基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素a均相快速檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法，包括以下步驟：（1）赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的形成；（2）赭曲霉毒素A核酸適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別。本發明采用赭曲霉毒素A核酸適配體作為分子識別元件，核酸嵌合染料作為報告分子構建的OTA檢測方法，大大降低了檢測OTA真菌毒素的成本，重現性好，特異性高，操作簡單方便且可實現大量樣品的平行檢測；本發明基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法，在赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物預先形成后，僅需5-10min即可實現對OTA的檢測。
【專利說明】基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及利用核酸嵌合染料的熒光淬滅對赭曲霉毒素A進行檢測，特點在于赭曲霉毒素A核酸適配體和核酸嵌合染料的應用，以及該方法的檢測速度快、檢測通量高及操作性強，屬于屬于熒光檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]赭曲霉毒素A (OchratoxinA，0ΤΑ)主要由曲霉和靑霉等產生，在自然界中廣泛存在，其中以糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等)、花生、蔬菜(豆類)等農作物上居多，具有肝腎毒性以及很強的致畸、致癌和致突變作用等多中毒性，對動物和人體健康具有很大的潛在危害。鑒于此，世界各國均重視對OTA的檢測和控制，紛紛制定出了糧食和飼料中OTA相關限量標準，如歐盟規定谷物原料OTA最大限量5 μ g/kg，谷物加工制品最大限量3μ g/kg ;我國規定谷類、豆類中OTA最大限量5 μ g/kg，以保護人民健康和調控進出口糧食。
[0003]目前檢測OTA的主要方法是薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)等。TLC法簡單，檢測成本低，但是靈敏度較差、重現性不好且無法實現自動化；HPLC法靈敏度高，但所需儀器昂貴、前處理復雜、檢測成本高，不適合大量樣品的快速篩查。ELISA法靈敏度高、特異性好，但所依賴的高質量抗體的制備周期很長且存在交叉反應的問題。
[0004]核酸適配體作為一類單鏈寡核苷酸，與靶分子發生特異性相互作用前后空間構象會發生相應的變化，與抗體相比具有可體外篩選獲得、熱穩定性好、易于化學合成和修飾等優點，甚至能區分單抗無法實現的單個取代基差別的靶分子；核酸嵌合染料具有如下特點:游離狀態下無熒光或者具有很弱的熒光，嵌合到DNA雙鏈中發生熒光增強，因此基于核酸嵌合染料染料的均相熒光檢測方法具有靈敏度高、操作簡單且可進行大量樣品的平行檢測等特點。所以，將核酸適配體的高特異性、高親和力與核酸嵌合染料相結合的均相熒光檢測方法，能夠很好地克服目前OTA主要檢測方法的缺點，有望成為一種有潛力的快速篩查方法。
【發明內容】
[0005]為了解決目前OTA檢測方法的方案復雜、操作反鎖、成本過高、檢測時間過長的缺點，本發明提供了一種基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法。
[0006]本發明的技術方案是，基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法，包括以下步驟:
[0007](I)赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的形成；
[0008](2)赭曲霉毒素A核酸適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別。
[0009]本發明基于核酸嵌合染料熒光淬滅實現的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法的具體操作步驟如下:
[0010]赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的形成
[0011]首先將赭曲霉毒素A核酸適配體進行預處理:95°C變性5min，4°C冷卻5min。然后取50 μ LlOmM Tris-HCl反應緩沖液(ρΗ8.5)，其中赭曲霉毒素A核酸適配體的濃度為50ηΜ，GeneFinder核酸嵌合染料的稀釋比為8:10000，室溫反應30min，以使核酸嵌合染料與赭曲霉毒素A核酸適配體充分結合，形成赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物；赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，序列為5’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3，。
[0012]赭曲霉毒素A核酸適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別
[0013]往上述步驟(I)反應后的溶液中加入適量的赭曲霉毒素A溶液，用IOmM Tris-HCl反應緩沖液(PH8.5)調整溶液體積為100 μ L，其中赭曲霉毒素A核酸適配體的濃度為25nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀釋比為4:10000，室溫反應5_10min，以使赭曲霉毒素A核酸適配體與赭曲霉毒素A充分結合，形成赭曲霉毒素A核酸適配體與赭曲霉毒素A復合物，從而導致赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的解離，產生熒光強度的變化。將反應后的溶液轉移至微量熒光比色杯中放入熒光光譜儀，或者將反應后的溶液轉移微孔板中放入具有微孔板閱讀模塊的熒光光譜儀中，以490nm為激發波長、525nm為發射波長，測定其熒光信號強度并記錄熒光強度的變化:空白對照的熒光強度(Itl)最大，隨著OTA濃度的增加熒光強度(I)逐漸減弱。
[0014]按上述(I)、(2)步驟對配制的不同濃度赭曲霉毒素A標準液進行檢測，記錄各標準溶液樣品所產生的熒光強度的變化值(AI=Itl-1X用Λ I對標準溶液中赭曲霉毒素A濃度作圖獲得標準曲線，未知樣品中赭曲霉毒素A所產生的熒光強度的變化值與標注曲線對照確定其濃度。
[0015]綜上所述本發明的有益效果具體體現在以下方面:
[0016]I)本發明采用赭曲霉毒素A核酸適配體作為分子識別元件，核酸嵌合染料作為報告分子構建的OTA檢測方法，大大降低了檢測OTA真菌毒素的成本，重現性好，特異性高，操作簡單方便且可實現大量樣品的平行檢測；
[0017]2)本發明基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法，在赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物預先形成后，僅需5-10min即可實現對OTA的檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1:基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法的現象圖:其中(a)為 GeneFinder+Aptamer+AFBl, (b)為 GeneFinder+Aptamer,(c)為 GeneFinder+Aptamer+OTA, (d)為 GeneFinder, Ce)為 OTA aptamer。[OTAaptamer]=25nM, [0TA] = [AFBl]=50nM, Dilution ratio of GeneFinder=4:10000。AFBl 為
黃曲霉毒素BI。
[0019]圖2:對赫曲霉毒素A標準品溶液進彳丁檢測的工作曲線圖。
【具體實施方式】[0020]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0021](I)赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的形成
[0022]首先將赭曲霉毒素A核酸適配體進行預處理:95°C變性5min，4°C冷卻5min。然后取50 μ LlOmM Tris-HCl反應緩沖液(ρΗ8.5)，其中赭曲霉毒素A核酸適配體的濃度為50ηΜ，GeneFinder核酸嵌合染料的稀釋比為8:10000，室溫反應30min，以使核酸嵌合染料與赭曲霉毒素A核酸適配體充分結合，形成赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物；赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，序列為5’-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3，。
[0023]一種赭曲霉毒素A核酸適配體的篩選制備:將赭曲霉毒素A分子通過偶聯劑EDC和NHS偶聯于羧基修飾的磁珠上，與含有初始文庫的反應緩沖溶液反應將初始文庫固定到磁珠上。分別以羧基修飾的磁珠為反篩選靶標，以N-乙酰基-L-苯丙氨酸(N-acetyl-L-phenylalanine)、法華令(warfarin)和赭曲霉毒素B分子為負篩選革巴標，以赭曲霉毒素A為正篩選分子進行篩選。在赭曲霉毒素A存在的情況下,與其有結合能力的寡核苷酸序列從磁珠上解離下來，經PCR擴增后，采用鏈親和素磁珠分離法制備次級文庫，重復篩選15輪，然后進行克隆測序，最后進行序列分析、活性檢測以及序列截短與優化，從而獲得赭曲霉毒素A的特異性核酸適配體。
[0024](2)赭曲霉毒素A核酸適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別
[0025]往上述步驟(I)反應后的溶液中加入適量的赭曲霉毒素A溶液，用IOmM Tris-HCl反應緩沖液(PH8.5)調整溶液體積為100 μ L，其中其中赭曲霉毒素A核酸適配體的濃度為25nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀釋比為4:10000,室溫反應5_10min，以使赭曲霉毒素A核酸適配體與赭曲霉毒素A充分結合，形成赭曲霉毒素A核酸適配體與赭曲霉毒素A復合物，從而導致赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的解離，產生熒光強度的變化。將反應后的溶液轉移至微量熒光比色杯中放入熒光光譜儀，或者將反應后的溶液轉移微孔板中放入具有微孔板閱讀模塊的熒光光譜儀中，以490nm為激發波長、525nm為發射波長，激發狹縫寬度設定為10nm，發射狹縫寬度設定為5nm，測定其熒光信號強度并記錄熒光強度的變化:空白對照的熒光強度(Itl)最大，隨著OTA濃度的增加熒光強度(I)逐漸減弱。
[0026]如圖1所示,核酸嵌合染料(GeneFinder)自身突光很弱,可以忽略不計；OTA核酸適配體(aptamer)自身沒有突光；二者共同存在的情況下，形成aptamer/GeneFinder突光復合物，具有很強的熒光，熒光增強10多倍。在OTA存在的情況下，aptamer與OTA充分結合,形成aptamer/OTA復合物,從而導致aptamer/GeneFinder突光復合物的解離,產生突光淬滅，導致熒光強度降低；而在黃曲霉毒素BI (AFBI)存在的情況下，aptamer不識別AFB1，因此aptamer/GeneFinder突光復合物不會解離,所以不能產生突光淬滅,突光強度不會降低。
[0027]按上述(I)、(2)步驟對配制的不同濃度赭曲霉毒素A標準液(0ηΜ，1ηΜ，2.5ηΜ，
5.0nM, 7.5nM, IOnM, 15nM, 20nM, 25nM, 35nM, 50nM, 75nM)進行檢測，并記錄各標準溶液樣品所產生的熒光強度的變化值(AI=Itl-1X用Λ I對標準溶液中赭曲霉毒素A濃度作圖獲得工作曲線(圖2)，未知樣品中赭曲霉毒素A所產生的熒光強度的變化值與工作曲線對照確定其濃度。[0028]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
[0029]SEQUENCE LISTING
[0030]<110> 申請人:河南省農業科學院
[0031]〈120〉基于核酸嵌合染料熒光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法
[0032]〈130〉
[0033]〈160〉I
[0034]<170>PatentIn version3.5
[0035]〈210〉I
[0036]<211>33
[0037]<212>DNA
[0038]〈213〉赭曲霉毒素A核酸適配體
[0039]〈400〉I
[0040]cttcgggtgt gggtggcatt ccggtaggct ctg
[0041]33
【權利要求】
1.一種基于核酸嵌合染料突光淬滅的赭曲霉毒素A均相快速檢測方法,其 特征在于，包括以下步驟: (1)赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的形成； (2)赭曲霉毒素A核酸適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具體操作步驟如下: (1)赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的形成 首先將赭曲霉毒素A核酸適配體進行預處理:95°C變性5min，4°C冷卻5min。然后取50 μ LlOmM Tris-HCl反應緩沖溶液(ρΗ8.5)，其中赭曲霉毒素A核酸適配體的濃度為50ηΜ，GeneFinder核酸嵌合染料的稀釋比為8:10000，室溫反應30min，以使核酸嵌合染料與赭曲霉毒素A核酸適配體充分結合，形成赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物； (2)赭曲霉毒素A核酸適配體對赭曲霉毒素A的特異性識別 往上述步驟(1)反應后的溶液中加入適量的赭曲霉毒素A溶液,用1OmM Tris-HCl反應緩沖液(PH8.5)調整溶液體積為IOOyL,其中其中赭曲霉毒素A核酸適配體的濃度為25nM，GeneFinder核酸嵌合染料的稀釋比為4:10000，室溫反應5-10min，以使赭曲霉毒素A核酸適配體與赭曲霉毒素A充分結合，形成赭曲霉毒素A核酸適配體與赭曲霉毒素A復合物，從而導致赭曲霉毒素A核酸適配體與核酸嵌合染料熒光復合物的解離，產生熒光強度的變化。將反應后的溶液放入熒光光譜儀，以490nm為激發波長、525nm為發射波長，測定其熒光信號強度并記錄熒光強度的變化:空白對照的熒光強度(I0)最大，隨著OTA濃度的增加熒光強度(I)逐漸減弱。 按上述(1)、(2)步驟對配制的不同濃度赭曲霉毒素A標準液進行檢測，記錄各標準溶液樣品所產生的熒光強度的變化值(ΔI=I0-I);用△I對標準溶液中赭曲霉毒素A濃度作圖獲得標準曲線，未知樣品中赭曲霉毒素A所產生的熒光強度的變化值與標注曲線對照確定其濃度。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是:赭曲霉毒素A核酸適配體為單鏈DNA探針，序列為 5’ -CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3’。
【文檔編號】G01N21/64GK103808701SQ201310429041
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年9月18日 優先權日:2013年9月18日
【發明者】張玲, 王紅旗, 劉繼紅, 張軍鋒, 周玲, 王靜, 尹海燕, 王建 申請人:河南省農業科學院