一種低分子肝素部分降解產物的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種低分子肝素部分降解產物的離子對反相色譜與高分辨質譜聯用檢測方法，它利用離子對反相色譜與高分辨質譜進行聯用檢測低分子肝素部分降解產物的各個組分，通過離子對反相色譜分離樣品中各組分，并通過高分辨質譜獲得精確的分子量，計算出各組分的糖鏈序列信息，包括兩端結構、糖鏈長度、乙酰基及硫酸基取代數量，從而對各低分子肝素部分降解產物的結構進行比較精細的表征。本發明可以檢測低分子肝素部分降解產物的兩端結構、糖鏈長度、乙酰基及硫酸基取代數量，解決了現有技術中僅能獲得低分子肝素部分降解的紫外吸收圖譜的問題，對于提高肝素的檢測水平、保障藥品安全具有極大的實用價值。
【專利說明】ー種低分子肝素部分降解產物的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及ー種低分子肝素部分降解產物的離子對反相色譜與高分辨質譜聯用檢測方法，屬于藥物、原料藥、原料檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]肝素是ー種糖胺聚糖類抗凝血抗血栓藥物，低分子肝素是肝素經物理方法、化學方法或者酶法降解制備而成的新型抗血栓藥物，具有強極性、高度不均一性、硫酸基團不穩定等特點，很難對其進行結構表征。低分子肝素部分降解片段的指紋圖譜分析是其結構表征中ー個非常重要的環節，通過它可以獲得肝素糖鏈的序列信息，但低分子肝素經肝素酶部分降解會增強酶解產物的不均一性，使得分析變得更加困難。通常分析低分子肝素部分降解片段的方法有反相高效液相色譜法及強陰離子交換高效液相色譜法(Chuang W L，etal.Journal of Chromatography A, 2001，932:65-74.),但通過這些方法僅能獲得紫外檢測圖譜，無法對各種糖鏈片段進行準確定性分析。
【發明內容】
[0003]本發明針對現有技術的不足，提供ー種低分子肝素部分降解產物的離子對反相色譜與高分辨質譜聯用檢測方法，可用于分析低分子肝素部分降解產物中的各種組分，對各種組分進行定性分析。
[0004]發明概述
[0005]本發明利用離子對反相色譜與高分辨質譜進行聯用檢測低分子肝素部分降解產物的各個組分，通過離子對反相色譜分離樣品中各組分，并通過高分辨質譜獲得精確的分子量，計算出各組分的糖鏈序列信息，包括兩端結構、糖鏈長度、こ酰基及硫酸基取代數量，從而對各低分子肝素部分降解產物的結構進行比較精細的表征。
[0006]發明詳述
[0007]—種低分子肝素部分降解產物的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法，步驟如下:
[0008](I)將胺類離子對試劑溶解于去離子水，制得胺類離子對濃度為10?40mM的流動相A，并將pH調至5.5?8.5 ;
[0009]或者，將胺類離子對試劑及六氟異丙醇溶解于去離子水，制得胺類離子對濃度為10?40mM、六氟異丙醇濃度為20?IOOmM的流動相A’ ；
[0010](2)將胺類離子對試劑溶解于體積百分比為75%的こ腈或體積百分比為75%的甲醇溶液中，制得胺類離子對濃度為10?40mM的流動相B，并將pH調至5.5?8.5 ;
[0011]或者，將胺類離子對試劑及六氟異丙醇溶解于體積百分比為75%的こ腈或體積百分比為75%甲醇溶液，制得胺類離子對濃度為10?40mM、六氟異丙醇濃度為20?IOOmM的流動相B’ ；
[0012](3)將待測低分子肝素樣品溶于流動相A或流動相A’，配制成濃度為6?lOmg/mL的待測溶液，經過濾后，使用C18反相色譜柱；流速8?12y L/min，洗脫梯度如下，均為體積百分比:
[0013]0?5min，95%流動相A，5%流動相B ;5?60min，65?95%流動相A，5?35%流動相B,
[0014]或者，0?5min, 95%流動相A，，5%流動相B，;5?60min, 60?95%流動相A’，5?
40%流動相B，；
[0015](4)在正離子模式或負離子模式下用高分辨質譜儀進行檢測，得到高分辨質譜圖；
[0016](5)通過紫外檢測色譜圖確定低分子肝素的種類，然后根據步驟(4)獲得的高分辨質譜圖獲得主要峰的質荷比M，經如下公式計算組分的精確分子量m:
[0017]正離子模式:m=zM-nX_zY
[0018]負離子模式:m=zM_nX+zY
[0019]其中:z表示電荷數，n表示離子對試劑分子個數，X表示離子對試劑的分子量，Y表不質子氫的分子量；
[0020](6)使用計算機輔助方法進行解譜，具體過程為:通過計算機生成各肝素組分的分子量數據庫，用步驟(5)中得到的精確分子量與數據庫中的理論分子量進行比對獲得誤差值I，按誤差值I的大小對數據庫中的數據進行排列，然后，根據質譜儀檢測標準品的誤差值II與誤差值I進行比對，選取誤差值II與誤差值I最為接近的數據庫中的理論樣品，通過該理論樣品的信息即可獲知待測低分子肝素樣品的結構信息。
[0021]所述步驟(I)中的胺類離子對試劑選自:正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。
[0022]所述步驟(2)中的胺類離子對試劑選自:正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。
[0023]所述步驟(4)中的高分辨質譜如采用離子阱時間飛行串聯質譜儀(IT-T0F)，設定參數為:正離子模式噴霧電壓:+3.6kV ;負離子模式噴霧電壓:-3.0kV ;噴霧氣流速:0.5L/min或者1.5L/min;掃描質量范圍:50?5000 ;如果采用四級桿時間飛行串聯質譜儀(Q-T0F)，設定參數為:正離子模式噴霧電壓:+5.5kV ;負離子模式噴霧電壓:-4.0kV ;簾氣壓25psi ;噴霧氣壓:30psi ;掃描質量范圍:50?4000。
[0024]有益效果
[0025]本發明可以檢測低分子肝素部分降解產物的的兩端結構、糖鏈長度、こ酰基及硫酸基取代數量，解決了現有技術中僅能獲得低分子肝素部分降解的紫外吸收圖譜的問題，對于提高肝素的檢測水平、保障藥品安全具有極大的實用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1、實施例1中克賽部分降解產物的總離子流圖；
[0027]圖2、實施例1中克賽部分降解產物的高分辨質譜圖；
[0028]圖3、實施例1中克賽部分降解產物的高分辨質譜圖；
[0029]圖4、實施例2中克賽部分降解產物的總離子流圖；
[0030]圖5、實施例2中克賽部分降解產物的高分辨質譜圖；[0031 ] 圖6、實施例2中克賽部分降解產物的高分辨質譜圖。
【具體實施方式】
[0032]下面結合實施例對本發明做進ー步說明，但本發明所保護范圍不限于此。
[0033]液相色譜儀為AgilentllOOseries毛細管液相色譜儀，檢測器為ニ極管陣列檢測器，工作站為Agilent ChemStation ;質譜為島津IT-T0F型高分辨質譜，工作站為LC-Solution0
[0034]實施例1:
[0035]一種低分子肝素部分降解產物的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法，步驟如下:
[0036]1.1將正戊胺溶解于去離子水，制得正戊胺濃度為15mM的流動相A，并將pH調至
7.0 ；
[0037]1.2將正戊胺溶解于體積百分比為75%的こ腈溶液，制得正戊胺濃度為15mM的流動相B，并將pH調至7.0 ;
[0038]1.3將克賽(購自賽諾菲-安萬持)注射液透析后凍干制得依諾肝素的原料藥，用肝素酶I進行部分降解，降解產物用MilliporelOKDa的超濾膜過濾后轉干，然后用流動相A配制成10mg/mL的待測溶液；
[0039]1.4使用填料粒徑為5 u m、色譜柱內徑為0.5mm、色譜柱長度為250mm的C18反相色譜柱；在流速10 u L/min,進樣量為2.0 y L，洗脫梯度為:0-5min，95%流動相A，5%流動相B ;5-60min, 65-95%流動相A，5-35%流動相B ；
[0040]1.5使用島津IT-TOF高分辨質譜在正離子模式下進行檢測，得到高分辨質譜圖，設定參數為:噴霧電壓:+3.6kV ;噴霧氣流速:0.5L/min ;掃描質量范圍:50-5000。
[0041]1.6根據步驟1.5中獲得的高分辨質譜圖中獲得的主要峰的質荷比M，經如下公式計算組分的精確分子量m:
[0042]m=zM-nX_zY
[0043]其中:z表示電荷數，n表示離子對試劑分子個數，X表示離子對試劑的分子量，Y表不質子氫的分子量。
[0044]1.7通過計算機生成依諾肝素部分降解產生的各組分的分子量數據庫，用步驟
1.6中得到的精確分子量與數據庫中的理論分子量進行逐一比對，獲得誤差值I，其計算公式如下:
[0045]誤差值I =(實測分子量-理論分子量)/理論分子量
[0046]按誤差值I的大小對數據庫中的數據進行排列，然后，根據質譜儀檢測標準品的誤差值II與誤差值I進行比對，選取誤差值II與誤差值I最為接近的數據庫中的理論樣品，通過該理論樣品的信息即可獲知待測低分子肝素樣品的結構信息。總離子流圖(TIC)中所標依諾肝素鈉樣品各組分的結構信息如表I所示。
[0047]表1
[0048]
【權利要求】
1.ー種低分子肝素部分降解產物的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法，步驟如下: (1)將胺類離子對試劑溶解于去離子水，制得胺類離子對濃度為10?40mM的流動相A，并將pH調至5.5?8.5 ; 或者，將胺類離子對試劑及六氟異丙醇溶解于去離子水，制得胺類離子對濃度為10?40mM、六氟異丙醇濃度為20?IOOmM的流動相A’ ； (2)將胺類離子對試劑溶解于體積百分比為75%的こ腈或體積百分比為75%的甲醇溶液中，制得胺類離子對濃度為10?40mM的流動相B，并將pH調至5.5?8.5 ; 或者，將胺類離子對試劑及六氟異丙醇溶解于體積百分比為75%的こ腈或體積百分比為75%甲醇溶液，制得胺類離子對濃度為10?40mM、六氟異丙醇濃度為20?IOOmM的流動相B，； (3)將待測低分子肝素樣品溶于流動相A或流動相A’，配制成濃度為6?lOmg/mL的待測溶液，經過濾后，使用C18反相色譜柱；流速8?12y L/min，洗脫梯度如下，均為體積百分比: 0?5min, 95%流動相A, 5%流動相B ;5?60min, 65?95%流動相A，5?35%流動相B， 或者，0?5min, 95%流動相A，，5%流動相B，;5?60min, 60?95%流動相A’，5?40%流動相B’ ； (4)在正離子模式或負離子模式下用高分辨質譜儀進行檢測，得到高分辨質譜圖； (5)通過紫外檢測色譜圖確定低分子肝素的種類，然后根據步驟(4)獲得的高分辨質譜圖獲得主要峰的質荷比M，經如下公式計算組分的精確分子量m: 正離子模式:m=zM-nX_zY 負離子模式:m=zM_nX+zY 其中:z表示電荷數，n表示離子對試劑分子個數，X表示離子對試劑的分子量，Y表示質子氫的分子量； (6)使用計算機輔助方法進行解譜，具體過程為:通過計算機生成各肝素組分的分子量數據庫，用步驟(5)中得到的精確分子量與數據庫中的理論分子量進行比對獲得誤差值I，按誤差值I的大小對數據庫中的數據進行排列，然后，根據質譜儀檢測標準品的誤差值II與誤差值I進行比對，選取誤差值II與誤差值I最為接近的數據庫中的理論樣品，通過該理論樣品的信息即可獲知待測低分子肝素樣品的結構信息。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)中的胺類離子對試劑選自:正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中的胺類離子對試劑選自:正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺或正己胺。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中的高分辨質譜采用離子阱時間飛行串聯質譜儀(IT-TOF)，設定參數為:正離子模式噴霧電壓:+3.6kV ;負離子模式噴霧電壓:-3.0kV ;噴霧氣流速:0.5L/min或者1.5L/min ;掃描質量范圍:50?5000 ;如果采用四級桿時間飛行串聯質譜儀(Q-TOF)，設定參數為:正離子模式噴霧電壓:+5.5kV;負離子模式噴霧電壓:-4.0kV ;簾氣壓25psi ;噴霧氣壓:30psi ;掃描質量范圍:50?4000。
【文檔編號】G01N30/89GK103454372SQ201310409051
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】遲連利, 徐曉暉, 李道遠, 孫曉君 申請人:山東大學