快速檢測微量赤蘚紅的試紙條及制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速檢測微量赤蘚紅的試紙條及制備方法，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯赤蘚紅的載體蛋白溶液印制的檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的對照印跡；赤蘚紅金標抗體為膠體金標記的赤蘚紅單克隆抗體或多克隆抗體，偶聯赤蘚紅的載體蛋白溶液為赤蘚紅與載體蛋白偶聯的復合溶液。本發明的試紙條具有特異性強，靈敏度高，簡便，直觀，準確，適用范圍廣，成本低，易于推廣應用。
【專利說明】快速檢測微量赤蘚紅的試紙條及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測微量色素技術，特別是涉及一種快速檢測微量赤蘚紅的試紙條及制備方法。
技術背景
[0002]赤蘚紅(ErythiOSin),又稱櫻桃紅、四碘熒光素、食品色素3號，分子式為C20H6I4Na2O5.H2O,常見紅色或紅褐色顆粒或粉末，無臭，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇和甘油，不溶于油脂，耐熱性、耐堿性、耐氧化還原性好，耐細菌性和耐光性差，遇酸則沉淀，吸濕性差。赤蘚紅具有良好的染著性，特別是對蛋白質的染著性尤佳。根據其性狀，在需高溫焙烤食品和堿性及中性食品中著色力較其他合成色素強。聯合國糧農組織和世界衛生組織規定，赤蘚紅的每日允許攝取量為0-1.25mg/kg ;我國《食品添加劑使用衛生標準》(GB2760-1996)規定:用于調味醬時赤蘚紅的最大使用量0.05g/kg ;用于高糖果汁(味)或果汁(味)或果汁(味)飲料、碳酸飲料、配制酒、糖果、糕點上彩裝、青梅最大使用量0.05g/kg ;用于紅綠絲、染色櫻桃(系裝飾用)的最大用量0.10g/kg。
[0003]目前國內外測定赤蘚紅在食品中殘留的方法種類較多，主要是采用理化分析方法，包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜/質譜聯用分析法(LC/MS)、氣相色譜/質譜聯用分析法(GC/MS)等，這些方法檢測赤蘚紅的靈敏度高，特異性強，但是樣品需經一系列復雜的處理凈化，繁瑣費時，從樣品預處理到得出檢測結果至少需要2天時間；同時這些檢測方法需要大型專門儀器設備和專業技術人員操作，無法現場檢測，時效性差，難以推廣。免疫學檢測法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待測物的初步信息，該法靈敏度高，分析過程相對簡單，用作赤蘚紅的篩查有獨特優勢，是需要優先發展的檢測技術，急待研究解決。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題:提供一種特異、靈敏、快速、簡便的快速檢測微量赤蘚紅的試紙條；
還提供一種檢測微量赤蘚紅試紙條的制備方法。
[0005]本發明的技術方案:
一種快速檢測微量赤蘚紅的試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，吸附層上設有保護層，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯赤蘚紅的載體蛋白溶液印制的檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的對照印跡。
[0006]所述偶聯赤蘚紅的載體蛋白溶液是通過以下方法得到的:
采用DCC法將赤蘚紅與載體蛋白進行偶聯，具體步驟如下:準確稱取2mg的赤蘚紅、2mg的N，N’ - 二環己基碳二亞胺和5mg的N-羥基琥珀酰亞胺，溶于1.0mL N, N- 二甲基甲酰胺溶液中，室溫避光攪拌4h，充分反應后得到A液；稱取BSA IOmg溶于3mL PBS緩沖液中，得到B液；在室溫磁力攪拌下，將A液緩慢加入B液中，4°C反應12h后用PBS透析3天，換液3次/天,透析完成后，4000rpm離心5min,取上清液,得到偶聯赤蘚紅的載體蛋白，I&藏于-20°C，備用。
[0007]所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制成。
[0008]金標抗體纖維層用吸附赤蘚紅的金標抗體玻璃纖維棉制成，金標抗體為膠體金標記的赤蘚紅單克隆抗體或多克隆抗體，偶聯赤蘚紅的載體蛋白溶液為赤蘚紅與載體蛋白偶聯的復合溶液。
[0009]纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料。
[0010]偶聯赤蘚紅的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA或血藍蛋白KLH。
[0011]檢測印跡與對照印跡的排列組合為“
【權利要求】
1.一種快速檢測微量赤蘚紅的試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，吸附層上設有保護層，其特征是:吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯赤蘚紅的載體蛋白溶液印制的檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的對照印跡。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是:所述偶聯赤蘚紅的載體蛋白溶液是通過以下方法得到的: 采用DCC法將赤蘚紅與載體蛋白進行偶聯，具體步驟如下:準確稱取2mg的赤蘚紅、2mg的N，N’ - 二環己基碳二亞胺和5mg的N-羥基琥珀酰亞胺，溶于1.0mL N, N- 二甲基甲酰胺溶液中，室溫避光攪拌4h，充分反應后得到A液；稱取BSA IOmg溶于3mL PBS緩沖液中，得到B液；在室溫磁力攪拌下，將A液緩慢加入B液中，4°C反應12h后用PBS透析3天，換液3次/天,透析完成后，4000rpm離心5min,取上清液,得到偶聯赤蘚紅的載體蛋白，I&藏于-20°C，備用。
3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是:所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制成。
4.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是:金標抗 體纖維層用吸附赤蘚紅的金標抗體玻璃纖維棉制成，金標抗體為膠體金標記的赤蘚紅單克隆抗體或多克隆抗體，偶聯赤蘚紅的載體蛋白溶液為赤蘚紅與載體蛋白偶聯的復合溶液。
5.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是:纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料。
6..根據權利要求1所述的試紙條，其特征是:偶聯赤蘚紅的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA或血藍蛋白KLH。
7.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:檢測印跡與對照印跡排列組合為“II ”、“ + + ”、“11”、“丁丁”、“ h P’中的一種；在吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向吸附纖維層一側約0.5cm處。
8.權利要求1所述赤蘚紅試紙條的制備方法，其特征是:該方法包括以下步驟: (1)偶聯赤蘚紅載體蛋白的制備 采用DCC法將赤蘚紅與載體蛋白進行偶聯，具體步驟如下:準確稱取2mg的赤蘚紅、2mg的N，N’ - 二環己基碳二亞胺和5mg的N-羥基琥珀酰亞胺，溶于1.0mL N, N- 二甲基甲酰胺溶液中，室溫避光攪拌4h，充分反應后得到A液；稱取BSA IOmg溶于3mL PBS緩沖液中，得到B液；在室溫磁力攪拌下，將A液緩慢加入B液中，40C反應12h后用PBS透析3天，換液3次/天,透析完成后，4000rpm離心5min,取上清液,得到偶聯赤蘚紅的載體蛋白，I&藏于-20°C，備用； (2)抗赤蘚紅抗體的制備； (3)赤蘚紅金標抗體的制備； (4)羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗體的制備； 用所得的赤蘚紅載體蛋白溶液在纖維素膜層上印制檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗體在纖維素膜層上印制對照印跡；用赤蘚紅金標抗體制備金標抗體纖維層，然后依次按支撐層、吸附層和保護層的順序組裝成試紙條。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征是:所述赤蘚紅金標抗體的制備方法如下: 沸騰的200mL 0.01-0.02%氯金酸溶液中加入新蘚配制的I %檸檬酸鈉8mL，獲得直徑15-20nm的膠體金溶液，用0.lmol/L的K2CO3調節pH值至8.5-9.5，置2-8°C保存，備用; 以1:2000的標記比將待標記的赤蘚紅的單克隆抗體或多克隆抗體加入pH 8.5-9.5的金溶膠中，標記IOmin后，加入20 %的PEG10000至終濃度為0.05 %，4°C、1500-3000rpm離心20min,除去未結合的膠體金顆粒,4°C、15000rpm離心Ih,棄上清,獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析進行分離純化，獲得膠體金標記的赤蘚紅抗體。
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征是:所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標抗體纖維層用吸附赤蘚紅的金標抗體玻璃纖維棉制成；偶聯赤蘚紅的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA或血藍蛋白 KLH。
【文檔編號】G01N33/544GK103454421SQ201310334330
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月3日 優先權日:2013年8月3日
【發明者】張改平, 邢廣旭, 劉珍, 王棟, 胡驍飛, 王方雨, 趙東 申請人:河南百奧生物工程有限公司, 河南省農業科學院