一種胱抑素c檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及醫學免疫體外診斷領域，特別是一種檢測血清中的胱抑素C檢測試劑盒。其包括試劑R1，試劑R2及校準品。所述試劑R1，其組分為：Tris緩沖液0.01-0.05mol/L，PEG6000?10-40g/L，NaN3?0.5-1.5g/L，氯化鈉12-20g/L，pH值8.0-8.5。所述R2試劑，其組分為：Tris緩沖液0.01-0.02mol/L，羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的聚苯乙烯膠乳顆粒0.5-3.0g/L。所述校準品為胱抑素C含量為0.1，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0mg/L的六個梯度標準品，溶液為0.01mol/L的Tris緩沖液。本發明的試劑盒組成簡單、穩定性好、準確度高。
【專利說明】一種胱抑素C檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學免疫體外診斷領域，特別是一種檢測血清中的胱抑素C檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]腎臟疾病是臨床上一種常見的疾病，各種原因導致的腎功能損害是進展為終末性腎病及心血管疾病的危險因素。唯一能阻止腎臟疾病惡化的方法就是早診斷、治療以逆轉損傷的腎功能。
[0003]胱抑素C是一種非糖化的蛋白，是半胱氨酸蛋白酶抑制劑的一種，它由大多數有核細胞以一種恒定的方式生成。其分子量小，生成率穩定，由于其在血清中的濃度與腎小球濾過率(GFR)有密切的關系，并且對腎小球濾過率比肌酐更為敏感。因此，胱抑素C對測定腎小球濾過率有及其重要的意義。
[0004]膠乳顆粒增強比池法(particle-enhancedturbidimetric immunoassay, PETIA)是近年來出現的一種較為穩定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。在高分子膠乳微球的表面交聯單克隆抗體，當交聯有抗體的微球與抗原結合后，在短時間內會迅速聚集在一起，改變了反應液的散光性能或透光性能。而且，反應液透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關性，在一定范圍內可以反映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是在均相反應體系中進行抗原、抗體反應及結果的測定。抗原、抗體反應后，直接測定反應液的吸光度值，省卻了 ELISA法反復孵育和洗板等煩瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結果，省時省力。此外，納米免疫比濁法操作步驟的簡化也相應地避免了許多人為操作因素和試齊U、環境等外界因素的干擾，穩定性和重復性都較好，能較真實地反映被測物質的含量。免疫比濁法的靈敏度雖然比ELISA法差一些，但足于檢測到健康人血漿中許多標志蛋白的下限值，可完全滿足臨床檢測要求。
[0005]由于血清胱抑素C的含量很低，其測定方法需要較高的靈敏度和特異性。由最初免疫電泳的定性檢測，到放射免疫、熒光免疫和酶免疫的定量檢測，以及到免疫比濁的自動化檢測，發展十分迅速。單向免疫擴散(SRID)、放射免疫測定法(RIA)、熒光免疫測定發(FIA)、時間分辨熒光免疫測定法(TRFIA)、酶聯免疫測定法(ELISA)、膠乳顆粒法、顆粒增強透射免疫比濁法(PETIA)、顆粒增強散射免疫比濁法(PENIA)。目前，膠乳顆粒增強比濁法是最為普遍通用的方法，但是膠乳顆粒增強比濁法最低檢出限只能達到0.lmg/1，線性只能達到8mg/l，在臨床應用上存在著局限性。
【發明內容】
[0006]本發明為了克服現有技術的不足，發明提供了一種胱抑素C的檢測試劑盒，以達到操作簡便、靈敏度高、特異性好，快速、測定結果準確可靠的目的。
[0007]為實現上述目的，本發明的技術方案如下:
一種胱抑素C的檢測試劑盒，其包括試劑Rl，試劑R2及校準品。[0008]所述試劑R1，其組分為:Tris 緩沖液 0.01-0.05mol/L, PEG6000 10_40g/L，NaN3
0.5-1.5g/L，氯化鈉 12-20g/L, pH 值 8.0-8.5。
[0009]所述R2試劑，其組分為:Tris緩沖液0.01-0.02mol/L,羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的聚苯乙烯膠乳顆粒0.5-3.0g/L, pH值7.0-7.4。
[0010]所述校準品為胱抑素C含量為0.1，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0mg/L的六個梯度標準品，溶液為0.01mol/L的Tris緩沖液。
[0011]進一步地，所述試劑Rl中，其組分優選為:Tris緩沖液0.01mol/L,PEG6000 25g/L, NaN3 1.0g/L，氯化鈉 16g/L，pH 值 8.2。
[0012]進一步地，所述試劑R2中，其組分優選為:Tris緩沖液0.01-0.02mol/L，羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的聚苯乙烯膠乳顆粒1.0g/L, pH值7.2。
[0013]在本發明優選的實施方案中，所述的羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的聚苯乙烯膠乳顆粒中，羊抗人胱抑素C多克隆抗體與聚苯乙烯膠乳的質量比為0.5:1-2 ;更優選的是
0.5:1,所述的聚苯乙烯膠乳優選為羧基聚苯乙烯膠乳顆粒。
[0014]進一步地，所述聚苯乙烯膠乳是粒徑為30_50nm的聚苯乙烯膠乳和粒徑為100-140nm的聚苯乙烯膠乳混合而成,粒徑為30_50nm的聚苯乙烯膠乳與粒徑為100_140nm的聚苯乙烯膠乳的質量比為1:3。
[0015]進一步地，聚苯乙烯膠乳與羊抗人胱抑素C多克隆抗體的包被采用物理吸附法或化學交聯法；更優選的是化學交聯法。在化學交聯包被中，采用活化劑對聚苯乙烯膠乳進行活化，所述活化劑為N，N’-羰基二咪唑(⑶I) 與聚苯乙烯膠乳中羧基的摩爾比為
0.5:1o
[0016]本發明的另一個目的是提供一種制備上述試劑盒的方法，具體步驟如下:
(1)試劑Rl的制備:在Tris緩沖液中加入相應重量的PEG6000和氯化鈉混勻后，再加入NaN3,調節pH值即得；
(2)試劑R2的制備:加入CDI對聚苯乙烯膠乳活化12min，18000g/min離心25min，棄上清，加PB緩沖液溶解，加羊抗人胱抑素C多克隆抗體室溫震蕩反應I小時，18000g/min離心25min,棄上清，加入0.01mol/L的Tris緩沖液即得；
(3)校準品的制備:分別去相應含量的胱抑素C加入到0.01mol/L的Tris緩沖液中，得終濃度為0.1, 0.5，1.0，2.0,4.0和8.0mg/L的六個梯度校準品。
[0017]本發明的胱抑素C的檢測試劑盒相較于現有技術，具有如下優勢:
1.采用兩種不同粒徑范圍的聚苯乙烯膠乳，兩者在特定比例范圍內使試劑盒靈敏度、精密度及線性均表現較好。
[0018]2.在抗體與膠乳的包被中采用化學偶連法，采用CDI做為聚苯乙烯膠乳的活化齊U，避免了傳統的活化劑EDC/NHS出現的膠乳顆粒制備后發生沉淀、穩定性不好的技術問題，并且提高的試劑盒的靈敏度、精密度及穩定性。
[0019]3.本發明的試劑盒組成簡單、穩定性好、準確度高。
[0020]綜上所述，本發明的胱抑素C的檢測試劑盒具有靈敏度高、特異性好、準確性高、抗干擾能力強及線性好等優點。
【具體實施方式】[0021 ] 下面通過實施例進一步詳細描述本發明，但本發明不僅僅局限于以下實施例。
[0022]實施例1
試劑Rl的制備:在Tris緩沖液中加入相應重量的PEG6000和氯化鈉混勻后，再加入NaN3，調節pH值即得；試劑Rl的組分為:
【權利要求】
1.一種胱抑素C的檢測試劑盒，其特征在于，其包括試劑R1，試劑R2及校準品；具體組成如下:
試劑 R1，其組分為:Tris 緩沖液 0.01-0.05mol/L,PEG6000 10_40g/L，NaN3 0.5-1.5g/L,氯化鈉 12-20g/L, pH 值 8.0-8.5 ； R2試劑，其組分為=Tris緩沖液0.01-0.02mol/L,羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的聚苯乙烯膠乳顆粒0.5-3.0g/L, pH值7.0-7.4 ； 校準品為胱抑素C含量為0.1, 0.5，1.0，2.0,4.0和8.0mg/L的六個梯度標準品，溶液為0.01mol/L的Tris緩沖液。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl中，其組分優選為:Tris 緩沖液 0.01mol/L, PEG6000 25g/L, NaN3 1.0g/L,氯化鈉 16g/L, pH 值 8.2。
3.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑R2中，其組分優選為=Tris緩沖液0.01-0.02mol/L,羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的聚苯乙烯膠乳顆粒1.(^/1，？11值7.2。
4.根據權利要求1或3任一項所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的聚苯乙烯膠乳顆粒中，羊抗人胱抑素C多克隆抗體與聚苯乙烯膠乳的質量比為0.5:1-2。
5.根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述羊抗人胱抑素C多克隆抗體與聚苯乙烯膠乳的質量比優選為0.5:1。
6.根據權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，聚苯乙烯膠乳與羊抗人胱抑素C多克隆抗體的包被采用物理吸附法或化學交聯法。
7.根據權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，聚苯乙烯膠乳與羊抗人胱抑素C多克隆抗體的包被更優選采用化學交聯法，所述的聚苯乙烯膠乳優選為羧基聚苯乙烯膠乳。
8.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述化學交聯法中，采用活化劑對聚苯乙烯膠乳進行活化，活化劑為N，N’ -羰基二咪唑；N，N’ -羰基二咪唑與所述羧基聚苯乙烯膠乳中羧基的摩爾比為0.5:1。
9.一種制備權利要求8所述的檢測試劑盒的方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)試劑Rl的制備:在Tris緩沖液中加入相應重量的PEG6000和氯化鈉混勻后，再加入NaN3,調節pH值即得； (2)試劑R2的制備:加入CDI對聚苯乙烯膠乳活化12min，18000g/min離心25min，棄上清，加PB緩沖液溶解，加羊抗人胱抑素C多克隆抗體室溫震蕩反應I小時，18000g/min離心25min,棄上清，加入0.01mol/L的Tris緩沖液即得； (3)校準品的制備:分別去相應含量的胱抑素C加入到0.01mol/L的Tris緩沖液中，得終濃度為0.1, 0.5，1.0，2.0,4.0和8.0mg/L的六個梯度校準品。
【文檔編號】G01N33/68GK103645323SQ201310333960
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2013年8月2日
【發明者】陳青松, 張偉林, 韓鐘 申請人:浙江夸克生物科技有限公司