單管同時檢測四種牛傳染病rna病毒的pcr方法
【專利摘要】本發明公開了一種在單個PCR反應管中同時檢測四種靶核酸的實時熒光PCR方法，用于檢測樣品中牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒。本方法操作快速、一步完成。另外，本發明還涉及上述PCR方法中所涉及的試劑，用于上述方法的檢測試劑盒和該檢測試劑盒的制備應用等。
【專利說明】單管同時檢測四種牛傳染病RNA病毒的PCR方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于病原體檢測領域，具體說，是涉及一種牛常見傳染病病原體的多重熒光定量PCR檢測方法，更具體地說，涉及一種在同一 PCR管中快速平行地檢測四種牛傳染病RNA病毒(牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒)的熒光定量PCR方法。
【背景技術】
[0002]牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒是四種常見的牛傳染病病原體。
[0003]牛副流感病毒屬于副流感病毒3型(PIV3)，屬于RNA病毒，在自然條件下，僅感染牛，病牛及帶毒牛是主要的傳染源，通過牛間接觸傳染，也可通過呼吸道感染。此病可導致牛不育。且感染BPIV3的牛常因呼吸道上皮受損而致常見病菌趁虛而入，侵入患病牛的呼吸道，從而引起嚴重的肺炎，使死亡率大大增加。口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，口瘡病毒屬，傳染力強。口蹄疫病毒在病畜的水泡皮內和淋巴液中含毒量最高。排病毒量以在病畜的內唇、舌面水泡或糜爛處，在蹄趾間、蹄上皮部水皰或爛斑處以及乳房處水泡最多。患口蹄疫的牛會出現發熱、跛行和在皮膚與皮膚黏膜上出現泡狀斑疹等癥狀。惡性口蹄疫還會導致病畜心臟麻痹并迅速死亡。人一旦受到口蹄疫病毒傳染，經過2-18天的潛伏期后突然發病，表現為發燒，口腔干熱，唇、齒齦、舌邊、頰部、咽部潮紅，出現水泡(手指尖、手掌、腳趾)，同時伴有頭痛、惡心、嘔吐或腹瀉，有時可并發心肌炎。牛腹瀉病毒為黃病毒科。是一種單股RNA、有囊膜的病毒。病毒可隨分泌物和排泄物排出體外。持續感染牛可終生帶、排毒，因而是本病傳播的重要傳染源。本病主要是經口感染，易感動物食入被污染的飼料，飲水而經消化道感染，也可由于吸入由病畜咳嗽、呼吸而排出的帶毒飛沫而感染，還可通過胎盤發生垂直感染。病牛表現為體溫突然升高到40°C以上，持續2-3天，伴有一過性的白細胞減少。懷孕母牛可能表現為胚胎早期死亡、流產或先天異常。呼腸孤病毒基因組為線形dsRNA，最初從人和動物的呼吸道和腸道分離出來，能夠引起牛腹瀉等癥狀。
[0004]現在對牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒的檢測主要以培養法和免疫學檢測為主。培養法檢測需要的時間長；靈敏度低，受環境因素影響較大，易出現假陰性；操作煩瑣，對操作者技術要求高。免疫學方法相比培養法有了很大進步，但是也容易受到其它因素影響，出現假陽性反應，帶來誤判的可能。
[0005]實時熒光定量PCR技術具有敏感、快速、 特異性強的優點，適合于病原體的快速準確診斷。該方法主要是在常規PCR基礎上添加熒光探針，通過熒光信號積累來實時監測整個PCR的過程，然后利用生成的標準曲線對未知濃度的模板進行定量分析。在PCR反應過程中可以連續不斷的檢測體系中熒光信號的變化。該方法具有特異性強，而且有效地解決了 PCR污染的問題，自動化程度高，適合于大量的樣本檢測等特點。目前，實時熒光定量PCR的方法已得到廣泛應用。
[0006]畜牧業上的病原體檢測需要及時準確，操作方便，一次處理大量樣本，以利于疫情的防控；但現有的病原體檢測水平尚不能滿足此種需要。在同一 PCR管中進行一次反應即可檢測幾種牲畜常見病病原體，尤其是牛傳染病病原體的存在與否，快速給出結果并適用于大型自動化分析儀器以指導下一步防疫工作進行的相關方法和產品目前在市面上實屬空缺。
【發明內容】
[0007]針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的之一是提供一種單管同時檢測四種牛傳染病RNA病毒的PCR方法。本發明的多重熒光PCR檢測方法中逆轉錄與基因擴增一步完成，具有較高的特異性和靈敏度，操作簡便，并且可應用在大型自動化檢測分析儀器上。
[0008]為實現上述發明目的，本發明首先針對牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒這四種病原體設計了互相干擾程度在實時PCR檢測中可接受的引物對和探針。引物設計原則為:引物應該非常特異:Tm在58-65°C之間；GC含量在30~80% ;不要有連續相同的堿基，尤其是G超過4個的情況；兩條引物的退火溫度應該比較接近；避免引物二聚體以及發夾結構等等。探針設計的原則為:Tm比引物高8~10°C ;GC含量在20~80%;G連續必須小于4個；探針不能形成發夾結構或者不能和引物形成二聚體等等。使用雜交探針進行試驗時，往往會形成引物-探針二聚體，主要是因為探針可與引物的3’末端雜交，以此為基礎，會進一步導致二聚體擴增，從而同目的基因競爭反應的原料，導致反應效率下降。探針由于其本身可以同目的基因結合，且解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發延伸反應，鑒于此，應對探針精心設計，并且將其末端磷酸化以避免延伸反應。
[0009]為排除PCR反應的假陰性，即確定陰性結果不是由于PCR反應失敗造成的，還需要選擇一個合適的內源參照基因(即內源模板)進行擴增檢測。本發明內標所用模板來源于腸桿菌噬菌體MS2 (Genebank FJ799612.1)，并設計相應引物和探針(即RNA內標探針)，加到每一個反應容器中，進行全程監控。
[0010]本發明具體采用的技術方案如下:
[0011]一種在單個PCR反應容器中四重檢測核酸提取液中靶核酸的實時定量PCR方法，所述靶核酸來自牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒和牛呼腸孤病毒，步驟包括:
[0012](I)分別提取樣品中的核酸，獲得核酸提取液，為病毒的總RNA ；
[0013](2)在所述單個PCR反應容器中混合核酸提取液、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中，
[0014]靶核酸引物對包括:
[0015]牛副流感病毒(BPIV):
[0016]BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCA ACA A
[0017]BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT
[0018]口蹄疫病毒(FMDV):
[0019]FMDV-L:GAACACATTCTTTACACCAGGAT
[0020]FMDV-R: CATTCTTTGCCAATCAACATCAG
[0021]牛腹瀉病毒(BVDV):
[0022]BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0023]BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT[0024]牛呼腸孤病毒(REO):
[0025]REO-L: GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
[0026]REO-R: CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
[0027]內對照:
[0028]IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
[0029]IC-F-R:GGTGATTTCACCTCCAGTAT
[0030]靶核酸探針包括:
[0031]牛副流感病毒(BPIV):
[0032]BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
[0033]口蹄疫病毒(FMDV):
[0034]FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC
[0035]牛腹 瀉病毒(BVDV):
[0036]BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0037]牛呼腸孤病毒(REO):
[0038]REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
[0039]內標:
[0040]IC-F-P: CACGACAGTGGTCGCTACATA
[0041](3)進行PCR反應，實時檢測不同波長的熒光信號；
[0042](4)根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有靶核酸存在于樣品中。
[0043]Ct值為擴增產物的熒光信號達到設定的閾值所經歷的擴增循環數。此時擴增是呈對數期增長。
[0044]在本發明樣品中的核酸系采用磁珠提取法提取，提取樣品中的核酸的過程為:向樣品加入核酸萃取液(優選核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液(如，Tris-HCl))，保溫后加入磁珠，混合均勻后，施加磁場后，棄去其中液體，然后洗滌(優選洗滌兩次，更優選其中第一次洗滌所用的洗滌液包含高氯酸鈉和乙醇，也更優選其中第二次洗滌所用的洗滌液包含乙醇)，并洗脫(優選洗脫所用的洗脫液包含PH緩沖液(如，Tris-HCl)。
[0045]在本發明提供的熒光PCR方法中，考慮到，當四種牛傳染病病毒模板同時擴增時，會競爭酶、引物和探針，對擴增產生影響，因此對整個反應體系和反應條件進行了優化研究。取四種病毒核酸提取液，以前文介紹的相應引物和探針進行熒光PCR共擴增，經優化，本發明熒光PCR體系(即在單個PCR反應容器中)中各組分的濃度為:
[0046]PCR反應體系為:反應體系總體積為60 μ 1，其中各組分的濃度分別為:Tris.HClpH8.310mM ；KC150mM ；MgC125mM ；dNTP0.2mM ；Taq DNA 聚合酶 5U ;M_MLV 反轉錄酶 150U ；RNasin20U ;各種引物15pM/種；各種熒光探針5pM/種；甘油5% (v/v);各種靶核酸提取液。其中各種把核苷酸提取液濃度為1000IU/mL，用量為Iul。
[0047]各種探針標記有不同的熒光基團，優選熒光基團是FAM，TAMRA, ROX, Cy5, HEX。
[0048]其中，優選的反轉錄和PCR條件為:
[0049]420C 30 分鐘 50°C 2 分鐘 94°C 3 分鐘
[0050](940C 10 秒 52°C 10 秒 65°C 45 秒)45 個循環[0051]反應結束后，熒光采集FAM、TAMRA, ROX、Cy5和HEX。
[0052]結果分析條件設定:ABI7500熒光儀的基線自動設定，熒光閾值設定在(dR=1000)。
[0053]I) FAM層Ct值>45且HEX層Ct值〈40，則判定為BPIV RNA陰性；
[0054]FAM層Ct值>45且HEX層Ct值≥40，則需要重檢；
[0055]FAM層Ct值≥40，則判定為BPIV RNA陽性。
[0056]2) TAMRA 層 Ct 值 >45 且 HEX 層 Ct 值〈40，則判定為 FMDV RNA 陰性；
[0057]TAMRA層Ct值>45且HEX層Ct值≥40，則需要重檢；
[0058]TAMRA層Ct值≥45，則判定為FMDV RNA陽性。
[0059]3) Rox層Ct值>45且HEX層Ct值〈40，則判定為BVDV RNA陰性；
[0060]Rox層Ct值>45且HEX層Ct值≥40，則需要重檢；
[0061]Rox層Ct值≥45，則判定為BVDV RNA陽性。
[0062]4) Cy5層Ct值>45且HEX層Ct值〈40，則判定為REO RNA陰性；
[0063]Cy5層Ct值>45且HEX層Ct值≥40，則需要重檢；
[0064]Cy5層Ct值≥45，則判定為REO RNA陽性。
[0065]本發明的目的之二是提供了一種在單個PCR反應容器中四重檢測核酸提取液中靶核酸的實時PCR方法的檢測試劑盒，主要成分如下:
[0066](I)磁珠法提取核酸所需試劑，包括:
[0067]核酸萃取液，優選核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液(如，Tris-HCl)；
[0068]第一次洗滌所用的洗滌液，優選其包含高氯酸鈉和乙醇；
[0069]第二次洗滌所用的洗滌液，優選其包含乙醇；和，
[0070]洗脫所用的洗脫液，優選其包含pH緩沖液(如，Tris-HCl)。
[0071 ](2)反轉錄和熒光PCR反應所需試劑
[0072]反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和靶核酸探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同。
[0073]試劑盒中各種探針標記有不同的熒光基團，優選熒光基團是FAM，TAMRA, ROX, Cy5，HEX。
[0074]試劑盒靶核酸引物對包括:
[0075]牛副流感病毒:
[0076]BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCA ACA A
[0077]BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT
[0078]口蹄疫病毒:
[0079]FMDV-L:GAACACATTCTTTACACCAGGAT
[0080]FMDV-R: CATATCTTTGCCAATCAACATCAG
[0081]牛腹瀉病毒:
[0082]BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0083]BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT[0084]牛呼腸孤病毒:
[0085]REO-L: GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
[0086]REO-R: CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
[0087]內對照:
[0088]IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
[0089]IC-F-R:GGTGATTTCACCTCCAGTAT
[0090]靶核酸探針包括:
[0091]牛副流感病毒:
[0092]BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
[0093]口蹄疫病毒:
[0094]FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC
[0095]牛腹瀉病毒:
[0096]BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0097]牛呼腸孤病毒:
[0098]REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
[0099]內對照:
[0100]IC-F-P: CACGACAGTGGTCGCTACATA
[0101]試劑盒中每種靶核酸探針在在所述反應體系總體積為60 μ I單個PCR反應容器中的濃度優選5pmol/反應。
[0102]在本文中，所檢測的“樣品”是潛在可能含有靶核酸或微生物的離體樣品。本發明的方法優選僅限于對離體樣品的檢測，檢測的直接結果是靶核酸或微生物的存在性與否。
[0103]在本文中，“單個PCR反應容器”指所述實時PCR方法在技術上是在同一個容器中進行的。在同一個容器中就可以完成PCR擴增和實時檢測的步驟，實現對四種病毒靶核酸的檢測。
[0104]在本文的實時熒光PCR反應中，Ct值表示每個PCR反應管內熒光信號到達實時熒光PCR儀所默認設定的閾值時所經歷的循環數，用作判讀結果的指標。在本發明的檢測方法中，對于步驟(4)，靶核酸的的Ct值〈45，則這種靶核酸存在于樣品中；Ct值>45，則不存在于樣品中。
[0105]本發明的有益效果在于:能夠單管檢測樣品中是否存在牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒，四種引物/探針無交叉污染及干擾，保證了準確性、可靠性、特異性、靈敏度和重復性，而且可以使用目前常規的市售實時熒光PCR設備完成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0106] 圖1本發明實施例對牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒的實時PCR擴增曲線圖，圖中五種曲線能夠清晰區分。
【具體實施方式】
[0107]下面結合實施例對本發明作進一步詳細、完整地說明。
[0108]如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子克隆實驗指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《細胞實驗指南》(科學出版社,北京，中國，2001年)、《RNA實驗技術手冊》(科學出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術》(科學出版社，北京，中國，1991)等實驗手冊所列方法來實施。
[0109]所用的探針、引物委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0110]所用耗材及工具均經過無RNase處理以確保RNA的完整與高純度。
[0111]牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒假病毒顆粒均為本實驗室合成并保存；本領域普通技術人員通過常規手段也可獲得。
[0112]實施例1
[0113]1、核酸提取
[0114]利用基因工程的技術手段，將牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒毒株制成相應的假病毒顆粒，供核酸提取。
[0115]核酸的提取按照常規磁珠提取法進行提取，方法如下:向10 μ I標準樣本(假病毒顆粒l*104IU/ml)加入90μ I核酸萃取液(配方及終濃度為:異硫氰酸胍12Μ、乙二胺四乙酸鈉(ρΗ8.0) IOmM,吐溫-202 % (W/W)、高氯酸鈉1.0Μ、乙醇40 % (V/V)、Tris-HCl (ρΗ8.0) IOmM)，于 42°C保溫 lOmin，然后加入 10 μ I MagDNA?彳磁珠懸浮液(50mg/mL，購自北京艾比根生物技術有限公司)，振蕩混合均勻后，套在磁架上施加磁場，棄去其中液體，然后加入200 μ I洗滌液A(配方及終濃度為:高氯酸鈉1Μ、乙醇30% (V/V))，洗滌后棄去洗滌液Α，再加入200 μ I洗滌液B (配方及終濃度為:乙醇70 % (V/V))，洗滌后棄去洗滌液B，最后加入洗脫液 (配方及終濃度為=Tris-HCl (ρΗ8.0) IOmM)，于42°C保溫lOmin，吸出并保留液體，即為核酸提取液，為每種病毒的基因組總RNA。
[0116]2、熒光PCR反應體系確定
[0117]通過摸索，確定PCR反應體系中各個組分，尤其是探針和引物的組合濃度。
[0118]2.1引物及探針序列
[0119]本發明中所有引物和探針合成所參照的模板DNA或RNA序列分別為:
[0120]各種病毒及內標所用模板的在Genebank上的編號分別為:
[0121]牛副流感病毒:HQ530159.1
[0122]口蹄疫病毒:AF5110391
[0123]牛腹瀉病毒:KC695815.1
[0124]牛呼腸孤病毒:ΑΥ007393.I
[0125]內標基因:FJ799612.1
[0126]以上模板信息本領域技術人員根據Genebank編號均可通過公開途徑獲知，本發明中不再列出具體序列。
[0127]靶核酸的引物對包括:
[0128]檢測牛副流感病毒的引物對:
[0129]BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCA ACA A
[0130]BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT
[0131]檢測口蹄疫病毒的弓丨物對:
[0132]FMDV-L: GAACACATTCTTTACACCAGGAT
[0133]FMDV-R: CATATCTTTGCCAATCAACATCAG[0134]檢測牛腹瀉病毒的引物對:
[0135]BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0136]BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT
[0137]檢測牛呼腸孤病毒的引物對:
[0138]REO-L: GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
[0139]REO-R: CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
[0140]內標引物對:
[0141]IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
[0142]IC-F-R: GGTGATTTCACCTCCAGTAT
[0143]靶核酸探針包括:
[0144]牛副流感病毒探針:
[0145]BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
[0146]口蹄疫病毒探針:
[0147]FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC
[0148]牛腹瀉病毒探針: [0149]BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
[0150]牛呼腸孤病毒探針:
[0151]REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
[0152]內標探針:
[0153]IC-F-P: CACGACAGTGGTCGCTACATA
[0154]2.2突光標記
[0155]在上述探針BPIV-P、FMDV-P、BVDV-P、REO-P和IC-F-P的5’端分別委托合成標記熒光標記FAM、TAMRA, ROX、CY5和HEX，并在3’端標記相應的淬滅基團。
[0156]2.3引物和探針的組合濃度
[0157](I) PCR反應體系總體積為60 μ I，其中各組分的濃度分別為:Tris.HClpH8.310mM ；KC150mM ；MgCl25mM ；dNTP0.2mM ；Taq DNA 聚合酶 5U ;M_MLV 反轉錄酶 150U ；RNasin20U ;各種引物15pmol/種；各種突光探針5pmol/種；甘油5% (v/v);各種祀核酸提取液。其中各種把核苷酸提取液濃度為1000IU/mL，用量為Iul。
[0158]2.4反轉錄和PCR條件
[0159]420C 30 分鐘 50°C 2 分鐘 94°C 3 分鐘
[0160](940C 10 秒 52°C 10 秒 65°C 45 秒)45 個循環
[0161]2.5試驗結果
[0162]熒光采集FAM、TAMRA, ROX、Cy5 和 HEX。
[0163]結果分析條件設定:ABI7500熒光儀的基線自動設定，熒光閾值設定在(dR=1000)。
[0164]FAM層Ct值大于40，牛副流感病毒(BPIV) RNA陽性。
[0165]TAMRA層Ct值大于45，口蹄疫病毒(FMDV) RNA陽性。
[0166]Rox層Ct值大于45，牛腹瀉病毒(BVDV) RNA陽性。
[0167]Cy5層Ct值大于45，牛呼腸孤病毒(REO)RNA陽性。[0168]各種病毒及內標的PCR擴增曲線參見附圖1。
[0169]3.熒光定量PCR條件優化結果
[0170]四種假病毒顆粒(104IU/ml)在熒光PCR體系中進行擴增后，
[0171]當引物探針比例為3:1時，BPIV、FMDV、BVDV和REO的Ct值分別為29.18-31.78、28.25-30.86、2433-2563 和 25.84-28.57 ;當引物探針比例為 2:1 時，BPIV、FMDV、BVDV和 REO 的 Ct 值分別為 31.22-33.55,32.06-33.95,25.83-26.25 和 28.98-29.67 ;當引物探針比例為 4:1 時，BPIV、FMDV、BVDV 和 REO 的 Ct 值分別為 32.02-34.68,29.77-31.53、24.83-26.29 和 27.98-30.31。
[0172]實施例2試劑盒特異性檢測
[0173]以牛瘟病毒、牛白血病病毒、牛流行熱病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒等樣品的總RNA為模板，采用本實驗設計的引物和探針進行實時熒光PCR反應，結果只有牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒產生熒光信號，擴增情況參見表1。證明本方法對于牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒的檢測具有特異性。
[0174]表1單管檢測四種牛RNA病毒方法特異性熒光PCR擴增結果
[0175]
【權利要求】
1.在單個PCR反應管中同時檢測四種靶核酸的實時熒光PCR方法，所述靶核酸來自牛副流感病毒、口蹄疫病毒、牛腹瀉病毒、牛呼腸孤病毒，同時用RNA內標進行全程監控，步驟主要包括: (1)提取樣品中的核酸，獲得病毒總核酸提取液； (2)在所述單個PCR反應管中混合核酸提取液、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和探針、內標引物對及探針，其中所述探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同，其中， 靶核酸引物對包括: 牛副流感病毒:
BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCAACAA
BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT 口蹄疫病毒:
FMDV-L: GAACACATTCTTTACACCAGGAT
FMDV-R: CATATCTTTGCCAATCAACATCAG 牛腹瀉病毒:
BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT
牛呼腸孤病毒:
REO-L:GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
REO-R:CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
內標:
IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
IC-F-R:GGTGATTTCACCTCCAGTAT
靶核酸探針包括: 牛副流感病毒:
BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
口蹄疫 病毒:
FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC 牛腹瀉病毒:
BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
牛呼腸孤病毒:
REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
內標:
IC-F-P: CACGACAGTGGTCGCTACATA (3)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光信號； (4)根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有靶核酸存在于樣品中。
2.根據權利要求1所述的方法，使用該方法提取樣品中的核酸系采用磁珠提取法提取，其特征在于步驟如下:向樣品加入核酸萃取液，該核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液Tris-HCl，保溫后加入磁珠，混合均勻，施加磁場后，棄去其中液體，然后兩次洗滌，第一次洗滌使用包含高氯酸鈉和乙醇的洗滌液，第二次洗滌使用包含乙醇的洗滌液，最后采用包含PH緩沖液Tris-HCl洗脫。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:每種靶核酸探針在所述單個PCR反應管中的濃度優選為5pmol/test。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:各種探針標記有不同的熒光基團，優選熒光基團是 FAM，TAMRA, ROX, Cy5, HEX。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于反轉錄和PCR的條件為: 420C 30分鐘50°C 2分鐘94°C 3分鐘 (940C 10 秒 52°C 10 秒 65°C 45 秒)45 個循環，
熒光采集 FAM，TAMRA, ROX, Cy5, HEX。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷靶核酸的方法為: 1)FAM層Ct值>45且HEX層Ct值〈40，則判定為BPIV RNA陰性； FAM層Ct值>45且HEX層Ct值<40，則需要重檢； FAM層Ct值<40，則判定為BPIV RNA陽性。 2)TAMRA層Ct值>45且HEX層Ct值〈40，則判定為FMDVRNA陰性； TAMRA層Ct值>45且HEX層Ct值<40，則需要重檢； TAMRA層Ct值<45，則判定為FMDV RNA陽性。 3)Rox層Ct值>45且HEX層Ct值<40，則判定為BVDV RNA陰性； Rox層Ct值>45且HEX層Ct值〈40，則需要重檢； Rox層Ct值<45，則判定為BVDV RNA陽性。 4)Cy5層Ct值>45且HEX層Ct值〈40，則判定為REO RNA陰性； Cy5層Ct值>45且HEX層Ct值<40，則需要重檢； Cy5層Ct值< 45，則判定為REO RNA陽性。
7.用于在單個PCR反應管中同時檢測四種靶核酸的實時熒光PCR方法的檢測試劑盒，主要包括: (1)磁珠提取法所需試劑，包括: 核酸萃取液，包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液Tris-HCl: 第一次洗滌所用的洗滌液，包含高氯酸鈉和乙醇； 第二次洗滌所用的洗滌液，包含乙醇； 洗脫所用的洗脫液，包含PH緩沖液Tris-HCl。 (2)PCR反應所需試劑 反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和探針、內標引物對及探針，其中所述探針兩端標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團的熒光檢測波長互不相同。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特診在于:各種探針標記有不同的熒光基團，優選熒光基團是 FAM，TAMRA, ROX, Cy5, HEX。
9.根據權利要求7所述的試劑盒靶核酸引物對和探針包括:牛副流感病毒:
BPIV-L:GGA TGT TAT TTG ACG CCA ACAA
BPIV-R:TCC CTC TAT CGA GTG GAA GAC ACT 口蹄疫病毒:
FMDV-L:GAACACATTCTTTACACCAGGAT
FMDV-R:CATATCTTTGCCAATCAACATCAG 牛腹瀉病毒:
BVDV-L: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
BVDV-R: CCCCGCTCAGGTTAAGATGT
牛呼腸孤病毒:
REO-L:GATCCTGATGTCTTGCGTCTAA
REO-R:CAGCAGTATTCCCGTCGATAAT
內標:
IC-F-L:CTCGAGAACGCAAGTTC
IC-F-R:GGTGATTTCACCTCCAGTAT
靶核酸探針包括: 牛副流感病毒:
BPIV-P:TTG CGC TTG CAC C
口蹄疫病毒:.
FMDV-P:ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC 牛腹瀉病毒:
BVDV-P: TGGTTCGACGCCTTGGTATA
牛呼腸孤病毒:
REO-P:AATTACGTGTGTCAAGGTGACGATGGA
內標:
IC-F-P:CACGACAGTGGTCGCTACATA。
10.根據權利要求7所述的試劑盒，其特診在于:每種靶核酸探針在所述單個PCR反應管反應體系總體積為60 μ I中的濃度為5pmol/反應。
【文檔編號】G01N21/64GK103468828SQ201310419281
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】王奕江, 曹振國, 齊潔婷, 劉明霞 申請人:上海卓潤生物科技有限公司