一種腫瘤標志物的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種腫瘤標志物的檢測方法，是基于SERS(表面增強拉曼散射)技術的免疫檢測，首先在基底上固定抗體；然后加入抗原和偶聯有抗體的拉曼探針，這樣就在基底上形成了“固相抗體-待測抗原-標記抗體”三明治結構的免疫復合體；最后，對該免疫復合體進行SERS檢測，即可高特異性的識別待測物的SERS信號。本發明被認為是一種具有良好發展前景的檢測方法，該方法運用偶聯有抗體的金屬納米粒作為SERS基底，可以實現高速、高敏感的檢測。
【專利說明】一種腫瘤標志物的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種腫瘤標志物的檢測方法。
【背景技術】
[0002]免疫檢測是一種成熟的檢測方法，可以應用于生化研究、臨床診斷、食品安全和環境檢測等領域。ELISA作為一種有效的篩查工具已經廣泛應用于患者體內多種蛋白標記物的證實，這一技術允許對小體積樣品中的多種標記物進行同時檢測。和傳統的檢測方法相t匕，該技術具有高效、低成本和易于臨床應用等顯著地優點。但是該技術也有許多技術局限，比如在免疫測定中，為了鑒別一組特定的抗原-抗體，通常會用到分子標簽的熒光檢測方法，而該技術具有檢測限高、光致褪色和不能重復檢測等缺點。
[0003]本發明被認為是一種具有良好發展前景的檢測方法，該方法運用偶聯有抗體的金屬納米粒作為SERS基底，可以實現高速、高敏感的檢測。本發明是基于SERS(表面增強拉曼散射)技術的免疫檢測，首先在基底上固定抗體；然后加入抗原和偶聯有抗體的拉曼探針，這樣就在基底上形成了“固相抗體-待測抗原-標記抗體”三明治結構的免疫復合體；最后，對該免疫復合體進行SERS檢測，即可高特異性的識別待測物的SERS信號。
【發明內容】
[0004]本發明的檢測是在位于微流控芯片的微通道內的一個典型的三明治免疫復合結構上進行的。首先，用微量注射泵分別把通道內注射充滿PBS (磷酸鹽緩沖液)緩沖液。使用THF溶液(羧酸)對金表面進行了修飾，為了在該表面上固定抗體還需對其進行活化，即對其上的羧基進行活化。活化的實現，是將0.008mol/L的EDC (1-乙基_3_ (3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)和0.012mol/L的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)混合溶液(V:V = 1:1)從進液口以3.lmL/min的流速經30min注射進入微通道進行的。活化完成后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對微通道進行清洗，以清除殘余的EDC/NHS溶液。
[0005]然后，將10 μ g/mL的anti_XX抗體從進液口經15min注射入微通道，以使它們固定在微通道中經EDC/NHS溶液活化的金基底上。等ant1-XX抗體在金基底上固定好之后，經進液口向微通道注入1%的BSA(牛血清白蛋白)溶液，以封閉微通道中未被特異性結合的羧基。封閉完成后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對微通道進行清洗，以清除殘余的BSA溶液。
[0006]第三步，將50 μ g/mL的anti_XX抗原經進液口以1.0mL/min的速度注射入微通道，隨后將整個芯片培養30min。之后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對微通道進行清洗，以清除沒有進行特異性結合的ant1-XX抗原。
[0007]最后，將0.008 μ mol/L 的 ant1-XX PcAb-4-MBA-HGNs 經進液口以 3.lmL/min 的流速用15min注射進入微通道，以形成三明治結構的免疫復合物。這一步操作完成以后即可選取SERS微流控芯片的微通道的任意位置進行SERS檢測，而后借助軟件或人工對所得SERS信號光譜進行分析以實現對待測物的定性、定量分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1是SERS微流控芯片示意圖
[0009]圖2是8條微通道的SERS信號圖
【具體實施方式】
[0010]1、檢測方法和步驟
[0011]首先需要制備具有ant1-XX PcAb_4_MBA (4_巰基苯甲酸)-HGNs (中空金納米球)結構的SERS探針。在加入多克隆抗體ant1-XX這一步，分別加入CA153和CA125抗體制成ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs 和 ant1-CA125PcAb-4-MBA_HGNs 兩種 SERS 探針。
[0012]實驗開始之前，需事先準備若干SERS微流控芯片，其中F、G、H三條微通道底面上濺射有金納米顆粒，其結構示意圖如圖1所示。
[0013]對照品的準備。首先，關閉除A閥門以外的所有閥門，用微量注射泵將A通道注滿雙蒸水后關閉A閥門。然后，打開B閥門，用微量注射泵將B通道注滿I %的BSA溶液后關閉B閥門。打開C閥門，用微量注射泵將C通道注滿PBS溶液后關閉C閥門。最后，依次打開D、E兩個閥門，用微量注射泵將與它們對應的通道依次注滿ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs探針溶液后依次關閉D、E兩個閥門。
[0014]待測樣品的準備。對上述幾種待測樣品，嚴格按照上述步驟進行實驗操作。首先，開啟微流控芯片上的F、G、H三個閥門，用微量注射泵從進液口向對應的3條通道內注射PBS緩沖液至充滿，而后將0.008mol/L的EDC和0.012mol/L的NHS混合溶液(V:V = I:1)從進液口以3.lmL/min的流速注射進入微通道對金基底活化30min。活化完成后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對微通道進行清洗，以清除殘余的EDC/NHS溶液。
[0015]然后，依次打開F、G、H三個閥門，分別將10μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗體從進液口經15min分別注射入微通道，以使它們固定在微通道中經EDC/NHS溶液活化的金基底上。等ant1-XX McAbs抗體在金基底上固定好之后，經進液口向微通道注入1%的BSA溶液，以封閉F、G、H三個通道中未被特異性結合的羧基。封閉完成后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對F、G、H三個微通道進行清洗，以清除殘余的EDC/NHS溶液。
[0016]第三步，依次打開F、G、H三個閥門，分別將50 μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗原經進液口以1.0mL/min的速度分別注射入對應的微通道，隨后將整個芯片培養30min。之后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對微通道進行清洗，以清除沒有進行特異性結合的ant1-XX抗原。
[0017]最后，打開F、G、H 三個閥門，將 0.008 μ mol/L 的 ant1-CA153PcAb-4-MBA_HGNs 和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs的混合液經進液口以3.lmL/min的流速注射進入微通道，以形成三明治結構的免疫復合物。這一步操作完成以后即可選取SERS微流控芯片微通道上的任意位置進行SERS檢測，而后借助軟件或人工對所得SERS信號光譜進行分析以實現對待測物質的定性、定量分析。
[0018]2、實驗結果及分析
[0019]通過移動激光光斑到每一微通道上，在靜態條件下檢測SERS信號。每條通道上檢測點應選取在離進液口或出液口相同距離的位置處。在試驗中，使用了一個具有兩個狹縫的光學結構來減弱未聚焦激光束的背景拉曼散射。在拉曼系統中，用入射狹縫和CCD(電荷耦合探測器)檢測器上的像素配合從而取代了小孔的功能。設置第一聚焦狹縫的寬度為15mm。微通道中的三明治結構的免疫復合物的拉曼光譜用50倍物鏡在共聚焦模式下檢測。積分時間5000ms。
[0020]實驗中分別設定SERS探針在微通道內的停留時間為2min、5min、lOmin、15min、20min,對選定點進行SERS檢測，發現在2min時基本檢測不到SERS信號，時間為5min及更長時可以檢測SERS信號，且隨著時間的延長SERS信號呈逐步增加趨勢。這一結果說明，SERS強度受SERS探針的停留時間影響較為明顯，即提供足夠的接觸時間以增加免疫復合體的裝載密度。圖2為對8條微通道進行SERS檢測得到的譜圖，其中F、G、H三個通道中SERS探針溶液停留時間為5min。圖2上為原始圖譜，截取有效部分并放大得到下圖。
[0021]圖中(a)圖為測得的雙蒸水的SERS信號圖，圖中無任何信號峰，這就驗證了水不會產生拉曼散射的結論，同時也說明了 PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)也不會產生拉曼散射，這就排除了這兩種物質對下述實驗結果的干擾。
[0022](c)圖為測得的PBS溶液的SERS信號圖，圖中無任何信號峰，說明PBS溶液也無拉曼散射產生。
[0023](d)圖和(f)圖比較發現，兩者在1040—1200cm-l處和1525—1675cm-l處都分布有兩組強度大且峰形基本相似的峰。1040—1200cm-l之間主要在1081cm_l、1142cm_l和1184cm-1處分布有三個較易識別的獨立峰，1525—1675cm-l之間只有1591cm_l處的峰強度大、易于識別。此外，(f)圖在450--600cm-l之間還分布有一組信號峰，該組信號峰強度相對較弱，主要由483cm-l、524cm-l、和566cm_l處的三個易于識別的獨立峰組成，而(d)圖在對應波數處無明顯信號峰。
[0024]比較(e)圖和(g)圖發現，其結果和(C)圖與(f)圖比較結果基本一致，即兩者也在1040—1200cm-l處和1525—1675cm-l處都分布有兩組強度大且峰形基本相似的峰，。1040—1200cm-l和1525—1675cm-l之間的獨立峰位置也與(d)圖基本一致。且(g)圖在450—600cm-l之間也分布有一組信號峰，其強度和(f)相近，而(e)圖在對應波數處無明顯信號峰。
[0025]比較(d)(e)圖和(h)圖發現，(e)圖在 1040—1200cm-1 處和 1525—1675cm-1 處分布有兩組強度較大的峰，而(h)圖在這兩處無明顯信號峰。(e)圖中1040—1200cm-l和1525--1675cm-l之間的獨立峰與(d)圖基本一致。但是(h)圖在450—600cm-l之間也分布有一組信號峰，其峰形和強度與(f)圖、(g)圖一致，而(d)、(e)兩圖在對應波數處無明顯信號峰。
[0026]比較(d)(e)兩圖發現兩者的SERS光譜圖基本一致，綜合上述分析可知在1040—1200cm-l處和1525—1675cm-l處的兩組峰是由SERS探針產生的，且(h)圖中的這兩組峰消失可以說明:(f) (g)反映的是陽性反應，即SERS探針和對應的標記物發生了特異性結合形成了三明治結構的免疫復合物，而(h)圖則反映的是陰性反應，即兩種SERS探針都沒有和標記物兔抗人抗原Ig發生特異性結合，而直接流出了 SERS微流控芯片。此外，(d)(e)兩圖中1040—1200cm-l處和1525—1675cm-l處的兩組峰其峰強度和峰位完全相同，就進一步說明SERS探針上的SERS信號是由4-MBA染料這種拉曼標簽引起的，而不是標記物本身引起的，所以把信號峰解析歸屬給標記物是不合理的。
[0027](b)圖是測得的1%的BSA溶液的SERS光譜圖，這一光譜圖總體來說峰形較差，但其在450—600cm-l之間強度相對較強，對比(f)、(g)、(h)三圖中450—600cm-l之間的信號即可肯定該信號峰來自于BSA溶液中某種成分，該物質本身具有SERS活性，其吸附在SERS微流控芯片內的金納米層上形成了(f) (g) (h)圖中增強的SERS信號。
[0028]但是，在整個實驗過程中，因為金納米粒子的聚集程度不同、HGNs的粒度不同、免疫復合體在金屬表面的分布不均勻等原因，SERS技術在定量分析中的應用較難實施，所以，我們僅依據1040—1200cm-l和1525—1675cm-l處的SERS信號峰的存在與否進行定性分析。總之，該實驗方法有效的實現了對乳腺癌標記物CA15-3和卵巢癌標記物CA12-5的檢測，具有特異性強、靈敏度高、樣品消耗量小等優點。
【權利要求】
1.一種腫瘤標記物的檢測方法，其特征是，包括以下步驟: (1)首先需要制備具有ant1-xxPcAb-4-MBA-HGNs結構的SERS探針。在加入多克隆抗體 ant1-XX 這一步，分別加入 CA153 和 CA125 抗體制成 ant1-CA153PcAb-4-MBA_HGNs 和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs 兩種 SERS 探針。 實驗開始之前，需事先準備若干SERS微流控芯片，其中F、G、H三條微通道底面上濺射有金納米顆粒。 對照品的準備。首先，關閉除A閥門以外的所有閥門，用微量注射泵將A通道注滿雙蒸水后關閉A閥門。然后，打開B閥門，用微量注射泵將B通道注滿I %的BSA溶液后關閉B閥門。打開C閥門，用微量注射泵將C通道注滿PBS溶液后關閉C閥門。最后，依次打開D、E兩個閥門，用微量注射泵將與它們對應的通道依次注滿ant1-CA153PcAb-4-MBA-HGNs和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs探針溶液后依次關閉D、E兩個閥門。 待測樣品的準備。對上述幾種待測樣品，嚴格按照上述步驟進行實驗操作。首先，開啟微流控芯片上的F、G、H三個閥門，用微量注射泵從進液口向對應的3條通道內注射PBS緩沖液至充滿，而后將0.008mol/L的EDC和0.012mol/L的NHS混合溶液(V:V = I:1)從進液口以3.lmL/min的流速注射進入微通道對金基底活化30min。活化完成后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對微通道進行清洗，以清除殘余的EDC/NHS溶液。 (2)然后，依次打開F、G、H三個閥門，分別將10μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗體從進液口經15min分別注射入微通道，以使它們固定在微通道中經EDC/NHS溶液活化的金基底上。等ant1-XX McAbs抗體在金基底上固定好之后，經進液口向微通道注入1%的BSA溶液，以封閉F、G、H三個通道中未被特異性結合的羧基。封閉完成后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對F、G、H三個微通道進行清洗，以清除殘余的EDC/NHS溶液。 (3)第三步，依次打開F、G、H三個閥門，分別將50μ g/mL的anti_CA153、anti_CA125和ant1-Ab抗原經進液口以1.0mL/min的速度分別注射入對應的微通道，隨后將整個芯片培養30min。之后再從進液口向通道中持續注入PBS溶液5min對微通道進行清洗，以清除沒有進行特異性結合的ant1-XX抗原。 (4)最后，打開F、G、H 三個閥門，將 0.008ymol/L 的 ant1-CA153PcAb-4-MBA_HGNs 和ant1-CA125PcAb-4-MBA-HGNs的混合液經進液口以3.lmL/min的流速注射進入微通道，以形成三明治結構的免疫復合物。這一步操作完成以后即可選取SERS微流控芯片微通道上的任意位置進行SERS檢測，而后借助軟件或人工對所得SERS信號光譜進行分析以實現對待測物質的定性、定量分析。
【文檔編號】G01N33/574GK104422769SQ201310403561
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】王倩, 鮑軍波, 姚波, 劉佩莉 申請人:天津市醫藥科學研究所