到明顯的熒光信號(圖9)，說明這3種單鏈抗體不能識別菌絲和孢子的細胞壁表面抗原。[0228]實施例14:AfSA4_AP融合蛋白表達載體構建、原核表達和純化[0229]I)通過PCR擴增在AfSA4抗體基因3’端加上218連接肽(WhitlowM，BellBA,etal.Animprovedlinkerforsingle-chainFVwithreducedaggregationandenhancedproteolyticstability.Protein.Eng.,1993,6:989-995.)以及兩端的SfiI和NotI酶切位點，然后通過這兩個酶切位點連接到pDAP2/S載體(KerschbaumerRJ,HirschlS，etal.Single-chainFVfusionproteinssuitableascoatinganddetectingreagentsinadoubleamibodysandwichEnzyme-linkedimmunosorbentassay.Anal.Biochem.，1997，249:219-227.)中，得到含有AfSA4_AP融合蛋白基因的重組質粒，將其電轉化到E.coliXLl-BlueMRF’感受態細胞(方法見實施例6步驟2)中，挑選有氨芐青霉素抗性的克隆送上海立菲生物技術有限公司測序，得到含有正確重組質粒DNA的重組大腸桿菌。[0230]2)AfSA4-AP融合蛋白的表達和純化按實施例10的方法操作，但步驟5誘導表達溫度為28°C。[0231]純化后的AfSA4_AP融合蛋白經SDS-PAGE電泳檢測表明(圖10)，融合蛋白分子量約為80kD。[0232]實施例15:AfSA4-AP融合蛋白活性檢測[0233]I)將100ill黃曲霉菌或寄生曲霉菌SCWPs(IOiig/ml)加入ELISA板孔中，37°C溫浴2h或4°C放置過夜，進行抗原包被。[0234]2)每個ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0235]3)將300UI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)加入到抗原包被孔和空白對照孔中，于37°C封閉2h。[0236]4)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec[0237]5)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的AfSA4_AP抗體(200nM)，37C溫浴2h。[0238]6)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0239]7)每孔加入100UI顯色液(0.2%(ff/V)對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)溶液)，避光反應15~30min，用酶標儀測定OD4tl5nm值。[0240]根據ELISA結果顯示，AfSA4_AP抗體對黃曲霉菌和寄生曲霉菌SCWPs具有高親和力，酶標儀測定的OD4tl5nm平均值為2.842(黃曲霉)和2.794(寄生曲霉)，分別比陰性對照高出49.0倍和50.8倍。[0241]實施例16=ELISA分析AfSA4抗體和AfSA4-AP融合蛋白的結合特性[0242]I)選取6種曲霉屬菌株和其它9種非曲霉屬真菌菌株(見表1)，按實施例1的方法I培養孢子和菌絲。[0243]2)將孢子液或菌絲塊接種于20mlYPG培養基(0.3%酵母粉，I%蛋白胨，2%葡萄糖)中，28°C，200r/min培養5天。[0244]3)按實施例1中步驟3)的方法將菌絲過濾收集并在液氮中研磨并重懸于PBS中。[0245]3)在ELISA板孔中加入100UI菌絲懸浮液(lmg/ml)，37°C溫浴包被2h或4°C包被過夜。[0246]4)分別用AfSA4抗體和AfSA4_AP融合蛋白進行ELISA檢測。[0247]①當用AfSA4抗體檢測時:[0248]a)每個ELISA板孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0249]b)將300UI封閉液(含2%(W/V)脫脂奶粉的PBS溶液)加入到抗原包被孔和空白對照孔中，于37°C封閉2h。[0250]c)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0251]d)每孔加入100uI稀釋在封閉液中的AfSA4抗體(200nM)，37°C溫浴2h。[0252]e)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0253]f)每孔加入100UI稀釋在封閉液中的鼠抗HA標簽抗體(體積比為1:10，000)，37°C溫浴2h。[0254]g)每孔用300UIPBST洗滌3次，每次30sec。[0255]h)每孔加入100ill稀釋在封閉液中的AP標記羊抗鼠IgG抗體(體積比為1:10，000)，371:溫浴211。[0256]i)每孔用300UIPBST和PBS分別洗滌3次，每次30sec。[0257]j)每孔加入100UI顯色液(0.2%(ff/V)對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)溶液)，避光反應15~30min，用酶標儀測定OD4tl5nm值。[0258]②AfSA4_AP融合蛋白檢測:按實施例15步驟2~7)的方法操作。[0259]ELISA結果表明(見表1)AfSA4抗體和AfSA4_AP融合蛋白對黃曲霉和寄生曲霉都具有很高的親和力，而與非曲霉屬的真菌無交叉反應，說明AfSA4-AP融合蛋白具有AfSA4抗體對抗原的親和力和特異性。[0260]表1ELISA檢測分析AfSA4抗體和AfSA4-AP融合蛋白的抗原結合特性[0261]【權利要求】1.一種黃曲霉特異單鏈抗體基因AfSA4，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。2.權利要求1所述的一種黃曲霉特異單鏈抗體基因AfSA4，其特征在于:該基因的輕鏈可變區'由312個核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；重鏈可變區VII由390個核苷酸編碼，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。3.一種黃曲霉特異單鏈抗體AfSA4蛋白，其特征在于:該蛋白由252個氨基酸組成，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。4.權利要求3所述的一種黃曲霉特異單鏈抗體AfSA4蛋白，其特征在于:其輕鏈可變區Vl由104個氨基酸組成，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；重鏈可變區VII由130個氨基酸組成，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。5.一種黃曲霉特異單鏈抗體與堿性磷酸酶融合的重組基因AfSA4-AP，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。6.一種黃曲霉特異單鏈抗體與堿性磷酸酶融合的重組蛋白AfSA4-AP，其編碼核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。7.一株分泌抗黃曲霉單克隆抗體的雜交瘤細胞株2A8，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為:CCTCCNO:C2013101o8.權利要求7所述的雜交瘤細胞株2A8在制備單克隆抗體中的應用。9.權利要求6所述的重組蛋白AfSA4-AP在檢測黃曲霉和寄生曲霉中的應用。10.權利要求8所述的雜交`瘤細胞株2A8在檢測黃曲霉和寄生曲霉中的應用。【文檔編號】G01N33/68GK103555732SQ201310477107【公開日】2014年2月5日申請日期:2013年10月13日優先權日:2013年10月13日【發明者】廖玉才,薛升,李和平申請人:華中農業大學