胸腺嘧啶核苷激酶的elisa診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA診斷試劑盒，試劑盒內設有樣品檢測液、陰性對照和陽性對照；所述樣品檢測液為特異性抗原多肽。本發明公開了乳腺癌診斷分子特異性抗原多肽的制備方法，通過乳腺癌診斷新穎分子胸腺嘧啶核苷激酶TK1(1-205)特異性抗原多肽，含該多肽的融合蛋白，其編碼DNA，攜帶該DNA的重組載體，含該重組載體的轉化子，產生抗體的方法，檢測或測定抗體的方法和試劑，診斷乳腺癌的方法和試劑。本發明可用于重組抗原的表達、醫乳腺癌以及其它一些惡性腫瘤診斷，特別是體外乳腺癌早期診斷試劑的開發。
【專利說明】胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA診斷試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學領域，具體為胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA診斷試劑盒及相關特異性抗原多肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]胸腺嘧啶核苷激酶(Thymidine kinase, TK)于1960年前后被發現，參與胸腺嘧啶核苷(簡稱為胸苷)合成代謝，是一種DNA合成的關鍵酶。隨后的研究發現，TK擁有兩種同工酶，其一為細胞質TK(cytosolic TKl)和線粒體TK(mitochondrial TK2)。而其中TKl與細胞分裂密切相關，在細胞分裂Gl期含量比較低，而到S期后逐漸升高，至G2期達到最高。因此編碼TKl的mRNA及其表達的蛋白質也就成為細胞增生的標志物。
[0003]1990年，JF Robertson等人通過比較早期乳腺癌患者，正常以及炎癥對照組等的血清TKl蛋白表達量發現TKl在早期乳腺癌患者的血清含量顯著提高，而炎癥與正常對照組沒有明顯差異。血清TKl含量的多寡被認為能夠反應乳腺癌病理進程(stage of diseasein breast cancer),因而他提出TKl可以做為一個乳腺癌早期診斷依據。同時1993年WGCance, RJ Craven等人發現，TKl在一些乳腺癌細胞系，如BT20，SK-BR-3, MCF7細胞中過量表達。隨后亦有多篇文獻研究發現TKl激酶在腫瘤，特別是乳腺腫瘤患者的血清中表達升高，并認可TKl是一個潛在的乳腺癌診斷分子。如2005年Q HE等人發現血清TKl含量可以做為早期乳腺癌患者手術后，腫瘤復發幾率的參考指標。
[0004]乳腺癌患者中血清中，胸腺嘧啶核苷激酶蛋白量及酶活性顯著增強，并隨著腫瘤惡化程度提高而進一步升高。因此胸腺激酶被認為是一新型的腫瘤診斷標志物(PotentialCancer Marker)，分析其蛋白以及活性的數據變化能夠為乳腺癌早期診斷提供有力依據。
[0005]I)正常人血清樣本中檢出TKl表達異常，提示存在乳腺癌潛在性；
[0006]2)良性乳腺腫瘤患者若檢出TKl表達異常，提示有惡變的可能；
[0007]3)乳腺癌腫瘤TKl表達高低，能夠顯示出其惡化程度。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA診斷試劑盒及相關特異性抗原多肽的制備方法，該診斷試劑盒可用于重組抗原的表達、醫學臨床乳腺癌患者的診斷，特別是體外乳腺癌診斷分子診斷試劑的開發。
[0009]為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
[0010]胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA診斷試劑盒，試劑盒內設有樣品檢測液、陰性對照和陽性對照；所述樣品檢測液為特異性抗原多肽。
[0011]進一步，所述特異性抗原多肽的制備方法，包括以下步驟:
[0012](I)抗原片段的獲得:利用生物信息學方法，在開始的生物信息資源數據庫上收集胸腺嘧啶核苷激酶家族同源蛋白質序列,運用多序列比對程序clustalw進行多序列比對分析，胸腺嘧啶核苷激酶多種同源蛋白，尋找胸腺嘧啶核苷激酶最特異性的片段，隨后進行抗原表位分析，尋找到了優勢特異性TKl的蛋白表達區段Metl-Gln205，并進一步做原核載體的構建與表達純化；
[0013](2)抗原蛋白的獲得:從TKl編碼基因調取相對應的基因核酸片段，總長度為702bp，并利用其進行亞克隆構建到原核表達重組質粒pGEX-4T-2中，通過調整誘導表達條件，誘導表達后可以收集菌體，并通過蛋白質純化，得到高純度的重組蛋白質，此蛋白質為N端谷胱轉移酶融合蛋白，其重組蛋白通過SDS-PAGE鑒定純度；
[0014](3)特異性抗體制備:將原核表達純化得到的純度在95%以上的重組蛋白除去內毒素，再進行動物免疫，通過三次腹腔注射重組蛋白使小鼠對其產生免疫反應，取小鼠腹水純化得到抗血清，經過進一步的純化與分離得到多克隆抗體，將TKl (1-205)特異性抗原免疫小鼠后，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經多次篩選獲得陽性的單克隆細胞株，并進行腹水生產和單克隆抗體制備；
[0015](4)效價和特異性的評價:采用ELISA技術和Western blot技術對制備的單克隆抗體和多克隆抗體進行效價以及特異性的評價；
[0016](5)包裝:運用TKl的ELISA試劑盒將獲得的特異性抗原多肽按照標準包裝形式統一規。
[0017]綜上所述，本發明有益效果:
[0018]本發明可用于重組抗原的表達、醫乳腺癌以及其它一些惡性腫瘤診斷，特別是體外乳腺癌早期診斷試劑的開發，它不與乳腺癌診斷之外的其它腫瘤反應，使用更方便，成本更低。
【具體實施方式】
[0019]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0020]實施例1
[0021]胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA診斷試劑盒，試劑盒內設有樣品檢測液、陰性對照和陽性對照；所述樣品檢測液為特異性抗原多肽。
[0022]進一步，所述特異性抗原多肽的制備方法，包括以下步驟:
[0023](I)抗原片段的獲得:利用生物信息學方法，在開始的生物信息資源數據庫上收集胸腺嘧啶核苷激酶家族同源蛋白質序列,運用多序列比對程序clustalw進行多序列比對分析，胸腺嘧啶核苷激酶多種同源蛋白，尋找胸腺嘧啶核苷激酶最特異性的片段，隨后進行抗原表位分析，尋找到了優勢特異性TKl的蛋白表達區段Metl-Gln205，并進一步做原核載體的構建與表達純化；
[0024](2)抗原蛋白的獲得:從TKl編碼基因調取相對應的基因核酸片段，總長度為702bp，并利用其進行亞克隆構建到原核表達重組質粒pGEX-4T-2中，通過調整誘導表達條件，確定蛋白質表達的最佳條件為:37度ImM IPTG誘導表達4小時之后可以收集菌體，并通過蛋白質純化，得到高純度的重組蛋白質，此蛋白質為N端谷胱轉移酶融合蛋白，其重組蛋白通過SDS-PAGE鑒定純度；[0025](3)特異性抗體制備:將原核表達純化得到的純度在95%以上的重組蛋白除去內毒素，再進行動物免疫，通過三次腹腔注射重組蛋白使小鼠對其產生免疫反應，取小鼠腹水純化得到抗血清，經過進一步的純化與分離得到多克隆抗體，將TKl (1-205)特異性抗原免疫小鼠后，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經多次篩選獲得陽性的單克隆細胞株，并進行腹水生產和單克隆抗體制備；
[0026](4)效價和特異性的評價:采用ELISA技術和Western blot技術對制備的單克隆抗體和多克隆抗體進行效價以及特異性的評價；
[0027](5)包裝:運用TKl的ELISA試劑盒將獲得的特異性抗原多肽按照760g標準包裝形式，48T / 96T統一規格。
[0028]對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。
[0029]此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。
【權利要求】
1.胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA診斷試劑盒，其特征是，試劑盒內設有樣品檢測液、陰性對照和陽性對照；所述樣品檢測液為特異性抗原多肽。
2.根據權利要求1所述的胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA診斷試劑盒，其特征是，所述用于樣品檢測的特異性抗原多肽的制備方法，包括以下步驟: (1)抗原片段的獲得:利用生物信息學方法，在開始的生物信息資源數據庫上收集胸腺嘧啶核苷激酶家族同源蛋白質序列，運用多序列比對程序clustalw進行多序列比對分析，胸腺嘧啶核苷激酶多種同源蛋白，尋找胸腺嘧啶核苷激酶最特異性的片段，隨后進行抗原表位分析，尋找到了優勢特異性TKl的蛋白表達區段Metl-Gln205，并進一步做原核載體的構建與表達純化； (2)抗原蛋白的獲得=WTKl編碼基因調取相對應的基因核酸片段，總長度為702bp，并利用其進行亞克隆構建到原核表達重組質粒pGEX-4T-2a或其它原核表達載體中，通過調整誘導表達條件，誘導表達后可以收集菌體，并通過蛋白質純化，得到高純度的重組蛋白質，此蛋白質為N端谷胱轉移酶融合蛋白，其重組蛋白通過SDS-PAGE鑒定純度； (3)特異性抗體制備:將原核表達純化得到的純度在95%以上的重組蛋白除去內毒素，再進行動物免疫，通過三次腹腔注射重組蛋白使小鼠對其產生免疫反應，取小鼠腹水純化得到抗血清，經過進一步的純化與分離得到多克隆抗體，將TKl (1-205)特異性抗原免疫小鼠后，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，經多次篩選獲得陽性的單克隆細胞株，并進行腹水生產和單克隆抗體制備； (4)效價和特異性的評價:采用ELISA技術和Westernblot技術對制備的單克隆抗體和多克隆抗體進行效價以及特異性的評價； (5)包裝:運用TKl的ELISA試劑盒將獲得的特異性抗原多肽按照標準包裝形式統一規格。
【文檔編號】G01N33/531GK103728456SQ201310436392
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】張萬明, 易銀沙, 曹蓬榮, 劉彩云, 袁炳秋, 吳小寧 申請人:湖南能潤醫學診斷技術股份有限公司