一種鴨源性成分摻假的快速鑒別方法
【專利摘要】一種鴨源性成分摻假的快速鑒別方法，屬于生物化工【技術領域】。本發明包括如下步驟：（1）結合鴨源性成分特異核酸序列DNA的金納米粒子探針的制備；（2）樣品中核酸片段的提取和處理；（3）鴨源性成分摻假的快速鑒別。本發明利用金納米粒子聚集會發生變色的特殊光學性質，結合特異性的鴨源性核酸序列，建立了特異性鴨源DNA序列的探針檢測體系，根據比色結果實現了鴨源性成分的快速鑒別，當樣品中含有5%及以上的鴨源性成分即可被檢測出來。填補了現有的鴨源性成分的快速鑒別技術空白，使得現場快速鑒別肉類摻假成為可能。
【專利說明】一種鴨源性成分摻假的快速鑒別方法
【技術領域】
[0001]一種鴨源性成分摻假的快速鑒別方法，屬于生物化工【技術領域】。
【背景技術】
[0002]在利益的驅動下，使用鴨肉冒充羊肉的摻假事件可謂層出不窮，針對肉類的造假和摻假，目前鑒別肉類摻假的檢測方法一般基于PCR技術，而常規的PCR檢測需要擴增、電泳及酶切確證三步技術，從檢樣到報告結果，至少需要5個小時，缺少現場快速篩選的檢測手段，使得錯檢、漏檢等現象時有發生，極大地損害了國家利益和消費者利益。因此，發明一種新型肉類成分快速鑒別方法，是當前的迫切需要。
[0003]本發明利用金納米粒子的特殊光學性質，結合特異性的鴨源性核酸序列，結合采用比色方法實現了鴨源性成分的快速鑒別，當樣品中含有5%及以上的鴨源性成分即可被檢測出來。
【發明內容】
[0004]本發明的目的:提供一種快速的鴨源性成分摻假的鑒別方法，使得現場快速鑒別成為可能。
[0005]本發明的技術方案:一種鴨源性成分摻假的快速鑒別方法，步驟為:
鴨源性成分特異性核酸序列的選擇:
根據Genebank公布的潛鴨`族的全序列(GenBank:AF090337.1)及綠頭鴨的線粒體DNA部分序列(GenBank:EU755253.1)，選擇了 DNA:5’_CAG CGT CTA CGG CTC CAC CTT CTT TGTCGC-3’這一潛鴨族和綠頭鴨共有的特異性序列片段。其中片段長度為30bp，約10nm，該核酸序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0006](I)結合鴨源性成分特異核酸序列DNA的金納米粒子探針的制備:
采用表面帶負電的金納米粒子，粒徑為5~30nm,濃度為30nmol/L。金納米粒子的合成方法為檸檬酸三鈉還原法，合成及處理步驟如下:量取100mL、0.lg/L的HAuCl4溶液加至三角燒瓶，攪拌加熱至沸騰，5 min后快速加入f 5mL、10g/L的檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱30min，冷卻后，裝入分子量12000道爾頓的透析袋，用超純水透析2天，期間換水3次。取100 μ L金納米粒子溶液至1.5mL EP管,用超純水稀釋至ImL,得到3nmol/L濃度的金納米粒子溶液，加入A26tl=0.27即濃度為10 μ g/mL的鴨肉特異性DNA探針10~50 μ L，振蕩混勻，將EP管置于水浴中溫育5~30min，水浴溫度為25飛(TC，此時核酸片段吸附在金納米粒子表面，得到了具有一定耐鹽能力的金納米粒子探針體系。
[0007]DNA:5’ -CAG CGT CTA CGG CTC CAC CTT CTT TGT CGC-3’。
[0008](2)樣品中核酸片段的提取和處理:
取含有疑似鴨肉成分的肉類，剪碎后，準確稱取0.1g置于1.5mL EP管中，加入ImL組織裂解液(10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.4 mg/mLproteinase K)，蓋上蓋子，將EP管置于沸水中煮，時間為l(T30min，將EP管于5000rpm離心IOmin,吸取上清，上清中加入等體積抽提液(酹:氯仿:異戍醇體積比=25:24:1),混勻，靜置5min，5000rpm離心lOmin，吸取上層水相上清液，上清液中加入等體積冰無水乙醇，輕輕搖勻，靜置15min，用吸頭小心吸取析出的DNA’形成的白色絮狀物，用70%乙醇漂洗2次，加入100 μ L超純水溶解，將提取的DNA’樣品進行紫外檢測，確認A26tlA28tl的數值在1.8~1.9左右，并用超純水調節DNA’濃度，使其Α26(ι=2.7，此時DNA’濃度約100 μ g/mL。
[0009] (3)鴨源性成分摻假的快速鑒別:
吸取提取處理得到的DNA’樣品10-50μ L，加至ImL的金納米粒子探針體系，37°C溫育5~30min，探針體系中加入10% NaCl溶液100 μ L，混勻，靜置5min，觀察金納米粒子探針體系的顏色變化，如果DNA’樣品中含有鴨肉DNA，則該DNA會與原先吸附在金納米粒子表面的特異性核酸序列進行特異性結合，形成雙鏈DNA，因此原先的金納米粒子失去了耐鹽能力，在NaCl的存在下，探針體系顏色變成灰色或有藍灰色沉淀產生，說明檢測的DNA’樣品中含有鴨肉DNA，且鴨肉占的比例至少為5% ;如果探針體系的顏色仍是紅色，則說明檢測的DNA’樣品中不含鴨肉DNA。
[0010]本發明的有益效果:本發明利用特異性的鴨源性核酸序列的互補片段，結合金納米粒子的特殊光學性質，采用比色方法實現了鴨源性成分的快速鑒別，使得現場快速鑒別肉類摻假成為可能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1、鴨源性DNA成分鑒別原理圖圖2、實際摻假樣品鑒別圖
1-6為從左至右分別測定了含有0%，1%，2%，5%，10%, 20%鴨肉的樣品，從圖可見，當樣品中含有5%鴨肉時，金納米粒子出現明顯的變色，肉眼可以很容易判斷。
【具體實施方式】
[0012]下述實例中所使用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0013]下述實例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0014]實施例1結合鴨源性成分特異核酸序列DNA的金納米粒子探針體系的建立采用表面帶負電的IOnm金納米粒子,濃度為30nmol/L,具體合成及處理步驟如下:量
取IOOmL 0.lg/L的HAuCl4溶液加至三角燒瓶，攪拌加熱至沸騰，5 min后快速加入3mL10g/L的檸檬酸三鈉溶液，繼續加熱30min，冷卻后，裝入分子量12000道爾頓的透析袋，用超純水透析2天,期間換水3次。取100 μ L金納米粒子溶液至1.5mL EP管,用純水稀釋至ImL,得到3nmol/L濃度的金納米粒子溶液，加入A26tl=0.27即濃度為10 μ g/mL的DNA探針30 μ L，振蕩混勻，將EP管置于40°C水浴中溫育lOmin，得到金納米粒子探針體系。
[0015]實施例2樣品中核酸片段的提取和處理
取含有疑似鴨肉成分的肉類，剪碎后，準確稱取0.1g置于1.5mL EP管中，加入ImL組織裂解液(10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS ,0.4 mg/mLproteinase K)，蓋上蓋子，將EP管置于沸水中煮20min，將EP管于5000rpm離心lOmin，吸取上清。上清中加入等體積抽提液(酚:氯仿:異戊醇體積比=25:24:1)，混勻，靜置5min，5000rpm離心lOmin,吸取上層水相上清液,上清液中加入等體積冰無水乙醇，輕輕搖勻，靜置15min，用吸頭小心吸取析出的DNA’形成的白色絮狀物，用70%乙醇漂洗2次，加入100 μ L超純水溶解，將提取的DNA’樣品進行紫外檢測，確認A26tlA28tl的數值在1.8^1.9左右，并用超純水調節DNA’濃度，使其Α26(ι=2.7，此時DNA’濃度約100 μ g/mL。
[0016]實施例3比色法檢測過程實施
吸取提取處理得到的DNA’樣品30 μ L，加至ImL的金納米粒子探針體系，37°C溫育lOmin，探針體系中加入10% NaCl溶液100 μ L，混勻，靜置5min，觀察金納米粒子探針體系的顏色變化 ，如果顏色仍是紅色，說明檢測的DNA’樣品中不含鴨肉DNA，如果探針體系顏色變成灰色或有藍灰色沉淀產生，則說明檢測的DNA’樣品中含有鴨肉DNA，且鴨肉占的比例至少為5%。
【權利要求】
1.一種鴨源性成分摻假的快速鑒別方法，其特征在于步驟為:(O結合鴨源性成分特異核酸序列DNA的金納米粒子探針的制備:采用粒徑為5~30nm,濃度為30nmol/L,表面帶負電的金納米粒子,用超純水透析,除去合成過程中過量的檸檬酸三鈉分子；取100 μ L金納米粒子溶液至1.5mL EP管，用超純水稀釋至lmL，得到3nmol/L濃度的金納米粒子溶液，加入A26tl=0.27即濃度為10 μ g/mL的鴨肉特異性DNA序列探針10-50 μ L，振蕩混勻，將EP管置于水浴中溫育5~30min，水浴溫度為25飛(TC，此時核酸片段吸附在金納米粒子表面，得到了具有一定耐鹽能力的金納米粒子探針體系；DNA:5’ -CAG CGT CTA CGG CTC CAC CTT CTT TGT CGC-3’，(2)樣品中核酸片段的提取和處理:取含有疑似鴨肉成分的肉類，剪碎后，準確稱取0.1g置于1.5mL EP管中，加入ImL組織裂解液，組織裂解液組成為:pH 7.5 的 10 mM Tris-HClUOO mM NaCl、10 mM EDTA、0.5%SDS和0.4 mg/mL proteinase K，蓋上蓋子，將EP管置于沸水中煮，時間為l(T30min，將EP管于5000rpm離心IOmin,吸取上清,上清中加入等體積抽提液,抽提液組成為:酹:氯仿:異戊醇體積比=25:24:1，混勻，靜置5min，5000rpm離心lOmin，吸取上層水相上清液，上清液中加入等體積冰無水乙醇，輕輕搖勻，靜置15min，用吸頭小心吸取析出的DNA’形成的白色絮狀物，用70%乙醇漂洗2次，加入100 μ L超純水溶解，將提取的DNA’樣品進行紫外檢測，確認A26tlA28tl的數值在1.8^1.9，并用超純水調節DNA’濃度，使其Α26(ι=2.7，此時DNA’濃度 100 μ g/mL ； (3)鴨源性成分摻假的快速鑒別:吸取提取處理得到的DNA’樣品10-50μ L，加至ImL的金納米粒子探針體系，37°C溫育5~30min，探針體系中加入10% NaCl溶液100 μ L，混勻，靜置5min，觀察金納米粒子探針體系的顏色變化，如果顏色仍是紅色，說明檢測的DNA’樣品中不含鴨肉DNA ;如果探針體系顏色變成灰色或有藍灰色沉淀產生，說明檢測的DNA’樣品中含有鴨肉DNA，且鴨肉占的比例至少為5%。
【文檔編號】G01N21/78GK103525915SQ201310445791
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】馮永巍, 王琴, 田耀旗 申請人:無錫市產品質量監督檢驗中心