毛發中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質的提取和檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種對毛發中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質的提取方法，包括毛發的提取和凈化步驟。該提取方法還可以包括一個衍生步驟。本發明還提供一種對毛發中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質進行檢測的方法，采用了氣相色譜質譜聯用儀或液相色譜質譜聯用儀。與傳統的毛發毒品殘留檢測方法相比，本發明的方法更溫和，且有效地提取出了毛發中的藥物并有效地去除了毛發檢材中的多種雜質干擾物，具有較高的靈敏度和準確度，可供政府執法部門、檢驗部門及藥檢機構使用。
【專利說明】毛發中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質的提取和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥檢測【技術領域】，特別是涉及毛發中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質的提取方法和檢測方法。
【背景技術】
[0002]毒品和濫用成癮性藥物危害人體健康和社會安全，一直是國家依法嚴厲打擊的對象，人體毒品殘留的檢測手段，對執法的輔助作用至關重要。在對人體毒品殘留的檢測中，毛發檢材越來越受關注。相較于傳統的生物檢材(尿液、血液、唾液、組織等)，毛發檢材具有無法比擬的獨特優勢，例如:檢出時限長、藥物濫用信息全面、抗腐敗、易于采取、保存和重復取樣等。毛發檢測在藥物濫用鑒定中的作用也已被確證和公認(KintzP.Analytical and practical aspects of drug testing in hair.Taylor&FrancisGroup, LLC, 2007:1-19 ;沈敏，向平.毛發分析基礎及應用[Μ].北京:科學出版社.2010:3-34.)。
[0003]生物檢材成分復雜，存在大量的干擾物，毛發中存在許多內源性雜質。因此建立有效的前處理方法分離提取毛發中的目標物是毛發檢測中的關鍵部分。毛發中氯胺酮及苯丙胺類毒品水解常用酸水解、堿水解、酶水解和甲醇提取等方法。酸水解法條件較為溫和，釋放效率較高，例如，在《氯胺酮濫用的毛發分析研究》中記載的一種酸水解方法，是將洗滌后的毛發樣本用0.lmol/L的HCl溶液ImL在45°C水浴中水解過夜，取出冷卻后調節PH至pH>10，用乙醚提取，取有機層吹干，得甲醇復溶殘留物，再注入氣相色譜質譜聯用儀加以分析(向平，沈敏，沈保華等.氯胺酮濫用的毛發分析研究.《法醫學雜志》2005 (21)4:290-293.)。但該方法依然存在酸水解時間太長，不滿足時效性的需求。堿水解藥物釋放完全，但條件激烈；酶水解適用范圍廣，釋放效率高，但價格昂貴。
[0004]目前，亟需一種對毛發中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質(包括苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDEA、MDA、甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮等)進行高效分離提取的方法，以及進行高靈敏度和高特異性檢測的方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的之一是提供一種毛發中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質的提取方法，該方法非常溫和，但又能夠有效富集得到氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質。
[0006]實現上述目的的技術方案如下。
[0007]—種毛發中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質的提取方法，包括以下步驟:
[0008](I)清洗毛發，以液氮研磨，得到毛發粉末；
[0009](2)加入復合毛發處理液并進行超聲處理，并離心得到預處理上清液；所述復合毛發處理液是0.02-0.5mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，含0.5%_10%的牛血清蛋白、0.1%_5%的吐溫20，且 pH 值 2.0-5.0 ；[0010](3)固相萃取柱經平衡后，注入所述毛發預處理上清液，依次用水、0.05-0.15M鹽酸溶液和甲醇洗滌雜質；用體積比為90:10-98:2的乙酸乙酯:氨水混合溶液洗脫氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質，得到固相萃取洗脫液。
[0011]優選地，步驟(2)所述復合毛發處理液0.025-0.3mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，含
0.5%-5%的牛血清蛋白、0.1%-3%的吐溫20，且pH值2.0-4.0。
[0012]優選地，步驟(2)所述的超聲處理為37_85°C進行1.5-12小時，更優選地，為60-85°C進行 2.0-4.0 小時。
[0013]優選地，步驟(3)固相萃取柱依次經甲醇、水和磷酸鹽緩沖液進行平衡。
[0014]在其中一個實施例中，該方法還包括衍生步驟:將所述毛發的固相萃取洗脫液吹干，并用體積比4:1-1:4的乙酸乙酯:七氟丁酸酐(HFBA)混合溶液進行衍生，再復溶于乙酸乙酯，得到衍生產物。
[0015]優選地，所述衍生步驟為:55-75°C反應20min-60min。
[0016]優選地，所述衍生步驟為:將所述毛發的固相萃取洗脫液吹干，并用體積比4:1-1:4的乙酸乙酯:七氟丁酸酐混合溶液，60-70°C反應20min-30min，再復溶于乙酸乙酯，得到衍生產物。
[0017]本發明的另一目的還提供一種對毛發中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質進行檢測的方法，該檢測方法靈敏度高，特異性好。
[0018]實現上述目的的技術方案如下。
[0019]一種對毛發中的氯胺酮 、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質進行檢測的方法，包括以下步驟:
[0020]I)根據上述提取方法得到所述固相萃取洗脫液或衍生產物；
[0021]2)采用氣相色譜質譜聯用儀或液相色譜質譜聯用儀對所述固相萃取洗脫液或衍生產物進行檢測。
[0022]在其中一個實施例中，所述氣相色譜質譜聯用儀檢測方法的操作條件如下:
[0023]進樣口溫度:150_280°C;
[0024]采用程序升溫模式，其中柱溫變化設定為:60- ( I分鐘)況Mi>180.C (2
分鐘)」-2001: ( I分鐘)240 cC (2分鐘)。
[0025]在其中一個實施例中，上述的液相色譜質譜聯用儀檢測的操作條件如下:
[0026]①色譜柱:Z0RBAXEclipse XDB-C182.1 X 150mm, 3.5 μ m,接 ZORBAX EclipseXDB-C182.1 X 12.5mm 保護柱；；
[0027]②柱溫:室溫；
[0028]③流動相:V(乙腈):V(乙酸銨緩沖溶液)=70:30 ；
[0029]④流速:250μ L/min ；
[0030]⑤進樣量:IOyL ;
[0031]⑥質譜條件:電噴霧電離離子源，正離子檢測模式；碰撞氣=Medium ;氣簾氣:25 ；離子噴霧電壓:5500V ;霧化氣溫度:5000C ；GS1:70 ；GS2:60。
[0032]本發明提供的一種對毛發中的毒品殘留進行提取和檢測的方法，操作簡單，能有效檢測出藥物濫用人群毛發中的氯胺酮及苯丙胺類物質等成分和含量，為臨床診斷提高科學依據。與傳統的檢測方法相比，本發明的方法通過用復合毛發處理液對毛發進行預處理和固相萃取，反應條件非常溫和，且有效地去除了毛發檢材中的多種雜質干擾物，高效分離提取了毛發中的目標物。另外，再進一步通過衍生步驟，更能有效富集到目標物，提高了檢測靈敏度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1是在陰性毛發基質中添加氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類標準物質，按照實施例3中所述方法進行提取凈化、氣相色譜質譜聯用儀分析所得的總離子流出色譜圖，圖中標記分別為(A)苯丙胺及其內標，(B)甲基苯丙胺及其內標，(C)甲卡西酮及其內標，(D)MDA及其內標，(E)MDMA及其內標，(F)MDEA及其內標，(G)去甲氯胺酮及其內標，(H) 4-甲基甲卡西酮及其內標，(I)氯胺酮及其內標。
【具體實施方式】
[0034]實施例1
[0035]本實施例是陰性毛發中添加氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質(苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDEA、MDA、甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮)，經復合溶液預處理、固相萃取、衍生后進行GC/MS-SIM分析。在同一天每個濃度配制6個樣本，測得各成分與內標峰面積的比值，計算回收率及CV值，確定方法回收率、日內檢測的精密度；連續5天，分別配制這兩個濃度標準添加樣本，測得各成分與內標峰面積的比值，計算CV值，確定方法的日間檢測精密度和準確度。
[0036]一、實驗步驟:
[0037](1)分別稱取約30mg的陰性毛發，用3mL洗潔精、水、丙酮清洗后，剪成1.0mm片段，液氮碾磨，得到研磨后的毛發粉末；
[0038](2)分別精確稱取20mg研磨后的陰性毛發粉末，加入氯胺酮和苯丙胺類標準物質，制得15000pg/mg、80000pg/mg兩個濃度水平的加標樣品，加入2mL的毛發復合處理液(具體成分為0.025mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，5%的牛血清蛋白，0.1%的吐溫20，且其PH值調節為2.0)，加入內標，在60°C下超聲4h，離心，獲得上清液；
[0039](3)依次用ImL甲醇、ImL水、ImL0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液平衡固相萃取柱，并注入上述毛發預處理上清液，用2mL水、Iml0.1M鹽酸溶液、3mL甲醇洗漆雜質,壓干5min,最后用乙酸乙酯:氨水(體積比90:10，總量為3mL)洗脫，得到洗脫液；
[0040](4)吹干洗脫液，將乙酸乙酯和七氟丁酸酐分別以40 μ L和10 μ L的體積比混合，在75°C的環境中衍生20min，冷卻，抽干，復溶于50 μ I的乙酸乙酯中，待氣相色譜質譜聯用儀分析；
[0041](5)進行氣相色譜質譜聯用儀分析，具體檢測條件如下:
[0042]①色譜柱:CD-5MS(30mX0.25mm X 0.25 μ m)色譜柱；
[0043]②進樣口溫度:230 °C ;
[0044]③載氣:氮氣，純度≥99.99%，流速為2.0mL/min ；
[0045]④采用不分流進樣；[0046]⑤采用程序升溫模式，其中柱溫變化設定為:
【權利要求】
1.一種毛發中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)清洗毛發，以液氮研磨，得到毛發粉末； (2)加入復合毛發處理液并進行超聲處理，離心得到預處理上清液；所述復合毛發處理液是0.02-0.5mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，含0.5%-10%的牛血清蛋白、0.1%_5%的吐溫20，且pH 值為 2.0-5.0 ； (3)固相萃取柱經平衡后，注入所述毛發預處理上清液，依次用水、0.05-0.15M鹽酸溶液和甲醇洗滌雜質；用體積比為90:10-98:2的乙酸乙酯:氨水混合溶液洗脫氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺類物質，得到萃取洗脫液。
2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于， 所述復合毛發處理液是0.025-0.3mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，含0.5%_5%的牛血清蛋白、0.1%-3%的吐溫20，且pH值為2.0-4.0。
3.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于， 步驟(2)所述的超聲處理為在37-85°C環境中進行1.5-12小時。
4.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于， 步驟(2)固相萃取柱依次經甲醇、水和磷酸鹽緩沖液進行平衡。
5.根據權利要求1-4任一項所述的提取方法，其特征在于，所述方法還包括有衍生步驟:將所述毛發的固相萃取洗脫液吹干，并用體積比4:1-1:4的乙酸乙酯:七氟丁酸酐混合溶液進行衍生，再復溶于乙酸乙酯，得到衍生產物。
6.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述衍生條件為:55-75°C反應20min—60mino
7.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述衍生步驟為: 將所述毛發的固相萃取洗脫液吹干，并用體積比4:1-:1:4的乙酸乙酯:七氟丁酸酐混合溶液，60-70°C反應20min-30min，再復溶于乙酸乙酯，得到衍生產物。
8.—種對毛發中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺類物質的檢測方法， 其特征在于，包括以下步驟: 1)根據權利要求1-4任一項所述提取方法得到所述萃取洗脫液或根據權利要求5-7任一項所述提取方法得到衍生產物； 2)采用氣相色譜質譜聯用儀或液相色譜質譜聯用儀對所述萃取洗脫液或衍生產物進行檢測。
9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述氣相色譜質譜聯用儀檢測方法的操作條件如下: 進樣口溫度:150-280°C ； 采用程序升溫模式，其中柱溫變化設定為:60°C (I分鐘)25ciiiM 80 (2分鐘)^^2000C (I 分鐘)J^24(TC (2分鐘)。
10.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述液相色譜質譜聯用儀檢測方法的操作條件如下: ①色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C182.1 X 150mm, 3.5 μ m，接 ZORBAX EclipseXDB-C182.1 X 12.5mm 保護柱；； ②柱溫:室溫； ③流動相:乙腈:乙酸銨緩沖溶液=70:30(V:V)； ④流速:250μL/min ； ⑤進樣量=IOyL； ⑥質譜條件:電噴霧電離離子源，正離子檢測模式；碰撞氣=Medium;氣簾氣:25 ;離子噴霧電壓:5500V ;霧化氣溫度 :5000C ；GS1:70 ；GS2:60。
【文檔編號】G01N30/06GK103575831SQ201310439888
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】陳園園, 劉曉云, 王繼華 申請人:廣州正孚檢測技術有限公司