基于白光led的三色熒光檢測儀的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于白光LED的三色熒光檢測儀，采用白光LED作為激發光源，經光束雜散光濾除及整形組準直得到光亮度均勻的圓形平行光束，通過第一濾色鏡組、分色濾色鏡組、聚焦透鏡組和第二濾色鏡組所組成的分光光路，實現窄帶激發光照射檢測樣本，光電倍增管探測面接受濾除雜光后的窄帶熒光信號。本熒光檢測裝置以光二極管采樣光源光強為檢測樣本信號參比，可以同時檢測FITC，Cy3+，Cy5+三種熒光染料的熒光檢測裝置，整個裝置結構緊湊，具有體積小、功耗低、靈敏度高和便攜化的特點，實現對檢測樣本熒光強度的半定量分析，檢測靈敏度可以達到2.5pg/ml熒光素鈉標準。
【專利說明】基于白光LED的三色熒光檢測儀
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種應用于生物醫療領域的熒光檢測儀。
[0003]
【背景技術】
[0004]熒光檢測主要用于生化分析，尤其分子生物學的熒光信號檢測。當某些物質被可見光或者紫外光照射而激發時，會產生比激發光波長較長的發射光，通過測量熒光強度以及光譜范圍可以定性和定量分析某種物質中的成分。
[0005]1852年，Stokes闡明了熒光發射機制:特定波長的光子碰撞到分子上，分子吸收光子，能量升高但不穩定，一般要通過釋放吸收的能量回到基態，當激發態分子以光子形式向周圍輻射能量而回到基態時，其所發出的光就稱為熒光。
[0006]熒光產生的條件是分子必須在吸收一定頻率范圍的激發光后，通過振動馳豫回到第一激發態的最低能級，由此向下的輻射躍遷才可能產生熒光。因此，產生熒光的首要條件就是激發光的頻率必須與分子的特征頻率相一致，其次就是該分子必須具有一定程度的熒光效率。
[0007]熒光效率，也稱熒光量子產率，它表示物質發射`熒光的本領，在相同強度的激發光下，熒光分子的量子效率越高，發射的熒光也就越強。其定義為物質吸光后發射的熒光光子數與吸收的激發光的光子數之比，即:
發射的光子數 吸收的光子數
熒光物質所發射的熒光強度與很多因素有關，包括環境因素(如溫度、PH值、離子強度、與其它分子的共價耦合等)，特別是下面幾個因素:
I)激發光的強度。一般情況下，激發光的強度越大，熒光的強度也越大，兩者在一定范圍內是線性關系。但在高強度激發光較長時間的照射下，會引起熒光物質發生一定程度的光漂白(Photo bleaching)現象或光損傷現象(Photo destruction),反而降低了突光的強度。
[0008]2)量子效率。在相同強度的激發光下,突光分子的量子效率越聞,發射的突光也就越強。
[0009]3)吸光系數。在相同強度的激發光下，熒光物質的吸光系數越大，發射的熒光越強。
[0010]4)熒光物質的染色濃度。當熒光物質的染色濃度較低時，熒光強度與染色濃度基本上是線性關系，當染色濃度較高時，突光物質會出現粹滅(Quenching)現象,反而降低了熒光的強度。
[0011]
【發明內容】
[0012]技術問題:本發明提供一種應用于生物分析的、結構緊湊、體積小、功耗低、靈敏度高和可便攜化基于白光LED的三色熒光檢測儀，，可在實驗室環境或現場檢測下，實現對檢測樣本熒光強度的半定量分析。
[0013]技術方案:本發明的一種基于白光LED的三色突光檢測儀,包括沿入射光路依次設置的白光LED光源組、光束雜散光濾除及整形組、第一濾色鏡組、分色鏡組、聚焦透鏡組、位于反射光路上的第二濾色鏡組和光電倍增管組件，白光LED光源組和光束雜散光濾除及整形組置于遮光蓋中，白光LED光源組、光束雜散光濾除及整形組、第一濾色鏡組的光軸和分色鏡組入射光軸重合，聚焦透鏡組位于分色鏡組一側的出射光路上，第二濾色鏡組和光電倍增管組件依次設置在分色鏡組另一側的出射光路上，聚焦透鏡組和第二濾色鏡組的光軸、光電倍增管組件的入射窗口中心均與分色鏡組的發射光軸重合。
[0014]本發明中，白光LED光源組包括半球形白光LED、準直平凸透鏡、45°反射型分光鏡、聚焦透鏡和光電二極管，準直平凸透鏡設置在半球形白光LED的發射光出射方向，45°反射型分光鏡的入射光軸與準直平凸透鏡的光軸重合，聚焦透鏡和光電二極管依次設置在45°分光鏡反射方向下方，并且聚焦透鏡和光電二極管的光軸均與45°反射型分光鏡的反射光軸重合。
[0015]本發明中，光束雜散光濾除及整形組包括數值孔徑為0.4^0.5、共光軸的第一凸透鏡和第二凸透鏡、位 于第一凸透鏡和第二凸透鏡之間的小孔光闌，第一凸透鏡和第二凸透鏡的數值孔徑相同且焦點重合，小孔光闌設置在第一凸透鏡和第二凸透鏡的光軸上，且小孔光闌的中心與第一凸透鏡和第二凸透鏡的焦點重合。
[0016]本發明中，第一濾色鏡組包括支架、設置在支架上的第一濾色鏡盤、第一步進電機和第一光電開關，第一濾色鏡盤上距中心等距設置三片第一濾色鏡，三片第一濾色鏡分別對467~498nm，513~556nm，604~644nm波段的激發光濾除雜光，第一步進電機與第一濾色鏡盤連接并用于驅動其轉動，實現對不同波段第一濾色鏡的選擇，第一光電開關用于識別第一濾色鏡盤的位置。
[0017]本發明中，分色鏡組包括支架、設置在支架上的三孔分色鏡盤、第二步進電機和第二光電開關，三孔分色鏡盤上距中心等距設置三片分色鏡，三片分色鏡的透射光波截止波長分別為506nm，562nm，660nm，第二步進電機與三孔分色鏡盤連接并用于驅動其轉動，實現對不同分色鏡的選擇，第二光電開關用于識別三孔分色鏡盤的位置。
[0018]本發明中，聚焦透鏡組包括與入射光成45°設置的反光鏡、位于反光鏡下方焦距為l(T50mm的第三凸透鏡和控制第三凸透鏡上下位移的步進電機，第三凸透鏡的光軸與反光鏡的反射光方向重合，第三凸透鏡在步進電機的控制下能夠沿光軸方向移動，實現對焦。
[0019]本發明中，第二濾色鏡組包括支架、設置在支架上的第二濾色鏡盤、第三步進電機和第三光電開關，第二濾色鏡盤上距中心等距設置三片第二濾色鏡，三片第二濾色鏡分別對513~556nm，57(T613nm，672~712nm波段的發射光濾除雜光，第三步進電機與第二濾色鏡盤連接并用于驅動其轉動，實現對不同波段第二濾色鏡的選擇，第三光電開關用于識別第二濾色鏡盤的位置。
[0020]本發明熒光檢測儀的一個具體實施例中，激發光源采用恒流電路供電，用96孔板作為熒光檢測樣本的載體，光電倍增管采集生物樣本被激發產生的熒光信號轉化為電壓信號，同時光電二極管實時采集半球形白光LED光強信號轉化為電壓信號，上述電壓信號經低通濾波器后作為差分放大器的輸入，經差分放大器處理輸出的信號輸入模數轉換器，微處理單元對轉換后的數字信號進行一定濾波算法處理，得到用于實驗分析的原始數據。根據檢測信號判定方法進一步分析，以數據或圖表的形式顯示檢測結果，完成對生物樣品的檢測。
[0021]有益效果:本發明與現有技術相比，具有以下優點:
1、本熒光檢測儀采用LED作為激發光源，恒流源電路供電，確保激發光源實時光強的穩定，光強波動范圍在0.5%以下。對比采用激光器或鹵鎢燈作為光源，LED具有體積小、功耗低、發光效率高、壽命長的優點，減小了光源產生的熱量和配套裝置的體積，從而設計出結構緊湊的光路，為整個的系統的微型化和便攜化打下基礎。相比較光源采樣反饋電路的延遲效應，恒流源硬件電路自主反饋調節，其輸出電流恒定，保證激發光源實時光強的穩定。
[0022]2、由于LED的光衰和上述光強波動，光電倍增管采集的樣本熒光信號值也會隨之波動，造成實驗結果缺乏可行度和可比性。本熒光檢測儀采用高靈敏度光電二極管對光源采樣，其輸出電壓信號作為光電倍增管的輸出電壓信號的參比，通過后續硬件路和算法的處理，排除光強波動對檢測結果的影響，確保實驗樣本的檢測結果具有可量化和可比性。
[0023]3、本熒光檢測儀采用步進電機控制第三凸透鏡沿光軸方向移動，實現對樣本進行自動聚焦，檢測時采用軟件算法控制電機運行進行自動聚焦，確保檢測儀對于不同體積量的樣本具有通用性。
[0024]4、本熒光檢測儀采用96孔板作為檢測樣本的載體，可實現一次性對96孔樣本掃描檢測，確保其具有高通量的特點。
[0025]5、本熒光檢測儀采用結構緊湊的光路和機械設計，整個裝置長寬高分別為30cm、30cm、15cm，重量為4kg，克服了現有熒光檢測類儀器大型笨重的特點，實現了整個儀器的微型化和便攜化，不但適用于實驗室的環境下檢測，而且可用于現場檢測。用于生物醫學工程領域，具有高靈敏度、低成本的特點，推動了其微型化和便攜化的發展，填補了生物醫藥相關領域的空白。
[0026]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為本發明白光LED的三色熒光檢測儀俯視結構示意圖。
[0028]圖2為白光LED光源組的側視結構示意圖。
[0029]圖3為光束雜散光濾除及整形組的側視結構示意圖。
[0030]圖4為第一濾色鏡組的結構示意圖。
[0031]圖5為分色鏡組的結構示意圖。
[0032]圖6為聚焦透鏡組側視結構示意圖。
[0033]圖7為第二濾色鏡組示意圖。
[0034]圖8為本發明裝置的光源采樣和電源電路示意圖
圖中有:白光LED光源組1、光束雜散光濾除及整形組2、第一濾色鏡組3、分色鏡組4、聚焦透鏡組5、第二濾色鏡組6、光電倍增管組件7、底板8、遮光蓋9、上蓋板10、半球形白光LED11、準直平凸透鏡12、45°反射型分光鏡13、光電二極管14、聚焦透鏡15、第一凸透鏡21、第二凸透鏡22、小孔光闌23、第一濾色鏡盤31、步進電機32、光電開關33、第一濾色鏡34、支架35，分色鏡盤41、第二步進電機42、第二光電開關43、分色鏡44、反光鏡51、第三凸透鏡52、步進電機53、第二濾色鏡盤61、第三步進電機62、第三光電開關63、第二濾色鏡64。
[0035]
【具體實施方式】
[0036]下面結合說明書附圖和實施例對本發明做進一步具體說明。
[0037]參閱圖1，本發明的基于白光LED的三色熒光檢測儀，包括沿入射光路依次設置的白光LED光源組1、光束雜散光濾除及整形組2、第一濾色鏡組3、分色鏡組4、聚焦透鏡組5、位于反射光路上的第二濾色鏡組6和光電倍增管組件7，，還包括底板8、遮光蓋9和上蓋板10。白光LED光源組I和光束雜散光濾除及整形組2置于遮光蓋9中，白光LED光源組1、光束雜散光濾除及整形組2、第一濾色鏡組3的光軸和分色鏡組4入射光軸重合，聚焦透鏡組5位于分色鏡組一側的出射光路上，第二濾色鏡組6和光電倍增管組7件依次設置在分色鏡組4另一側的出射光路上，聚焦透鏡組5和第二濾色鏡組6的光軸、光電倍增管組件7的入射窗口中心均與分色鏡組4的發射光軸重合。
[0038]本發明的基于白光LED的三色熒光檢測儀中，由白光LED光源組I發射出準直的白光，白光光束經光束雜散光濾除及整形組2后，得到光亮度均勻的圓形平行光束；該光束經過第一濾色鏡組3濾波后，透過相應波段的激發光；分色濾色鏡組4鏡面與入射光呈45°角放置，對入射角度為45°的激發光高反，熒光高透；上述激發光投射到分色濾色鏡組4后，被反射到聚焦透鏡組5，由聚焦透鏡組5聚焦到待檢測的含有熒光染料標記的生物樣品池；樣品受激發光照射后產生的熒光，經過聚焦透鏡組5原路返回至分色鏡組4處，熒光透過分色鏡組4，混雜的激發光被反射至光源方向；透過的熒光經第二濾色鏡組6，進一步對雜光進行濾除，得到有效的窄帶熒光信號；該熒光信號照射到光電倍增管組件7的探測面上，由光電倍增管將熒光信號轉換成電壓信號。同時光電二極管14采集半球形白光LED 11被45°反射型分光鏡13反射的光強，轉化為電壓信號。上述電壓信號經低通濾波器后作為差分放大器的輸入，經差分放大器處理輸出的信號輸入模數轉換器，微處理單元對轉換后的數字信號進行一定濾波算法處理，得到用于實驗分析的原始數據。根據檢測信號判定方法進一步分析，以數據或圖表的形式顯示檢測結果，完成對生物樣品的檢測。【具體實施方式】如下:
第一步，將白光LED光源組1、光束雜散光濾除及整形組2、第一濾色鏡組3、分色鏡組
4、聚焦透鏡組5、第二濾色鏡組6、光電倍增管組件7均固定在底板8上，保證白光LED光源組I的光軸、光束雜散光濾除及整形組2的光軸、第一濾色鏡組3光軸和分色鏡組4入射光軸重合，保證聚焦透鏡組5的光軸、分色鏡組4反射光軸、第二濾色鏡組6光軸和光電倍增管組件7光軸重合。
[0039]第二步，白光LED光源組I發射準直的白光，白光經過光束雜散光濾除及整形組2后，得到光強分布均勻的圓形光束，遮光蓋9與底板8配合，將白光LED光源組I和雜散光濾除及整形組2罩住，圓形光束由遮光蓋9的圓孔射出。
[0040]第三步，出射光束經過第一濾色鏡組3后，經過濾波得到相應波段的激發光，投射到分色鏡組4后，分色鏡組4中三片分色鏡44的鏡面與入射光呈45°角放置，三片分色鏡44的透射光波截止波長分別為506nm, 562nm, 660nm,小于該截止波長的就全反射,等于大于截止波長的就透射。分色鏡組4對入射角度為45°的激發光高反，熒光高透，激發光透射到聚焦透鏡組5，由聚焦透鏡組5將激發光聚焦到待檢測的含有熒光染料標記的生物樣本表面。
[0041]第四步，樣本受激發光照射后，產生熒光，再經過聚焦透鏡組5原路返回至分色鏡組4處，初步濾除激發光，熒光透過分色鏡組4，再經第二濾色鏡組6，進一步對熒光中雜光濾除，得到有效的熒光信號，有效的熒光信號照射到光電倍增管組7的探測面上。
[0042]第五步，計算機軟件通過串口通信的方式發送指令至微控制器，一方面經硬件電路控制第一濾色鏡組3、第二濾色鏡組6和分色鏡組4的步進電機轉動選擇實驗所需的鏡片組合；另一方經硬件電路控制白光LED光源組1、光電倍增管組7的開啟，白光LED光源組I光強，可編程放大器的放大倍數以及生物樣本的讀取次數等實驗參數。根據實驗的實際需要，控制電機轉動和配置相關參數，實現對特定生物樣本，特定檢測條件的熒光檢測。
[0043]第六步，由恒流源電路為白光LED光源組I提供電源，保證激發光源實時光強的穩定。光電倍增管采集生物樣本被激發產生的熒光信號轉化為電壓信號，同時光電二極管實時采集半球形白光LED光強信號轉化為電壓信號，上述電壓信號經低通濾波器后作為差分放大器的輸入，經差分放大器處理輸出的信號輸入模數轉換器，微處理單元對轉換后的數字信號進行一定濾波算法處理，得到用于實驗分析的原始數據。根據檢測信號判定方法進一步分析，以數據或圖表的形式顯示檢測結果，完成對生物樣品的檢測。
[0044]下面通過具體實施例進一步介紹本發明裝置:
白光LED光源組I中的LED為半球形白光LED，發光功率為3W，其準直透鏡的焦距為12.7mm，直徑為12.7mm,反射鏡的反射率為4%，光電二極管的光敏面積為3.6mmX 3.6mm ；光束雜散光濾除及整形組2中的兩個凸透鏡的焦距均為為20mm，直徑為12.7mm，小孔光闌的小孔直徑為Imm;第一濾色鏡組3的三個濾波片直徑均為12mm，濾波范圍分別為467?498nm，513?556nm，604?644nm ;分射鏡組4的三個分色片直徑均為15臟，分光截止光波長分別為506nm, 562nm, 660nm ;第二濾色鏡組6的三個濾波片直徑均為12mm,濾波范圍分別為513?556nm，57(T613nm，672?712nm ;聚焦透鏡組5的反射鏡直徑為14mm的金屬銀反射鏡，聚焦透鏡的直徑為12.7mm，焦距為12.7mm ;光電倍增管組7中的PMT型號為CR194。參照上述實施方式，檢測靈敏度可以達到2.5pg/ml熒光素鈉(標準)。
【權利要求】
1.一種基于白光LED的三色熒光檢測儀，其特征在于，該檢測儀包括沿入射光路依次設置的白光LED光源組(I)、光束雜散光濾除及整形組(2)、第一濾色鏡組(3)、分色鏡組(4)、聚焦透鏡組(5)、位于反射光路上的第二濾色鏡組(6)和光電倍增管組件(7)，所述白光LED光源組(I)和光束雜散光濾除及整形組(2)置于遮光蓋(9)中，白光LED光源組(I)、光束雜散光濾除及整形組(2)、第一濾色鏡組(3)的光軸和分色鏡組(4)入射光軸重合，所述聚焦透鏡組(5)位于分色鏡組(4) 一側的出射光路上，第二濾色鏡組(6)和光電倍增管組件(7)依次設置在分色鏡組(4)另一側的出射光路上，聚焦透鏡組(5)和第二濾色鏡組(6)的光軸、光電倍增管組件(7)的入射窗口中心均與分色鏡組(4)的發射光軸重合。
2.根據權利要求1所述的基于白光LED的三色熒光檢測儀，其特征在于，所述白光LED光源組(I)包括半球形白光LED (11)、準直平凸透鏡(12)、45°反射型分光鏡(13)、光電二極管(14)和聚焦透鏡(15)，所述準直平凸透鏡(12)設置在半球形白光LED (11)的發射光出射方向，45°反射型分光鏡(13)的入射光軸與準直平凸透鏡(12)的光軸重合，聚焦透鏡(15)和光電二極管(14)依次設置在45°分光鏡(13)反射方向下方,并且聚焦透鏡(15)和光電二極管(14)的光軸均與45°反射型分光鏡(13)的反射光軸重合。
3.根據權利要求1所述的基于白光LED的三色熒光檢測儀，其特征在于，所述光束雜散光濾除及整形組(2)包括數值孔徑為0.4^0.5、共光軸的第一凸透鏡(21)和第二凸透鏡(22)、位于所述第一凸透鏡(21)和第二凸透鏡(22)之間的小孔光闌(23)，所述第一凸透鏡(21)和第二凸透鏡(22)的數值孔徑相同且焦點重合，小孔光闌(23)設置在第一凸透鏡(21)和第二凸透鏡(22)的光軸上，且小孔光闌(23)的中心與第一凸透鏡(21)和第二凸透鏡(22)的焦點重合。
4.根據權利要求1、2或3所述的基于白光LED的三色熒光檢測儀，其特征在于，所述第一濾色鏡組(3)包括支架、設置在所述支架上的第一濾色鏡盤(31)、第一步進電機(32)和第一光電開關(33)，所述第一濾色鏡盤(31)上距中心等距設置三片第一濾色鏡(34)，所述三片第一濾色鏡(34)分別對467~498nm，513~556nm，604~644nm波段的激發光濾除雜光，所述第一步進電機(32)與第一濾色鏡盤(31)連接并用于驅動其轉動，實現對不同波段第一濾色鏡(34)的選擇，所述第一光電開關(33)用于識別第一濾色鏡盤(31)的位置。
5.根據權利要求1、2或3所述的基于白光LED的三色熒光檢測儀，其特征在于，所述分色鏡組(4)包括支架、設置在所述支架上的三孔分色鏡盤(41)、第二步進電機(42)和第二光電開關(43)，所述三孔分色鏡盤(41)上距中心等距設置三片分色鏡(44)，所述三片分色鏡(44 )的透射光波截止波長分別為506nm，562nm, 660nm,所述第二步進電機(32 )與三孔分色鏡盤(41)連接并用于驅動其轉動，實現對不同分色鏡(44)的選擇，所述第二光電開關(33)用于識別三孔分色鏡盤(41)的位置。
6.根據權利要求1、2或3所述的基于白光LED的三色熒光檢測儀，其特征在于，所述聚焦透鏡組(5)包括與入射光成45°設置的反光鏡(51)、位于反光鏡(51)下方焦距為l(T50mm的第三凸透鏡(52)和控制第三凸透鏡上下位移的步進電機(53)，所述第三凸透鏡(52)的光軸與反光鏡(51)的反射光方向重合，第三凸透鏡(52)在步進電機(53)的控制下能夠沿光軸方向移動，實現對焦。
7.根據權利要求1、2或3所述的基于白光LED的三色熒光檢測儀，其特征在于，所述第二濾色鏡組(6)包括支架、設置在所述支架上的第二濾色鏡盤(61)、第三步進電機(62)和第三光電開關(63)，所述第二濾色鏡盤(61)上距中心等距設置三片第二濾色鏡(64)，所述三片第二濾色鏡(64)分別對513~556nm，57(T613nm，672~712nm波段的發射光濾除雜光，所述第三步進電機(62)與第二濾色鏡盤(61)連接并用于驅動其轉動，實現對不同波段第二濾色鏡(64)的選擇， 所述第三光電開關(63)用于識別第二濾色鏡盤(61)的位置。
【文檔編號】G01N21/64GK103487375SQ201310436904
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】何農躍, 夏云, 王煒, 李智洋, 馬嫚, 谷鵬陽 申請人:東南大學