豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒及檢測方法，其包括供體微珠、受體微珠、豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體及帶His標簽的E2蛋白抗原。本發明通過優化供體微珠、受體微珠、單克隆抗體、抗原以及血清等試驗反應條件，建立了檢測CSFV抗體的競爭AlphaLISA檢測方法。利用本發明的試劑盒進行CSFV抗體的檢測，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗滌，不受溶血影響，檢測成本低，檢測時間短。
【專利說明】豬瘟病毒抗體競爭AIphaLISA檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及豬瘟病毒抗體的免疫學檢測，具體涉及ー種豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]豬瘟病毒(CSFV)屬于黃病毒屬的成員。由于CSFV的高致病力和高致死率，它已給養殖業造成了巨大的損失。豬感染高致病力毒株后在潛伏期即可造成感染，經歷急性豬瘟或亞急性豬瘟臨床癥狀的豬在出現癥狀前大量排毒，而耐過后的豬只體內有明顯的CSFV抗體，且不再排毒。感染溫和性毒株的豬呈慢性感染，在病死前會長期或間歇性地排毒。懷孕母豬可以通過胎盤感染胎兒導致流產、木乃伊化或產出弱豬、畸形胎等。先天性感染低毒力病毒的結果是產出持續性感染的仔豬，仔豬出現免疫耐受，不表現任何癥狀向外排毒。豬也有可能感染BVDV或BDV。盡管這些感染通常呈溫和過程并且是自限性的，但有效的將它們同豬瘟病毒區分是很重要的。我國自首次分離到該病毒以來，已先后在廣東、上海、福建等多省暴發和流行，目前該病在我國已普遍存在。現有的檢測方法主要有病毒的分離鑒定、免疫過氧化物酶技術，免疫膠體金技術，免疫熒光抗體染色技術，ELISA、PCR和real timePCR等，各有優缺，且特異性差異較大。同時，方法對樣品和人員的要求較高。由于豬感染豬瘟病毒或免疫豬瘟疫苗均能產生相應的抗體，且抗體能較好的反應其免疫或感染病毒的情況，因此，可以通過檢測CSFV的抗體來反應其免疫感染病毒情況。
[0003]AlphaLISA技術主要依賴于Alpha供體微珠和受體微珠的相互作用。當生物反應使供體微珠和受體微珠相互接近吋，激光激發級聯反應，從而產生極大放大的信號。具體來說，在680nm的激光照射下，供體微珠上的光敏劑將周圍環境中的氧氣轉化為更為活躍的單體氧。単體氧擴散至受體微珠，產生一系列的化學發光反應，最后將能量傳遞到銪，發射波長為615nm。在生物分子不存在特異的互相作用吋，單體氧無法擴散到受體微珠，則不會有信號的產生。AlphaLISA技術憑借一種專有的基于微珠的技木，將傳統的ELISA轉化為均相的“無需洗滌”的檢測。
[0004]AlphaLISA技術所使用的稀土元素銪(Eu)，發射波長非常尖鋭，為615nm，從而大大減少了檢測樣品中雜質的干擾，可直接檢測復雜樣品(血清和體液)中的生物分子。在臨床上，這非常適合測定人和動物的血清和體液樣本。而此技術的高通量、高靈敏度、操作簡便，能更準確、更省時的測定細胞因子等生物標志物。目前，已廣泛用于藥物篩選、細胞因子、病變基因、血清抗體等的檢測。
[0005]中國發明專利申請(申請號為:201210031802.X，201210047016.9)分別公開了采用AlphaLISA技術檢測腸道病毒71型衣殼蛋白(Ant1-EV71 VPl IgM)和甲型肝炎病IgM的方法。但是，目前尚無利用AlphaLISA技術檢測豬瘟病毒抗體的試劑盒及檢測方法的報道。
【發明內容】
[0006]本發明的第一目的是提供一種豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，以及編碼試劑盒中抗原的基因及其擴增該基因所用的引物。第二目的是提供一種用于食品安全檢測的豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測方法。
[0007]為實現第一目的本發明采用的技術方案是豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，包括供體微珠、受體微珠、豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體和帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原。
[0008]其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PE，AS101D (即Nickel chelateDonor beads (PE, AS101D)),濃度為80 u g/mL, 500 u L ;所述受體微珠為抗鼠IgG受體微珠，PE, AL105C(即 Ant1-mouse IgG Acceptor beads (PE, AL105C))，濃度為 80 u g/mL, 500 y L ;所述帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有與豬瘟病毒E2蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
[0009]前述的試劑盒，包括供體微珠80 U g/mL、受體微珠80 U g/mL、豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體100nM/L及帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原180nM/L ;使用吋，以總體積20 μ L計，每孔添加量為:受體微珠4 u L、供體微珠5 u L、180nM/L帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原5 u LU00nM/L豬瘟病毒抗E2蛋白單克隆抗體5 u L及待測樣品1 μL
[0010]具體地，編碼上述帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原的基因為CSFV E2基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2。CSFV E2基因是通過RT-PCR擴增反應得到的；RT-PCR擴增反應的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.4。
[0011]為實現本發明的第二目的所采用的技術方案是:ー種利用上述試劑盒進行豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測方法，包括如下步驟:
1)反應板的待測孔中每孔加入1μ L待測樣本，對照孔中加入1μ L 1X稀釋緩沖液；
2)每孔加入5μ L 180nM/L帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原和5 μ L 100nM/L豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體，1000rpm離心10 sec，室溫23°C避光孵育1h ；
3)姆孔加入80μ g/mL受體微珠4 u L、80 μ g/mL供體微珠5 μ L, 1000rpm離心10sec，室溫23°C避光孵育30 min ；
4)結果讀取:將反應板置Enspire(PE) AlphaLISA檢測系統中讀值。
[0012]采用上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果:
利用本發明的試劑盒進行豬瘟病毒抗體的檢測，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗漆，不受溶血影響。
[0013]本發明的優點是(1)、操作簡單，不需要洗滌；(2)、高特異性:抗原與抗體的特異性結合,均相的反應,所需樣本體積小,僅需1 --L ;(3)、檢測時間短:檢測時間比傳統的ELISA時間短，僅需1.5 h即可完成檢測；(4)、靈敏度高:最低檢測極限比普通ELISA高5~10倍；樣本檢測的檢出率達到97.5% ; (5)、背景低，抗淬滅能力強:采用長波長激發，短波長發射，不會有來自熒光的背景；且利用時間分辨熒光的檢測模式，進ー步降低了背景，確保結果的真實性，615nm的發射波長，非常尖鋭，基本沒有來自樣品的淬滅干擾，是進行血清、血漿、體液等復雜樣品檢測的理想選擇；(6)、用途:可用于血清及其相關樣本中豬瘟病毒抗體的快速檢測。【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為CSFV E2基因全長的核酸擴增電泳圖；其中第I泳道為CSFV E2基因的擴增產物，第M泳道為DL 2000 DNA marker ；
圖2為重組表達質粒pET-CSFV-E2經Xho 1、Kpn I雙酶切后電泳圖；圖中第I泳道為質粒pET-CSFV-E2經酶切后，第2泳道為空載體，第3泳道為質粒pET_CSFV_E2酶切前，第M 泳道為 15000 DL Marker ；
圖3為CSFV E2蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析結果，第M泳道為預染蛋白分子量標準，從上至下分子量依次為97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD ;第I泳道為未誘導的對照；第2和3泳道為CSFV E2蛋白全長1-1122，分子量大小約為56 KD，與預期結果一致；
圖4 His-標簽CSFV E2全長蛋白的Western blot鑒定結果；第I泳道為空白對照、第2和3泳道為CSFV E2全長1-1122，分子量大小約為56KD，第M泳道為Western blot蛋白分子標準，從上至下分子量依次為 170KD、95KD、72 KD,55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、10KD。
【具體實施方式】
[0015]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0016]以下實施中使用的豬瘟病毒弱毒疫苗株為市售產品，保存于重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心。
[0017]一、CSFV E2重組蛋白原核表達質粒的構建及鑒定 1、目的片段擴增
1.1、RT-PCR 擴增
以豬瘟病毒弱毒疫苗株CSFV (GenBank N0.:NC_002657.1)的基因組為模板，進行反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增所需目的片段CSFV E2基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0018]上下游引物分別引入Kpn I和Xho I酶切位點，引物設計采用Primer Preier5( —種引物設計軟件)，引物由寶生物(大連)公司合成，引物序列見表1。
[0019]表1引物序列
【權利要求】
1.豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于:包括供體微珠、受體微珠、豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體和帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原； 其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PEjASIOID ;所述受體微珠為抗鼠IgG受體微珠，PE，AL105C ;所述帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有與豬瘟病毒E2蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于:所述供體微珠80 u g/mL、受體微珠80 u g/mL、豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體100nM/L及帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原180nM/L ； 使用時，以總體系20 ii L計,每孔添加量為:80 u g/mL供體微珠5 y L、80 y g/mL受體微珠4 ii L、180nM/L帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原5 y L、100nM/L豬瘟病毒抗E2蛋白單克隆抗體5 ii L及待測樣品I Uし
3.根據權利要求1或2所述豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于:編碼所述帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原的基因為CSFV E2基因，其核苷酸序列為SEQID N0.2。
4.根據權利要求3所述豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于:所述CSFV E2基因是通過RT-PCR擴增反應得到的；RT-PCR擴增反應的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.4。
5.利用權利要求1所述豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒檢測豬瘟病毒抗體的非疾病診斷目的的檢測方法，包括以下步驟: 1)反應板的待測孔中每孔加入IU L待測樣本，對照孔中加入IuLlX稀釋緩沖液； 2)每孔加入5ii L 180nM/L帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原和5 y L 100nM/L豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體，IOOOrpm離心10 sec，室溫23°C避光孵育Ih; 3)姆孔加入80ii g/mL受體微珠4 u L、80 y g/mL供體微珠5 y L, IOOOrpm離心10sec，室溫23°C避光孵育30 min ； 4)結果讀取:將反應板置Enspire(PE) AlphaLISA檢測系統中讀值。
【文檔編號】G01N33/68GK103499693SQ201310472881
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】聶福平, 楊俊 , 王昱, 李賢良, 李應國, 肖進文 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心