一種促性腺激素釋放激素類似物的組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種促性腺激素釋放激素類似物的組合物，其采用液相色譜與質譜聯用技術測定，同時測定睪酮和促性腺激素釋放激素類似物；另外提供一種方法能夠同時成功檢測樣品中的睪酮和促性腺激素釋放激素類似物，實現在使用促性腺激素釋放激素類似物及其組合物后，同時檢測其體內促性腺激素釋放激素類似物和睪酮的含量及其變化過程。
【專利說明】一種促性腺激素釋放激素類似物的組合物
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種促性腺激素釋放激素類似物的組合物，其采用液相色譜與質譜聯 用技術測定，同時測定睪酮和促性腺激素釋放激素類似物。
【背景技術】
[0002] 促性腺激素釋放激素（LHRH)，是丘腦下部弓狀核合成的10肽，結構為？71~〇-6111-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu_Arg-Pr〇-Gly-NH2，下丘腦脈沖釋放LHRH，可以刺激垂體釋放促 性腺激素釋放激素，1971年Schall從50萬頭豬、羊下丘腦分離出幾毫克的LHRH，并人工合 成確證了LHRH的結構，因此獲得諾貝爾醫學與生理學獎。哺乳動物的LHRH具有相同的結 構，LHRH的第5?6、6?7、9?10位氨基酸鏈穩定性差，極易受肽鏈內切酶作用而裂解， 因而LHRH在體內半衰期僅有2?4min,如果將其6位和10位氨基酸進行置換或去除，可得 到9肽LHRH激動劑（agonists)，其化學結構與LHRH極為相似，但穩定性大大提高，半衰期 可達5h以上。LHRH激動劑和LHRH拮抗劑（antagonist)，統稱LHRH類似物（LHRHa)，它們 都是通過與內源性LHRH競爭受體而發揮作用。
[0003] 促性腺激素釋放激素類似物可因給藥方式和用藥劑量的不同而引起性腺軸的正 反雙向反應。生理脈沖式注射LHRH對垂體-性腺軸起興奮與刺激作用，表現為升調節，促進 青春期發育，對維持生殖系統的功能具有重要作用。但大量的動物實驗及臨床觀察發現，當 給予外源性大劑量的LHRH或其類似物時，對生殖系統有抑制作用。促性腺激素釋放激素類 似物最初會刺激垂體分泌促性腺激素（Gn)，即黃體生成素（LH)和卵泡刺激素（FSH)。當垂 體經過長期的刺激后會進入不應期，促性腺激素的釋放會減少，因而使性類固醇（睪酮） 降低至去勢水平。上述作用是可逆轉的。臨床上被用于治療各種激素依賴性疾病如前列腺 癌、子宮內膜異位、子宮肌瘤和性早熟等。
[0004] 目前促性腺激素釋放激素類似物組合物在臨床上主要被用作治療激素依賴性 腫瘤如前列腺癌、乳腺癌等。市場上常用的有：①戈舍瑞林（Goserelin)，商品名諾雷德 (Zoladex);②亮丙瑞林，商品名抑那通（Leuprorelin);③曲普瑞林（Triptorelin)，商品 名達菲林（Diphereline);④布舍瑞林（Buserelin);⑤那法瑞林（Nafarelin)。
[0005] 促性腺激素釋放激素類似物組合物已上市的產品主要有注射劑和長效緩釋制劑， 其臨床常用劑量非常低，臨床應用的不良反應是由于激素的產生被抑制而可能引起的藥理 副作用，臨床極低的用量，就可能引起極強的臨床不良反應，因此臨床治療時應密切監測性 類固醇血漿水平。檢測藥物體內濃度與藥效指標參數變化，可以優化給藥方案，可更有效 發揮藥物作用，提高臨床療效，這些情況都迫切需要建立一種操作簡單，特異性好及高靈 敏的檢測技術。
[0006] 促性腺激素釋放激素類似物(如曲普瑞林、戈舍瑞林）目前多采用放射免疫進行定 量，免疫法由于存在交叉反應，影響低濃度定量結果的準確性，并且其具有放射性，對檢測 人員有潛在的傷害可能；且其試劑盒非常昂貴，不適合臨床及科研使用；睪酮的定量過程 有液質聯用分析和酶聯免疫法。液質聯用分析采用衍生化樣品前處理，操作復雜，同時睪酮 做為一種內源性化合物，從分析角度來說，使得分析更加復雜。如果需要同時獲得睪酮和 促性腺激素釋放激素類似物的數據，目前采用的是同一時間段采集二個血漿樣品，分別處 理，分別測定（Pharmacokinetic/pharmacodynamicmodelofthetestosteroneeffects oftriptorelinadministeredinsustainedreleaseformulationsinpatientswith prostatecancer-JournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics(2012), 3 42 (3)，788-798)，此種處理使得樣品前期處理的工作量大，批次之間可能會造成差異，采用 不同檢測數據之間統計分析也會有較大誤差。
[0007] 為了克服這些缺點，我們將睪酮和促性腺激素釋放激素類似物同時提取出來，進 一步采用液質聯用來同時進行睪酮和促性腺激素釋放激素類似物的定量分析。采用此分析 過程能降低成本，減少工作量，操作簡單、結果準確、特異性好、靈敏度高，極大的提高分析 速度，減少結果偏差；給臨床用藥如給藥間隔、劑量調整等提供準確指導，同時對促性腺激 素釋放激素類似物組合物設計提供更好的支持。
【發明內容】
[0008] 針對現有技術存在的上述缺陷，本發明人進行深入研究，提供一種促性腺激素釋 放激素類似物的組合物，其采用液相色譜與質譜聯用技術測定，同時測定睪酮和促性腺激 素釋放激素類似物，液相色譜的流動相采用含酸的水溶液-甲醇體系進行梯度洗脫，所述 酸為丙酸；酸的體積百分濃度〇. 01-0. 1%，優選為〇. 01-0. 05%。
[0009] 在液質聯用測定血漿中促性腺激素釋放激素類似物的過程中，血漿前處理對實驗 結果起到關鍵作用，本發明可采用固相萃取處理血漿樣品，首次將睪酮和促性腺激素釋放 激素類似物萃取到一個樣品單元中，為同時測定睪酮和促性腺激素釋放激素類似物打下基 礎。
[0010] 所述固相萃取過程采用的固相萃取柱可以根據促性腺激素釋放激素類似物不同 適當調整，如曲普瑞林可以采用活化好的Strata?-xSPE固相萃取柱，戈舍瑞林可以采用活 化好的OasisK丨丨丨.丨個相萃取柱。
[0011] 在采用液質聯用測定中，液相色譜流動相的選擇具有非常重要的作用。本發明所 述流動相的有機相選擇甲醇，相比乙腈等其他有機溶劑，在測定促性腺激素釋放激素類似 物和睪酮時甲醇能夠產生更高的響應值和較好的色譜行為；流動相的水相中添加酸可明顯 提高方法的靈敏度，其中添加丙酸比甲酸、乙酸等其他酸，可以顯著提高靈敏度。
[0012] 所述梯度洗脫含酸水溶液和甲醇的體積比具體如下表
[0013]
[0014] 本發明另一方面還涉及哺乳動物在使用促性腺激素釋放激素類似物組合物后， 檢測體內促性腺激素釋放激素類似物和睪酮含量變化及代謝的方法，其用于檢測哺乳動 物在使用促性腺激素釋放激素類似物組合物后體內促性腺激素釋放激素類似物的含量及 其變化過程，和其藥效參數睪酮的體內濃度變化過程的用途。方法采用液相色譜與質譜 聯用技術測定，同時測定睪酮和促性腺激素釋放激素類似物，液相色譜的流動相采用含酸 的水溶液-甲醇體系進行梯度洗脫，所述酸為丙酸；酸的體積百分濃度〇. 01-0. 2%，優選為 0. 01-0. 08%。方法可采用固相萃取處理血漿樣品，采用的固相萃取柱可以根據促性腺激素 釋放激素類似物不同適當調整，如曲普瑞林可以采用活化好的Strata?-XSPE固相萃取柱， 戈舍瑞林可以采用活化好的OasVnLB固相萃取柱。液相色譜梯度洗脫為，第一時間段含 酸的水溶液A與甲醇B的體積比為75-95 : 5-25,優選80 :20 ;第二時間段A與B的體積比 為30-50 : 50-70,優選40:60;第三時間段A與B體積比為15-35 : 65-85;第四時間段A 與B的體積比為1-10 : 90-99;第五時間段A與B的體積比為75-95 : 5-25,優選80:20。 通過本發明所述的方法能夠同時成功檢測樣品中的睪酮和促性腺激素釋放激素類似物，實 現在哺乳動物使用促性腺激素釋放激素類似物及其組合物后，同時檢測其體內促性腺激素 釋放激素類似物和睪酮的含量及其變化過程。
[0015] 本發明所述哺乳動物使用促性腺激素釋放激素類似物組合物后，檢測體內促性腺 激素釋放激素類似物和睪酮含量變化及代謝的方法，具有優于現有檢測技術的靈敏度和特 異性，可用于樣品中同時檢測睪酮和促性腺激素釋放激素類似物，為確定促性腺激素釋放 激素類似物組合物在體內的藥代和藥效研究提供了有效的檢測手段。本發明所述方法可用 于促性腺激素釋放激素類似物組合物的開發，在臨床上測定使用促性腺激素釋放激素類似 物制劑的患者體內藥物代謝動力學（PK)參數和藥物效應動力學（PD)參數的變化，通過連 續觀察其動態變化能夠為指導臨床促性腺激素釋放激素類似物組合物的合理使用提供實 驗依據。
[0016] 所述體積百分濃度為l〇〇ml水中所含酸的體積（ml)數。
[0017] 所述檢測限是指在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度(量)，即產生信號（峰高） 為基線噪音標準差k倍時的樣品濃度，一般將檢測限定義為信噪比（S/N) 3:1時的濃度。
[0018] 所述定量限是指在樣品中能檢出的被測組分的濃度(量)，即產生信號（峰高）為基 線噪音標準差k倍時的樣品濃度，一般將定量限定義為信噪比（S/N) 10:1時的濃度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1曲普瑞林和睪酮在流動相為0. 05%丙酸水溶液-甲醇的液質檢測圖譜
[0020] 圖2戈舍瑞林和睪酮在流動相為0. 02%丙酸水溶液-甲醇的液質檢測圖譜
[0021] 圖3達菲林在大鼠血漿中的PK/PD曲線圖譜
[0022] 圖4諾雷德在大鼠血漿中的PK/PD曲線圖譜
【具體實施方式】
[0023] 下面通過實施例對本發明加以進一步的說明，但不以任何形式限制本發明。
[0024] 實施例1流動相為0. 02%丙酸水溶液-甲醇檢測戈舍瑞林和睪酮標液
[0025] 標準溶液樣配制
[0026] 精密稱量醋酸戈舍瑞林對照品，以甲醇溶液配制成1.00mg/mL母液備用。睪酮儲 備液（l〇〇yg/mL)，均購買自美國Sigma公司。以甲醇-水-甲酸（60:40:0.08v/v/v)為稀釋 液，將睪酮和戈舍瑞林稀釋成以下濃度的標準混合液，〇. 02+0. 005、0. 05+0. 01、0. 1+0.03、 0? 2+0. 1和0? 5+0.3ng/mL。
[0027]液相條件色譜柱：ZORBAXEclipseplusC18(2. 1mm x50mm, 1. 8iim,Stockport,UK)流動相：A:0? 02%丙酸水溶液，B:甲醇；流速：0? 4mL/min，柱 溫：40°C，進樣量：10yl。Agilentl290高效液相色譜系統，包括二元輸液泵，自動進樣器， 柱溫箱。梯度條件如下：
【權利要求】
1. 一種促性腺激素釋放激素類似物的組合物，其特征在于其采用液相色譜與質譜聯用 技術測定，同時測定睪酮和促性腺激素釋放激素類似物，液相色譜的流動相采用含酸的水 溶液-甲醇體系進行梯度洗脫，所述酸為丙酸。
2. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于所述促性腺激素釋放激素類似物為戈舍 瑞林。
3. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于所述促性腺激素釋放激素類似物為曲普 瑞林。
4. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于所述酸的體積百分濃度為0. 01-0. 1%。
5. 根據權利要求2所述的組合物，其特征在于所述酸的體積百分濃度為0. 01-0. 05%。
6. 根據權利要求1所述的組合物，其特征在于測定時采用的組合物檢測樣品為血漿樣 品，采用固相萃取處理。
7. 根據權利要求1-5任一所述的組合物，其特征在于液相色譜的梯度洗脫為，第一時 間段含酸的水溶液A與甲醇B的體積比為75-95 : 5-25;第二時間段A與B的體積比為 30-50 : 50-70;第三時間段A與B體積比為15-35 : 65-85;第四時間段A與B的體積比 為1-10 : 90-99;第五時間段A與B的體積比為75-95 : 5-25。
8. 根據權利要求7所述的組合物，其特征在于第一時間段含酸的水溶液A與甲醇B的 體積比為80 : 20;第二時間段A與B的體積比為40 : 60;第三時間段A與B體積比為 15-35 : 65-85;第四時間段A與B的體積比為1-10 : 90-99;第五時間段A與B的體積比 為 80 : 20。
9. 一種檢測哺乳動物在使用促性腺激素釋放激素類似物組合物后，同時測定體內促 性腺激素釋放激素類似物和睪酮含量變化及代謝的方法，方法采用液相色譜與質譜聯用技 術，液相色譜的流動相采用含酸的水溶液-甲醇體系進行梯度洗脫，所述酸為丙酸。
10. 根據權利要求9所述的方法，其用于檢測哺乳動物在使用促性腺激素釋放激素類 似物組合物后體內促性腺激素釋放激素類似物的含量及其變化過程，和其藥效參數睪酮的 體內濃度變化過程的用途。
【文檔編號】G01N30/34GK104458929SQ201310440157
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】韓江彬, 張樞, 孫考祥, 劉萬卉, 冷廣意, 王濤 申請人:山東綠葉制藥有限公司