沙門氏菌富集和快速檢測方法

沙門氏菌富集和快速檢測方法
【專利摘要】本發明應用雙功能納米金磁微粒，提供一種集成免疫磁珠捕獲技術和免疫層析技術，快速檢測沙門氏菌的檢測方法。將免疫磁分離和免疫層析有機整合，免去了將沙門氏菌從免疫磁珠中洗脫下來的步驟，提高了捕獲效率；免去了將膠體金噴在結合墊上的步驟，免疫學反應更加均一，定量檢測時變異系數小；減少了工作量和雜菌污染概率。該檢測方法基本思路是探索納米金磁微粒和抗體有效結合的方式，優化其富集沙門氏菌的條件，以免疫層析技術為載體，以雙抗夾心為檢測原理，進行快速定量檢測。
【專利說明】沙門氏菌富集和快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物檢測領域，具體采用雙功能納米金磁微粒集成免疫磁珠捕獲技 術和免疫層析快速檢測沙門氏菌。
技術背景
[0002]沙門氏菌是自然界普遍存在的一種食源性致病菌，在世界各地的食物中毒中沙門 氏菌引起的中毒病例占第一位，常引起人類急性腹瀉、嘔吐、腹部疼痛、高燒和敗血癥等疾 病。沙門氏菌危害較大，在2006年歐盟調查中大約有160，049人被確認感染了沙門氏菌。 2008年4月到8月，美國有286人感染，2人死亡。2010年美國因沙門氏菌污染，召回了約 5億枚污染雞蛋。2010年在日本4090個農場中抽取203個調查，結果有48個農場顯示陽 性，占調查的23.6%。2012美國聯邦食品和藥物管理局(FDA)統計，美國每年大約有400人 死于沙門氏菌。
[0003]目前，檢測沙門氏菌的方法有傳統分離鑒定法、PCR方法、生物傳感器方法、免疫學 方法等。為了加快沙門氏菌的檢測速度，人們采用免疫磁珠的方法對樣品進行富集。一些 研究把免疫磁捕獲和實時熒光PCR技術結合起來，檢測食品中的沙門氏菌。PCR方法和生物 傳感器方法都具有較高的檢測靈敏度，一般可將檢測時間減少至24-48小時(依據不同檢 測項目而言)，但是該方法要求具有較高素質的操作人員、較好的檢測儀器以及檢測條件， 因此較難在基層以及企業大面積推廣使用，同時檢測時間仍很難滿足企業對出廠前產品質 量安全進行快速反應的實際需求，且該方法無法分辨死/活致病菌以及DNA片段的同源性， 易造成假陽性偏高的結果；而在檢測很多食品基質時，又會因為一些物質的存在而抑制了 DNA聚合酶的活性，從而造成假陰性。免疫學尤其是免疫層析方法，不需復雜儀器設備，檢測 時間快(一般15 min即可獲得結果)，易操作，但目前該類方法總體檢測靈敏度偏低(需要 細菌濃度需達到105—6 CFU/mL)，因此針對食品樣品檢測，往往需要較長的增菌時間。目前沙 門氏菌免疫學方法，采用膠體金免疫層析技術檢測，從增菌到檢測需要至少24小時才能實 現25 g樣品中單菌的檢測。
[0004]由于微生物的生長具有其特定的生理周期，通過優化培養條件縮短時間效果不明 顯；因此多采用免疫磁珠分離技術富集。依賴于特異性抗體的免疫磁珠分離技術可有效地 提高待測微生物的檢測靈敏度，已逐漸成為食源性致病菌特異性分離和濃縮的最有效手段 之一，并廣泛應用于沙門氏菌等食源性致病菌的富集,大大縮短了食源性致病菌整體檢測 時間。
[0005]以膜為固相載體的膠體金免疫層析法是20世紀80年代在單克隆抗體技術、膠體 金免疫技術和新材料技術基礎上發展起來的一項新型檢測方法。由于其快速、便捷、不需特 殊設備、結果判斷直觀、可以現場進行檢測的特點，近年來越來越受到人們的重視，其技術 發展迅速，在的檢測領域得到了廣泛應用。但是對于某些抗原或抗體含量極低的樣本，標記 物的顏色很淡幾乎用肉眼難以判斷結果，雖然目前市場上有針對膠體金等標記的免疫層析 試紙條判讀的儀器，但是這種儀器僅能對在固相載體表面的標記物顏色檢測，而對固相載體內部的標記物很難檢測到，因此檢測的靈敏度受到很大限制。同時檢測的生物樣本中可能含有顏色物質會嚴重影響檢測的結果和靈敏度。

【發明內容】

[0006]本發明目的在于提供一種快速、靈敏、簡便的沙門氏菌定性、定量檢測技術。
[0007]本發明具體方案如下:
沙門氏菌富集和快速檢測方法，包括以下步驟:1)制備偶聯單抗的金磁微粒；取抗沙門氏菌單抗與納米金磁微粒混合；在溫度37°C時，放在轉速為10-15rpm的旋轉儀上，偶聯時間3(T60min,磁分離3?5min,棄上清；用清洗緩沖液清洗3遍之后,用ImL封閉劑與磁珠混合封閉Ih ；2)使用偶聯單抗的金磁微粒捕獲菌:培養沙門氏菌，將菌液濃度調整為 107CFU/mL、106 CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取 I mL 備用；取待測樣品溶液 I mL、 各濃度菌液I mL，分別與步驟I)所得偶聯單抗的金磁微粒10(Tl50ii g，溫度37°C，轉速 10-15rpm混合孵育3(T60min，;孵育后磁分離3?5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復溶于PBS中；3)制作免疫層析試紙條；將沙門氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線T線和質控線C線，濃度均為1.(T2.0mg/mL,噴量均為0.5-1.0 u L/cm, 37°C 真空干燥過夜，將樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙、濾紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4_寬的條子，裝卡；將制備好的試紙條置于錫箔袋中加干燥劑密封，置于干燥缸保存備用；4)利用雙抗夾心法對樣品進行測定；將捕獲到菌的金磁微粒稀釋到濃度50-150 u g /mL,取100 u L滴加到試紙條加樣孔中，IOmin后用免疫層析分析儀讀取,記錄T線吸光度、 C線吸光度和T/C的值；5)定性分析:用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有沙門氏菌，T線不顯色則說明樣品中沒有沙門氏菌或是含有沙門氏菌的量低于IO4CFU/ mL ;6)定量分析:使用免疫層析分析儀測量T線、C線的吸光度，T線和C線的吸光度的比值記為T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線；參考所做的標準曲線圖，確定普通樣品中的沙門氏菌數量。
[0008]步驟I)納米金磁微粒粒徑為50nm ;步驟I)抗沙門氏菌單抗的量200?300 ii g對應50nm的納米金磁微粒的量為0.5?1.0mg
[0009]步驟3)所述免疫層析試紙條是在粘性底板上依次粘貼樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙、濾紙組成，沒有結合墊。
[0010]使用沙門氏菌膠體金試紙條，同時使用免疫層析分析儀定量檢測的方法，其特征在于:配制已知系列濃度的沙門氏菌溶液，用免疫層析分析儀測出其對應的光密度的數值， 根據這一系列數值與對應濃度建立標準曲線，然后將檢測樣品的試紙條放入免疫層析分析儀中，根據免疫層析分析儀輸出的數值，查標準曲線圖即可得出樣本中沙門氏菌的含量。
[0011]本發明有以下優點:
I)本發明采用的納米金磁微粒，兼有磁性納米粒子的超順磁性以及膠體金表面高效偶聯抗體的性能。由于納米金磁微粒可以借助其表面的靜電作用、疏水作用及Au-SH作用等非共價鍵作用，物理性的吸附抗體等蛋白物質，偶聯率高，偶聯效果穩定、而且在偶聯過程中能夠保證抗體的活性不受影響。
[0012]2)本發明將免疫磁分離和免疫層析有機整合，免去了將沙門氏菌從免疫磁珠中洗脫下來的步驟，提高了捕獲效率；免去了將膠體金噴在結合墊上的步驟，免疫學反應更加均一，定量檢測時變異系數小；減少了工作量和雜菌污染概率。
[0013]3)能同時對目標物沙門氏菌進行定性定量檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是納米金磁微粒偶聯抗體的結構圖
圖2是納米金磁微粒免疫磁分離沙門氏菌的流程圖圖3是使用免疫層析試紙條檢測陰性樣本的示意圖圖4是使用免疫層析試紙條檢測陽性樣本的示意圖。
【具體實施方式】
[0015]本發明利用納米金磁微粒的磁學性質、特征顏色和易于偶聯抗體的特性，將納米金磁微粒標記抗沙門氏菌抗體，用然后將此標記物加入到樣品中，同時，將沙門氏菌兔多抗包被在硝酸纖維膜上形成檢測線，兔抗鼠二抗包被在硝酸纖維膜上作為質控線，再將處理過的樣品墊、硝酸纖維膜、吸水紙和濾紙依次粘貼在支撐板上，利用雙抗體夾心法檢測樣品中是否含有沙門氏菌和定量檢測沙門氏菌。當待測樣品中含有一定濃度的沙門氏菌時，沙門氏菌先與金磁微粒標記抗體結合，將其滴加在試紙條加樣孔中，由于層析作用反應形成抗原(沙門氏菌)一抗體一納米金磁微粒抗體復合物而富集在檢測帶上，多余的納米金磁微粒標記物繼續移動到控制帶位置，由于二抗與納米金磁微粒標記的抗體發生免疫反應， 又富集在控制帶上，廣10分鐘后，取出試紙條，用肉眼在檢測帶和質控帶上觀察結果，也可以通過免疫層析分析儀進行結果的定量判讀。如果質控線處都沒有顏色或者沒有明顯信號，說明試紙條有質量問題，測試無效。
[0016]以下結合本發明的技術方案提供實施例。以下實施例對本發明的方案以具體實驗操作的形式示例，其中的實驗條件和設定參數不應視為對本發明基本技術方案的局限。并且本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0017]納米金磁顆粒購于西安金磁納米生物技術有限公司，納米金磁微粒粒徑為50nm。
[0018]SkanFlexi免疫層析分析儀購于常州思康立生物科技有限公司。
[0019]偶聯緩沖液配制方法如下:將3mL濃度為19.07g/mL的硼砂與7mL濃度為12.37g/ mL的硼酸混合后，稀釋10倍。
[0020]清洗緩沖液配制方法如下:稱取0.43gMES溶于200mL的無菌蒸餾水中，調pH為
5.5?6.0。
[0021]封閉劑配制方法如下:取50mg脫脂奶粉加入ImLPBS溶液配成封閉劑。
[0022]實施例一:使用納米金磁微粒對牛奶中沙門氏菌的檢測 1.制備偶聯單抗的金磁微粒:
1.1納米金磁微粒的處理:取20(T400 u L的偶聯緩沖液于2mL離心管中，取0.5-.0mg 的50nm納米金磁微粒與之混合,磁分離3?5min后,棄上清。
[0023]1.2偶聯反應:取制備好的抗沙門氏菌單抗20(T300 ii g,與50nm的納米金磁微粒
0.5-1.0mg混合，置于ImL偶聯緩沖液中。在溫度37°C時，放在轉速為l(Tl5rpm的旋轉儀上，偶聯時間3(T60min,磁分離3?5min棄上清。用ImL清洗緩沖液清洗3遍。
[0024]1.3封閉:清洗后，用封閉劑ImL與磁珠混合封閉lh。[0025]2.使用偶聯單抗的納米金磁微粒捕獲牛奶中的沙門氏菌
取25mL的滅菌后牛奶加入到225mL培養基中，接種一定濃度的沙門氏菌，溫度在 360C ±1°C，時間為8-18h震蕩培養。將菌液濃度調整為107CFU/mL、106 CFU/mL、IO5CFU/ mL、104CFU/mL。
[0026]取ImL各個濃度的菌液、取ImL待測牛奶樣品，加封閉后的免疫納米金磁微粒 100-150 u g,混合孵育30-60min,溫度37°C,轉速10-15rpm。孵育后磁分離3-5min后，棄上清，用PBS清洗后，復溶于PBS中。
[0027]3.制作沙門氏菌免疫層析試紙條
將沙門氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線和質控線，濃度均為1.(T2.0mg/mL，噴量均為0.5-1.0 y L/cm，37°C真空干燥過夜，將樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4_寬的條子，裝卡。將制備好的試紙條置于錫箔袋中加干燥劑密封，置于干燥缸保存備用。
[0028]4.利用雙抗夾心法對樣品進行目測和使用儀器測定結果
將捕獲到菌的金磁微粒稀釋到濃度50-150 u g /mL，取100 u L滴加到試紙條加樣孔中，IOmin后用免疫層析分析儀讀取，記錄T線吸光度、C線吸光度和T/C的值，以不同菌的濃度為橫坐標，分別以T線吸光度、T/C值為縱坐標繪制標準曲線。用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有沙門氏菌，T線不顯色則說明樣品中沒有沙門氏菌或是含有沙門氏菌的量低于104CFU/mL。
[0029]參考所做的標準曲線圖，確定樣品中沙門氏菌的數量。定量檢驗菌濃度的范圍在 IO4 -107CFU/mL。
[0030]實施例二:使用納米金磁微粒對牛肉中沙門氏菌的檢測 1.制備偶聯單抗的金磁微粒:
1.1納米金磁微粒的處理:取20(T400 u L的偶聯緩沖液于2mL離心管中，取0.5-1.0mg 的50nm納米金磁微粒與之混合,磁分離3-5min后,棄上清。
[0031]1.2偶聯反應:取制備好的抗沙門氏菌單抗20(T300 ii g,與50nm的納米金磁微粒
0.5-1.0mg混合，置于ImL偶聯緩沖液中。在溫度37°C時，放在轉速為l(Tl5rpm的旋轉儀上，偶聯時間3(T60min,磁分離3-5min棄上清。用清洗緩沖液清洗3遍。
[0032]1.3封閉:清洗后，用封閉劑ImL與磁珠混合封閉lh。
[0033]2.使用偶聯單抗的納米金磁微粒捕獲牛奶中的沙門氏菌
取25mg的牛肉肉糜加入到225mL培養基中，混勻。接種一定濃度的沙門氏菌，溫度在 360C ±1°C，時間為8-18h震蕩培養。
[0034]將菌液濃度調整為107CFU/mL、106 CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL。
[0035]取ImL各個濃度的菌液、取ImL待測肉糜樣品溶液，加封閉后的免疫納米金磁微粒 100-150 u g,混合孵育30-60min,溫度37°C,轉速10-15rpm。孵育后磁分離3-5min后，棄上清，用PBS清洗后，復溶于PBS中。
[0036]3.制作沙門氏菌免疫層析試紙條
將沙門氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線和質控線，濃度均為1.(T2.0mg/mL，噴量均為0.5-1.0 y L/cm，37°C真空干燥過夜，將樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4_寬的條子，裝卡。將制備好的試紙條置于錫箔袋中加干燥劑密封。
[0037]4.利用雙抗夾心法對樣品進行目測和使用儀器測定結果
將捕獲到菌的納米金磁微粒稀釋到濃度50 150 Ug /mL，取IOOii L滴加到試紙條加樣孔中，IOmin用免疫層析分析儀讀取，記錄T線吸光度、C線吸光度和T/C的值，以不同菌的濃度為橫坐標，分別以T線吸光度、T/C值為縱坐標繪制標準曲線。同時用肉眼觀察結果進行定性分析，T線若有顏色則說明樣品中有菌，檢測限約為104CFU/mL。，T線不顯色則說明樣品中沒有沙門氏菌或是含有沙門氏菌的量低于104CFU/mL。
[0038]參考所做的標準曲線圖，確定樣品中沙門氏菌的數量。定量檢驗菌濃度的范圍在 IO4 ?107CFU/mL。
【權利要求】
1.沙門氏菌富集和快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟:1)制備偶聯單抗的金磁微粒；取抗沙門氏菌單抗與納米金磁微粒混合；在溫度37°C時，放在轉速為10-15rpm的旋轉儀上，偶聯時間3(T60min,磁分離3?5min,棄上清；用清洗緩沖液清洗3遍之后,用ImL 封閉劑與磁珠混合封閉Ih ；2)使用偶聯單抗的金磁微粒捕獲菌:培養沙門氏菌，將菌液濃度調整為107CFU/mL、106 CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL，各取I mL備用；取待測樣品溶液I mL、各濃度菌液I mL，分別與步驟I)所得偶聯單抗的金磁微粒10(Tl50 y g，溫度37°C，轉速10-15rpm混合孵育3(T60min，；孵育后磁分離3?5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后， 復溶于PBS中；3)制作免疫層析試紙條；將沙門氏菌兔多抗和兔抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線T線和質控線C線，濃度均為1.(T2.0mg/mL,噴量均為0.5 1.0 u L/cm, 37°C真空干燥過夜，將樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙、濾紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4_寬的條子，裝卡；將制備好的試紙條置于錫箔袋中加干燥劑密封，置于干燥缸保存備用；4)利用雙抗夾心法對樣品進行測定；將捕獲到菌的金磁微粒稀釋到濃度50 150 U g /mL,取100 ii L滴加到試紙條加樣孔中，IOmin后用免疫層析分析儀讀取,記錄T線吸光度、C線吸光度和T/C的值；5)定性分析:用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有沙門氏菌，T線不顯色則說明樣品中沒有沙門氏菌或是含有沙門氏菌的量低于最低檢測下限104CFU/mL ；6)定量分析:使用免疫層析分析儀測量T線、C線的吸光度，T線和C線的吸光度的比值記為T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線；參考所做的標準曲線圖，確定普通樣品中的沙門氏菌數量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟I)納米金磁微粒粒徑為50nm;步驟I)抗沙門氏菌單抗的量20(T300 u g對應50nm的納米金磁微粒的量為0.5 1.0mgo
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)所述免疫層析試紙條是在粘性底板上依次粘貼樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙、濾紙組成，沒有結合墊。
【文檔編號】G01N33/569GK103439497SQ201310350230
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月13日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】賴衛華, 山珊 申請人:南昌大學