一種過氧化氫殘留的快速測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種過氧化氫殘留的快速測定方法，利用檢測試紙快速測定待測樣品中殘留的過氧化氫，為一種穩定性好、操作簡便、經濟實用的能現場快速檢測樣品中殘留過氧乙酸含量的方法，該方法響應時間快，靈敏度高，最低可檢測過氧化氫的含量為0.5mg/L。本發明方法可廣泛適用于食品、日化及醫療行業中，對各種經消毒或漂白的樣品中過氧化氫殘留含量進行快速、有效的監測。
【專利說明】一種過氧化氫殘留的快速測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種過氧化氫殘留的快速測定方法。
【背景技術】
[0002]過氧化氫是一種強氧化劑，具有消毒、殺菌、漂白等功能，在工業及醫療領域廣泛使用。在食品工業中，過氧化氫主要用于軟包裝紙的消毒、罐頭廠的消毒劑、奶和奶制品殺菌等。食品中過氧化氫殘留濃度過高對人類具有致癌的危險性，還可能加速人體衰老。所以，《食品添加劑使用衛生標準》GB2760-2002中規定:過氧化氫作為食品添加劑只能用于鮮牛乳和袋裝豆腐干，同時規定在袋裝豆腐干中不得有殘留，其它食品中使用過氧化氫必須經過衛生部的嚴格審批。但是不法商人對過氧化氫在食品加工尤其是保存中的濫用嚴重威脅到人們的身體健康，因此，建立一種簡單快速的食品中殘留過氧化氫濃度測定的方法顯得尤為重要。
[0003]目前用于食品和保健食品中殘留過氧化氫的檢測方法有很多:如氧化還原滴定法、改良4-氨基安替比啉(4-AA)比色法和氧電極法等，這些方法有的操作十分繁瑣，有的需用到大型的分光光度計，均不利于食品加工企業、食品監督部門乃至廣大的消費者對食品中過氧化氫殘留濃度進行現場快速監測。
[0004]試紙法因無二次污染、使用方便、易于攜帶等優點而成為目前最受消費者青睞的一種現場檢測方法。ELISA試劑盒中采用顯色底物和過氧化氫來檢測過氧化物酶，同樣可利用該原理通過顯色劑和過氧化物酶來檢測過氧化氫。該方法中可采用的顯色劑種類有很多，如專利ZL 200610011568.9中提到的苯酚與4-氨基安替吡啉、N, N- 二甲基苯胺、2，4- 二氯酚以及鄰二苯酚分別組合顯色，除此之外，還有四甲基聯苯胺(TMB)、TMB鹽、2，2-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)等，不同的顯色劑顯色靈敏度和試劑本身的穩定性有較大的差異。該方法中過氧化物酶在干燥和儲存過程中極易變性而失活。研究表明蛋白酶凍干過程中常用到的凍干保護劑對過氧化物酶干燥和儲存過程同樣可起到保護作用；選擇出靈敏度高、穩定性好的顯色劑，并選擇合適的PH調節劑和酶保護劑制作出靈敏度高、穩定性好的試紙是本發明的主要目的。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種過氧化氫殘留的快速測定方法。
[0006]本發明所采取的技術方案是:
一種過氧化氫殘留的快速測定方法，包括以下步驟:將過氧化氫殘留快速測定試紙浸入待測樣品制成的試液中，2秒后取出，甩去試紙上多余的溶液，顯色完全后，將試紙所顯的顏色與標準比色卡相比較，讀出過氧化氫殘留的濃度數據；
其中，過氧化氫殘留快速測定試紙由以下方法制備:用純水將辣根過氧化物酶、顯色齊U、PH調節劑、蛋白酶保護劑配制成混合液，將濾紙在混合液中浸泡5?30min后取出，烘干成形，裁切至設定尺寸，粘貼在底板上，制得用于測定過氧化氫殘留的試紙；所述混合液中，辣根過氧化物酶的濃度為0.0l?0.10g/L，顯色劑的濃度為1.0?2.5 g/L。
[0007]優選的，所述顯色劑為四甲基聯苯胺鹽酸鹽、四甲基聯苯胺硫酸鹽、四甲基聯苯胺丙磺酸鹽或2，2-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽。
[0008]優選的，所述蛋白酶保護劑為糖、氨基酸、蛋白質和聚合物的混合物。
[0009]優選的，所述蛋白酶保護劑中，糖為蔗糖、海藻糖中的至少一種；氨基酸為甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一種；蛋白質為牛血清蛋白、人血清白蛋白中的至少一種；聚合物為聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一種。
[0010]優選的，所述蛋白酶保護劑中，糖為海藻糖，氨基酸為甘氨酸，蛋白質為人血清白蛋白，聚合物為聚乙二醇。
[0011]優選的，所述混合液中，糖的濃度為4?20g/L，氨基酸的濃度為2?10g/L，蛋白質的濃度為I?5g/L，聚合物的濃度為4?20g/L。
[0012]優選的，所述pH調節劑為檸檬酸與磷酸氫二鈉的混合物，混合液中，檸檬酸的濃度為0.028?0.044mol/L，磷酸氫二鈉的濃度為0.11?0.14 mol/L。
[0013]所述標準比色卡，由以下方法制備:
1)用純水配制濃度為0.5mg/L的過氧化氫標準溶液,將過氧化氫殘留快速測定試紙浸入標準溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待試紙所呈現的顏色穩定后，在潘通色卡上找出對應的標準色；
2)同步驟I)所述方法，分別獲得檢測濃度為lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的過氧化氫標準溶液時試紙所呈現的標準色；
3)根據各標準色的色值制備得到標準比色卡。
[0014]本發明的有益效果是:
本發明提供了一種靈敏度高、穩定性好、操作簡便、經濟實用的能現場快速檢測樣品中殘留過氧化氫含量的方法，該方法響應時間快，不超過15秒，試紙檢測靈敏度高，最低可檢測過氧化氫的含量為0.5mg/Lo
[0015]本發明方法所用試紙中的pH調節劑即可保持辣根過氧化物酶的活性也可緩沖試樣的PH，保證了測試結果的準確性；試紙中的酶保護劑保證了酶試紙的穩定性，在室溫的條件下，避光密閉保存，保質期至少可達到12個月；試紙的面積小，單次測試試劑用量只有普通實驗室方法的幾百分之一，且測試過程簡單，無需其它儀器和配件，可大大節約測試成本；試紙的可持式底板可防止拿取的過程中受人手的污染，十分安全可靠。
[0016]本發明方法可廣泛適用于食品、日化及醫療行業中，對各種經消毒或漂白的樣品中過氧化氫殘留含量進行快速、有效的監測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為標準比色卡1#的視圖。
【具體實施方式】
[0018]一種過氧化氫殘留的快速測定方法，包括以下步驟:將過氧化氫殘留快速測定試紙浸入待測樣品制成的試液中，2秒后取出，甩去試紙上多余的溶液，顯色完全后，將試紙所顯的顏色與標準比色卡相比較，讀出過氧化氫殘留的濃度數據；
其中，過氧化氫殘留快速測定試紙由以下方法制備:用純水將辣根過氧化物酶、顯色齊U、PH調節劑、蛋白酶保護劑配制成混合液，將濾紙在混合液中浸泡5?30min后取出，烘干成形，裁切至設定尺寸，粘貼在底板上，制得用于測定過氧化氫殘留的試紙；所述混合液中，辣根過氧化物酶的濃度為0.0l?0.10g/L，優選濃度為0.04?0.06g/L，最佳濃度為
0.05g/L。
[0019]所述顯色劑為易溶于水的四甲基聯苯胺(TMB)鹽酸鹽、TMB硫酸鹽、TMB丙磺酸鹽以及2，2-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)中的一種，其中TMB鹽酸鹽顯藍色，TMB硫酸鹽、TMB丙磺酸鹽以及ABTS均顯藍綠色。所述混合液中，顯色劑的濃度為1.0?2.5 g/L ;優選的顯色劑為TMB鹽酸鹽，其在混合液中最佳濃度為2g/L。
[0020]所述的蛋白酶保護劑為糖、氨基酸、蛋白質和聚合物的混合物，其中，糖為蔗糖、海藻糖中的至少一種，優選為海藻糖；氨基酸為甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一種，優選為甘氨酸；蛋白質為牛血清蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)中的至少一種，優選為HSA ;聚合物為聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的至少一種，優選為PEG。所述混合液中，蛋白酶保護劑中糖、氨基酸、蛋白質和聚合物的濃度分別為4?20g/L、2?10g/L、l?5g/L、4?20g/L ;優選濃度分別為:5?15g/L、4?6g/L、2?4g/L、5?15g/L ;最佳濃度分別為:10g/L、5 g/L、3g/L、10 g/L。
[0021]優選的，所述pH調節劑為檸檬酸與磷酸氫二鈉的混合物，混合液中，檸檬酸的濃度為0.028?0.044mol/L，磷酸氫二鈉的濃度為0.11?0.14 mol/L。
[0022]所述濾紙為層析濾紙、定性濾紙和定量濾紙中的一種；優選為層析濾紙。
[0023]優選的，將濾紙置于低于30°C條件下真空干燥，烘干成形，將此濾紙裁切成25?IOOmm2的小塊，用膠粘在長條狀的底板一端，即制得用于測定過氧化氫殘留的試紙；所述底板的寬度為5?IOmm,長度為50mm?120mm ;所述底板由不吸水的塑料板制成。
[0024]所述標準比色卡，由以下方法制備:
1)用純水配制濃度為0.5mg/L的過氧化氫標準溶液,將過氧化氫殘留快速測定試紙浸入標準溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待試紙所呈現的顏色穩定后，在潘通色卡上找出對應的標準色；
2)同步驟I)所述方法，分別獲得檢測濃度為lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的過氧化氫標準溶液時試紙所呈現的標準色；
3)根據各標準色的色值制備得到標準比色卡。
[0025]本發明方法檢測過氧化氫殘留的響應時間快，靈敏度高，最低可檢測過氧化氫的含量為0.5mg/L ;試紙中的pH調節劑即可保持辣根過氧化物酶的活性也可緩沖試樣的pH值，保證了測試結果的準確性；試紙中的酶保護劑保證了試紙的穩定性，在室溫條件下，避光密閉保存，保質期至少可達到12個月；試紙的面積小，單次測試試劑用量只有普通實驗室方法的幾百分之一，且測試過程簡單，無需其它儀器和配件，可大大節約測試成本；試紙的可持式底板可防止拿取試紙的過程中受人手的污染，十分安全可靠。
[0026]下面結合具體的實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0027]實施例1
用純水配制含0.05g/L辣根過氧化物酶、2.0g/L TMB鹽酸鹽、0.037mol/L檸檬酸、0.126mol/L 磷酸氫二鈉、10 g/L 海藻糖、5 g/L 甘氨酸、3g/LBSA、10 g/LPEG4000 的混合顯色液。將層析濾紙完全浸泡至上述混合液中約10分鐘，取出濾紙，在低于30°C溫度下真空干燥，將此濾紙切成5X6 mm的小塊,用膠粘在5X80_條狀的底板一端，即制成過氧化氫殘留測定試紙1#。
[0028]實施例2
用純水配制含0.0I g/L辣根過氧化物酶、1.0g/L TMB硫酸鹽、0.028mol/L檸檬酸、
0.llmol/L磷酸氫二鈉、10g/L海藻糖、5g/L精氨酸、2g/LBSA、lg/LHSA、10 g/LPVP K30 的混合顯色液。將層析濾紙完全浸泡至上述混合液中5分鐘，取出濾紙，在低于30°C溫度下真空干燥，將此濾紙切成5X5 mm的小塊,用膠粘在5X50mm條狀的底板一端，即制成過氧化氫殘留測定試紙2#。
[0029]實施例3
用純水配制含0.025g/L辣根過氧化物酶、1.5g/L TMB丙磺酸鹽、0.044mol/L檸檬酸、
0.14mol/L磷酸氫二鈉、2g/L鹿糖、2g/L海藻糖、2g/L甘氨酸、lg/LHSA、4g/LPEG6000的混合顯色液。將定性完全浸泡至上述混合液中約20分鐘，取出濾紙，在低于30°C溫度下真空干燥，將此濾紙切成5X5 mm的小塊,用膠粘在5X50mm條狀的塑料硬板一端，即制成過氧化氫殘留測定試紙3#。
[0030]實施例4
用純水配制含0.1 g/L辣根過氧化物酶、2.5g/L ABTS、0.044mol/L檸檬酸、0.14mol/L磷酸氫二鈉、20g/L蔗糖、6g/L谷氨酸、2g/L甘氨酸、2g/L精氨酸、4g/LHSA、20g/LPEG8000的混合顯色液。將定量濾紙完全浸泡至上述混合液中30分鐘，取出濾紙，在低于30°C溫度下真空干燥，將此濾紙切成IOX IOmm的小塊,用膠粘在IOX 120mm條狀的塑料硬板一端，即制成過氧化氫殘留測定試紙4#。
[0031]實施例5
制備與試紙1#配套使用的標準比色卡1#:
1)用純水配制濃度為0.5mg/L的過氧化氫標準溶液,將實施例1制備的試紙浸入溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，15秒后根據試紙所呈現的顏色在潘通色卡上找出色調一致的標準色；
2)同步驟I)所述方法，分別獲得檢測濃度為lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的過氧化氫標準溶液時試紙所呈現的標準色；
3)根據得到的各潘通標準色所列色值采用電腦調色和印制，得到標準比色卡1#(如圖1所示)。
[0032]實施例6
同實施例5所述的方法，分別制備得到與檢測試紙2#?4#配套使用的標準比色卡
2# ?4# ο
[0033]實施例7
將過氧化氫殘留測定試紙1#、2#、3#、4#置于密實袋中，放置37°C烘箱中，每隔30天觀察試紙外觀及進行顯色效果測試。測試方法:配制lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L系列過氧化氫標準溶液,分別將試紙I#、2#、3#、4#插入標準溶液中2秒后取出，甩去試紙上多余的溶液，顯色完全后觀察顯色效果，并分別與標準比色卡1#、2#、3#、4#對照，讀出過氧化氫濃度的數據。隨著過氧化氫含量的增加，試紙所顯的顏色逐漸加深。檢測結果
如表I-4所示:
表I實施例1中過氧化氫殘留試紙的穩定性_
【權利要求】
1.一種過氧化氫殘留的快速測定方法，包括以下步驟:將過氧化氫殘留快速測定試紙浸入待測樣品制成的試液中，2秒后取出，甩去試紙上多余的溶液，顯色完全后，將試紙所顯的顏色與標準比色卡相比較，讀出過氧化氫殘留的濃度數據； 其中，過氧化氫殘留快速測定試紙由以下方法制備:用純水將辣根過氧化物酶、顯色齊U、PH調節劑、蛋白酶保護劑配制成混合液，將濾紙在混合液中浸泡5?30min后取出，烘干成形，裁切至設定尺寸，粘貼在底板上，制得用于測定過氧化氫殘留的試紙；所述混合液中，辣根過氧化物酶的濃度為0.0l?0.10g/L，顯色劑的濃度為1.0?2.5 g/L。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述顯色劑為四甲基聯苯胺鹽酸鹽、四甲基聯苯胺硫酸鹽、四甲基聯苯胺丙磺酸鹽或2，2-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述蛋白酶保護劑為糖、氨基酸、蛋白質和聚合物的混合物。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述蛋白酶保護劑中，糖為蔗糖、海藻糖中的至少一種；氨基酸為甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一種；蛋白質為牛血清蛋白、人血清白蛋白中的至少一種；聚合物為聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一種。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述蛋白酶保護劑中，糖為海藻糖，氨基酸為甘氨酸，蛋白質為人血清白蛋白，聚合物為聚乙二醇。
6.根據權利要求3、4或5所述的方法，其特征在于:所述混合液中，糖的濃度為4?20g/L，氨基酸的濃度為2?10g/L，蛋白質的濃度為I?5g/L，聚合物的濃度為4?20g/L。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述pH調節劑為檸檬酸與磷酸氫二鈉的混合物，混合液中，檸檬酸的濃度為0.028?0.044mol/L，磷酸氫二鈉的濃度為0.11?0.14mol/L0
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述標準比色卡，由以下方法制備: 1)用純水配制濃度為0.5mg/L的過氧化氫標準溶液,將過氧化氫殘留快速測定試紙浸入標準溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待試紙所呈現的顏色穩定后，在潘通色卡上找出對應的標準色； 2)同步驟I)所述方法，分別獲得檢測濃度為lmg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的過氧化氫標準溶液時試紙所呈現的標準色； 3)根據各標準色的色值制備得到標準比色卡。
【文檔編號】G01N21/78GK103439323SQ201310337923
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月5日 優先權日:2013年8月5日
【發明者】闕紹輝, 秦惠, 鄧金花, 黃報亮 申請人:廣東環凱微生物科技有限公司