用于實時可逆檢測過氧化亞硝酰的熒光探針及其應用的制作方法
【專利摘要】用于實時可逆檢測過氧化亞硝酰的熒光探針及其應用涉及一種在ONOO-存在下熒光發生增強，在還原性物質存在下熒光又恢復原來狀態的熒光探針。本發明提供了一種可用于選擇性地實時檢測溶液體系、細胞、動物組織或動物個體內ONOO-變化的可逆熒光探針。本發明采用花菁染料作為熒光母體，在花菁母體上引入有機碲結構作為與ONOO-反應的活性中心，以實現選擇性地檢測ONOO-；利用有機碲醚被氧化后形成的有機碲氧化物容易被生物體系中的還原性小分子如半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、金屬硫蛋白等還原為有機碲醚的性質，實現探針分子對ONOO-的可逆性檢測。
【專利說明】用于實時可逆檢測過氧化亞硝酰的熒光探針及其應用
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及一種用于可逆檢測過氧化亞硝酰（0N0CO的熒光探針，具體的說，是一 種在0N0CT存在下熒光發生增強，在還原性物質如半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、金屬硫蛋白 等存在下熒光又恢復原來狀態的熒光探針。
【背景技術】：
[0002] 過氧化亞硝酰（ONOCr)是一種具有強氧化性的短壽命活性物種，在人體內由一氧 化氮和超氧負離子反應產生。0N0CT能作用于被免疫系統識別的病菌等有害物質而使之失 活，從而保護機體免受有害物質侵害，維持細胞和組織的正常功能。但是，在細菌感染等病 理條件下，大量0N0CT的產生會導致缺血再灌注損傷、風濕性關節炎、敗血癥、中風、多發性 硬化、動脈硬化、腸炎、癌癥及多種神經退行性疾病。然而，長久以來，檢測手段的缺乏阻礙 了人們對0N0CT在生命體系中作用行為的研究。
[0003] 熒光探針是有效檢測生命體內0N0CT的手段之一。一個具有應用前景的熒光探 針應具有作用前后熒光變化明顯、對目標分子響應快、選擇性好、可用于實時可逆檢測等優 點。Tetsuo Nagano等公開了一類用以檢測高反應性活性氧的突光探針HPF及APF (結構 見圖1，T.Nagano et.al, 18丨〇.0^111，2003,278,3170)，與0勵〇1乍用后熒光增強從而檢 測0N0CT的存在。但是這類熒光探針同時對羥自由基、次氯酸根等活性物種響應靈敏，不 能用于專一性地檢測0N0CT，也不具有可逆性，不能用于0N00_的實時檢測。Dan Yang等 公開了一種檢測0N0CT的突光探針HKGreen-1 (結構見圖1，Dan Yang et. al, J. Am. Chem. Soc，2006, 128, 6004)，次氯酸根不干擾0N00_的檢測，但羥自由基對0N00_檢測的干擾很大， 并且這種探針不具有可逆性，不能用于0N0CT的實時檢測。最近，Dan Yang等公開了一種檢 測 0N0CT 的熒光探針 HKGreen-2(結構見圖 l，Dan Yang et. al, Org. Lett.，2009, 11，1887)， 該探針仍然對羥自由基有較強響應，并且不具有可逆性，不能用于0N0CT的實時檢測。由于 不具有可逆性，上述探針無法準確提供生物體系中由0N0CT引起的氧化應激隨時間變化的 情況，不具有應用前景。開發具有選擇性，可用于溶液體系、細胞、動物組織或動物個體中 0N0CT實時可逆檢測的熒光探針具有重要意義。
【發明內容】
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[0004] 本發明就是針對上述問題，提供了一種可用于選擇性檢測細胞內0N0CT的可逆熒 光探針，此探針可以選擇性地與0N0CT作用，作用后熒光強度發生改變，在還原性物質如半 胱氨酸、還原型谷胱甘肽、金屬硫蛋白等存在下熒光又可以恢復到原先狀態。
[0005] 為了實現本發明的上述目的，本發明采用如下技術方案：本發明采用花菁染料作 為熒光母體，在花菁母體上引入有機碲結構作為與0N0CT反應的活性中心，以實現選擇性地 檢測0N0CT ;利用有機碲被氧化后形成的有機碲氧化物容易被生物體系中的還原性小分子 如半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、金屬硫蛋白等還原為有機碲醚的性質，實現探針對過氧化亞 硝酰的可逆性檢測。
[0006] 所述的突光探針的通式為：
[0007] 通式 I A-Te-RfY-F，
[0008] 通式I中，&為1?20個碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基苯環、 萘環或蒽環；苯環、萘環或蒽環上的取代基為硝基、氨基、磺酸基、羥基、胺基、烷氧基、氰基、 氟、氯、溴、碘中的一種或二種以上，取代基的個數為1-5個；
[0009] R2為1?20個碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基的苯環、萘環或蒽 環；苯環、萘環或蒽環上的取代基為硝基、氨基、磺酸基、羥基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、 溴、碘中的一種或二種以上，取代基的個數為1-5個；
[0010] Y 為 0、S、Se、NR，R"、NR，-C0、NR，-CS、NR，-NR，-C0 或 NR，-NR，-CS;其 中V和R"分別為Η或Q?C1(l的烷基，R'和R"相同或不同；
[0011] F為染料母體，染料母體為一甲川花菁、三甲川花菁、五甲川花菁或七甲川花菁。
[0012] F為七甲川花菁時，所述熒光探針的通式為：
[0013]
【權利要求】
1. 一種熒光探針，其特征在于，所述的熒光探針的通式為： 通式 I iRfTe-R^Y-F， 通式I中，Ri為1?20個碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基苯環、萘環或 蒽環；苯環、萘環或蒽環上的取代基為硝基、氨基、磺酸基、羥基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、 溴、碘中的一種或二種以上，取代基的個數為1-5個； R2為1?20個碳原子的烷基，烯丙基，含取代基或不含取代基的苯環、萘環或蒽環；苯 環、萘環或蒽環上的取代基為硝基、氨基、磺酸基、羥基、胺基、烷氧基、氰基、氟、氯、溴、碘中 的一種或二種以上，取代基的個數為1-5個； Y 為 0、3、56、順，1?"、順，-〇)、順，-〇5、順，-順，-〇)或順，-順，-〇5;其中1^ 和R"分別為Η或Q?C 1(l的烷基，R'和R"相同或不同； F為一甲川花菁母體、三甲川花菁母體、五甲川花菁母體或七甲川花菁母體。
2. 根據權利要求1所述的熒光探針，其特征在于：F為七甲川花菁母體，所述熒光探針 的通式為：
R3為Q?C2(l的烷基，最佳為Q?C1(l的烷基； R4為Q?C2(l的烷基，最佳為Q?C1(l的烷基； Y 為 0、3、56、順，1?"、順，-〇)、順，-〇5、順，-順，-〇)或順，-順，-〇5;其中1^ 和R"分別為Η或Q?C 1(l的烷基，R'和R"相同或不同； R5、R6分別為H、Ci?C2(l的燒基、橫酸基、竣基、環燒基、輕基、齒素、氣基、胺基、燒氧基、 氰基或硝基；r5、r6相同或不同。
3. 根據權利要求2所述的熒光探針，其特征在于：R5或&為環烷基，與各自相連的苯環 以單鍵的方式連接或以并環的方式連接。
4. 一種權利要求1、2或3所述的熒光探針在可逆檢測過氧化亞硝酰中的應用，其特征 在于：將通式I應用于檢測ONOCT時，其是與ONOCT作用，生成具有通式III結構的化合物，從 而導致熒光的改變；
具有通式III結構的化合物，在還原性物質半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、金屬硫蛋白的存 在下，重新變為具有通式I結構的化合物，從而導致熒光的恢復，此過程可定性檢測ONOCT。
5. 根據權利要求4所述的熒光探針在實時可逆檢測過氧化亞硝酰中的應用，其特征在 于：將通式π應用于檢測ONOCT時，其是與ONOCT作用，生成具有通式IV結構的化合物，從而 導致熒光的改變；
具有通式IV結構的化合物，在還原性物質半胱氨酸、還原型谷胱甘肽、金屬硫蛋白的存 在下存在下，重新變為具有通式II結構的化合物，從而導致熒光的恢復。
6. 根據權利要求4所述的熒光探針在實時可逆檢測過氧化亞硝酰中的應用，其特征在 于：通式I可對0N0CT進行定量檢測。
7. 根據權利要求4所述的熒光探針在實時可逆檢測過氧化亞硝酰中的應用，其特征 在于：用通式I測定溶液體系、細胞、動物組織或動物個體中的0N0CT，其熒光強度隨溶液體 系、細胞、動物組織或動物個體中的氧化還原電位而改變，能夠對溶液體系、細胞、動物組織 或動物個體中的0N0CT的進行實時可逆檢測。
【文檔編號】G01N21/64GK104119860SQ201310373662
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年4月26日
【發明者】韓克利, 樓張蓉, 于法標, 李鵬 申請人:中國科學院大連化學物理研究所