一種檢測嘔吐毒素的試紙條及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測嘔吐毒素的試紙條及其應用。試紙條包括樣品吸收墊（1）、結合物釋放墊（2）、反應膜（3）、吸水墊（4）和底板（7），所述反應膜上具有包被有嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線（5）和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線（6），所述結合物釋放墊（2）噴涂有嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物。本發明還提供了一種應用上述嘔吐毒素試紙條檢測谷物及飼料中嘔吐毒素殘留的方法。本發明所提供的試紙條具有操作簡單、靈敏度高、檢測速度快、成本低等特點，適合大量樣本的篩查和現場監控。
【專利說明】-種檢測嘔吐毒素的試紙條及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測嘔吐毒素的試紙條及其應用，具體涉及一種用于檢測嘔吐毒 素的膠體金試紙條，其特別適用于谷物及飼料中嘔吐毒素殘留的檢測。
【背景技術】
[0002] 嘔吐毒素（vomitoxin)又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON)，是單 端孢菌素烯烴中的一種，它通常是由生長在谷類物品（如小麥、玉米、大麥和秣草）霉菌鐮紅 菌素生成的。嘔吐毒素的毒性效應包括：嘔吐、不想進食、胃腸炎、腹瀉、免疫抑制和血液病。
[0003] DON廣泛存在于全球，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人 和動物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產生廣泛的毒性效應。近年來發現DON可能 與人類食管癌、IgA腎病有關，對人類及動物的健康構成威脅。人畜攝入了被DON污染的食 物/飼料后，會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發燒、站立不穩、反應遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時損 咅造血系統造成死亡。研究表明，DON可能對免疫系統有影響，有明顯胚胎毒性和一定致崎 作用，可能有遺傳毒性，但無致癌、致突變作用。由于DON的危害嚴重，引起了各國的普遍重 視。谷物及飼料中DON的含量有嚴格的限量標準。我國谷物、豬配合飼料、犢牛配合飼料、 泌乳期動物配合飼料中DON的限量標準為1.0mg/kg，牛配合飼料、家禽配合飼料中DON 的限量標準為5. 0mg/kg。
[0004] 目前檢測嘔吐毒素的方法有多種，如薄層色譜法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA)、氣 相色譜、高效液相色譜、紅外光譜分析等。其中，儀器法靈敏、準確，但需要昂貴的儀器、樣品 的前處理復雜、繁瑣費時、檢測的成本較高，不能現場操作，而且需專業人員操作，所以限制 了其應用。因此，針對現有嘔吐毒素檢測技術上的不足，我們設計了一種用膠體金免疫層析 技術檢測谷物及飼料中嘔吐毒素的方法，該方法特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本 低、適合于批量樣品的篩選檢測，是理想的快速篩選手段，能夠更好地滿足我國谷物及飼料 企業、政府職能監管部門等開展檢測工作。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種靈敏度高、操作簡單、成本低、檢測時間短的嘔吐毒素殘 留檢測試紙條。
[0006] 本發明所提供的檢測嘔吐毒素殘留的試紙條，包括樣品吸收墊（1)、結合物釋放墊 (2)、反應膜（3)、吸水墊（4)和底板（7);所述反應膜上具有包被有嘔吐毒素半抗原-載體蛋 白偶聯物的檢測線（5 )和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線（6 )，所述結合物釋放墊（2 )噴涂有 嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物。
[0007] 所述嘔吐毒素半抗原_載體蛋白偶聯物是由嘔吐毒素半抗原與載體蛋白偶聯得 至IJ，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
[0008] 所述嘔吐毒素單克隆抗體是以嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物作為免疫原制 備獲得，是由嘔吐毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌獲得；所述羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗 體免疫羊得到。
[0009] 所述樣品吸收墊（1)、結合物釋放墊（2)、反應膜（3)、吸水墊（4)依次粘貼在底板 (7)上，所述結合物釋放墊1/3~1/2被覆蓋于樣品吸收墊下。
[0010] 所述底板可為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或 濾油紙；所述結合物釋放墊可為玻璃棉或聚酯材料；所述吸水墊為吸水紙；所述反應膜可 為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
[0011] 本發明的另一個目的是提供一種制備上述試紙條的方法，其包括步驟：
[0012] 1)制備噴涂有嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊；
[0013] 2)制備具有包被有嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠 抗抗體的質控線的反應膜；
[0014] 3)將1)和2)制備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成 試紙條。
[0015] 具體地說，步驟包括：
[0016] 1)半抗原制備：將嘔吐毒素與鄰苯二甲酸酐反應得到嘔吐毒素半抗原；
[0017] 2)將嘔吐毒素半抗原與載體蛋白偶聯，得到嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物；
[0018] 3)用嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物免疫小鼠，將小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞通 過融合、篩選，得到嘔吐毒素單克隆雜交瘤細胞株；
[0019] 4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；
[0020] 5)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；
[0021] 6)將步驟3)制備的嘔吐毒素單克隆抗體加入步驟5)制備的膠體金中，得到嘔吐 毒素單克隆抗體-膠體金標記物；
[0022] 7)將嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物噴涂在結合物釋放墊上，37°C烘Ih后取 出，置于干燥環境中保存備用；
[0023] 8)將嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物包被在反應膜上構成檢測線，將羊抗鼠抗 抗體包被在反應膜上構成質控線；
[0024] 9)將樣品吸收墊用含0. 5%牛血清白蛋白（體積分數)、pH為7. 2、0.lmol/L磷酸鹽 緩沖液浸泡2h，37°C下烘干2h;
[0025] 10)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊，樣品吸收 墊蓋住結合物釋放墊，最后切成3mm寬的小條，加塑料盒，真空包裝，4~30°C條件下可保存 12個月。
[0026] 本發明的另一個目的是提供一種應用上述試紙條檢測谷物及飼料中嘔吐毒素殘 留的方法，它包括步驟：
[0027] (1)樣品前處理；
[0028] (2)用試紙條進行檢測；
[0029] (3)分析檢測結果。
[0030] 本發明的嘔吐毒素快速檢測試紙條采用高度特異性的抗體抗原反應及競爭抑制 免疫層析分析技術，將嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物固定于結合物釋放墊上，樣品 中的嘔吐毒素在流動過程中，與結合物釋放墊上的嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物結 合，形成藥物-抗體-膠體金標記物。樣本中的藥物與反應膜檢測線上的嘔吐毒素半抗 原-載體蛋白偶聯物競爭結合嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物，根據檢測線紅色條帶 有無或顏色深淺來判斷待測樣品液中是否含有嘔吐毒素殘留。
[0031] 檢測時，樣品經處理后滴入試紙條孔內，當嘔吐毒素在樣品中的濃度低于檢測限 或為零時，單克隆抗體-膠體金標記物在層析過程中會與固定在反應膜上的嘔吐毒素半抗 原-載體蛋白偶聯物結合，在檢測線（T)和質控線（C)內各出現一條紅色條帶；如果嘔吐 毒素在樣品中的濃度等于或高于檢測限，單克隆抗體_膠體金標記物會與嘔吐毒素全部結 合，從而在T線處因為競爭反應不會與嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物結合而不出現紅 色條帶。如圖2所示。
[0032] 陰性：當質控線（C)顯示出紅色條帶，檢測線（T)同時也顯示出紅色條帶，判為陰 性。
[0033] 陽性：當質控線（C)顯示出紅色條帶，而檢測線（T)不顯色，判為陽性。
[0034] 無效：當質控線（C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測線（T)顯示出紅色條帶與否， 該試紙條均判為無效。
[0035] 本發明的試紙條具有靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各 種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點。用本發明試紙條檢測嘔吐毒素殘留的方法簡便、 快速、直觀、準確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036] 圖1為試紙條剖面結構示意圖。
[0037] 圖2為試紙條檢測結果判定圖。
[0038] 圖3為嘔吐毒素半抗原合成圖。
[0039] 圖4為嘔吐毒素半抗原核磁共振氫譜圖。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明，而不用來限制本發明的范圍。
[0041] 實施例1嘔吐毒素檢測試紙條的制備
[0042] 該試紙條的制備方法主要包括以下步驟：
[0043]1)制備噴涂有嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊；
[0044] 2)制備具有包被有嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠 抗抗體的質控線的反應膜；
[0045] 3)將1)和2)制備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和PVC底板組 裝成試紙條。
[0046] 下面分步詳細敘述：
[0047] 1、嘔吐毒素半抗原的制備
[0048] 30mg嘔吐毒素、60mg鄰苯二甲酸酐和0.ImL批陡在5mlDMSO中的混合液,在 80°C下攪拌反應15h，蒸除溶劑，柱層析純化得到鄰苯二甲酸單嘔吐毒素酯，得率55%，合成 路線如圖3。
[0049] 取上述產物經核磁共振氫譜測定，如圖4所示，7. 9和8. 2ppm附近增加的兩組芳 環信號峰，以及13. 3ppm左右增加的羧基信號峰，說明目標半抗原合成成功。
[0050] 2、免疫原的制備
[0051] 取8mg半抗原，溶解于0.8ml二甲基甲酰胺（DMF)中；取20mg碳化二亞胺（EDC) 用0. 2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液A;稱取BSA 3611^，使之充分溶解在311110.1111〇1/108(口119.6)中，將反應液4逐滴緩慢滴加到蛋白溶 液中，并于室溫下攪拌24h，用0.Olmol/LPBS4°C透析3d，每天換3次透析液，得到免疫原。
[0052] 3、包被原的制備
[0053] 取8mg半抗原，溶解于0? 8ml二甲基甲酰胺（DMF)中；取20mg碳化二亞胺（EDC)用 0. 2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液A;稱取0VA36mg， 使之充分溶解在3mlO.lmol/LCB(pH9.6)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中， 并于室溫下攪拌24h，用0. 01mol/LPBS4°C透析3d，每天換3次透析液，得到包被原。
[0054] 4、嘔吐毒素單克隆抗體的制備
[0055] (1)動物免疫
[0056] 將步驟2得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內，免疫劑量為150iig/只，使其產生 抗血清。
[0057] (2)細胞融合和克隆化
[0058] 取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按8:1 (數量配比）比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采 用間接競爭ELISA法測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化， 直到得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0059] (3)細胞凍存和復蘇
[0060] 將雜交瘤細胞用凍存液制成IXIO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇 時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。
[0061] (4)單克隆抗體的制備與純化
[0062] 增量培養法：將雜交瘤細胞置于細胞培養基中，在37°C條件下進行培養，用辛 酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，-20°C保存。
[0063] 所述細胞培養基為向RPMI1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清 在細胞培養基中的終濃度為20%(質量分數)，碳酸氫鈉在細胞培養基中的終濃度為0. 2%(質 量分數）；所述細胞培養基的PH為7. 4。
[0064] 5、羊抗鼠抗抗體的制備
[0065] 以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗 抗體。
[0066] 6、嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物的制備
[0067] (1)膠體金的制備
[0068] 用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0. 01% (質量分數)，取IOOrnl置于錐形瓶中， 用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續高溫、持續攪拌下加入2. 5ml1%檸檬酸三鈉，繼續 勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復到原體積，4°C保 存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。
[0069] (2)嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物的制備
[0070] 在磁力攪拌下，用0? 2mol/L碳酸鉀溶液調膠體金的pH值至7. 0,按每毫升膠體 金溶液中加入2(T50iig的標準向膠體金溶液中加入嘔吐毒素單克隆抗體，繼續攪拌混勻 30min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積分數)，靜置lOmin。12000r/ min、4 °C離心4Omin，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積 1/10的復溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。
[0071] 復溶緩沖液：含酪蛋白0. 029T0. 1%(質量分數)、吐溫-80 0 . 059T0. 2%(質量分數)、 pH7. 2的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0072] 7、結合物釋放墊的制備
[0073] 將結合物釋放墊浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在緩沖液中的濃度為 0.5%)411為7.2、0.5111〇1/1的磷酸鹽緩沖液中，均勻浸濕111，371：烘311備用。用18(^1(^噴 膜儀將制備好的嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物均勻噴涂在結合物釋放墊上，每Icm 結合物釋放墊噴涂〇.Olml嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物后，置于37°C環境中(濕度 < 20%) 60min后取出，置于干燥環境(濕度< 20%)中保存備用。
[0074] 8、反應膜的制備
[0075] 將嘔吐毒素半抗原-卵清蛋白偶聯物包被到反應膜上構成檢測線，將羊抗鼠抗抗 體包被在反應膜上構成質控線。
[0076] 包被過程：用磷酸緩沖液將嘔吐毒素半抗原-卵清蛋白偶聯物稀釋到10mg/ml， 用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線（T線)，包被量為0? 8iU/cm;用 0? 01mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200iig/ml，用Isoflow點膜儀 將其包被于硝酸纖維素膜上的質控線（C線)，包被量為I.OiU/cm。將包被好的反應膜置于 37°C條件下干燥2h，備用。
[0077] 9、樣品吸收墊的制備
[0078] 將樣品吸收墊置于含0. 5%牛血清白蛋白（體積分數)、pH7. 2、0.lmol/L磷酸鹽緩 沖液中浸泡2h，37°C烘2h備用。
[0079] 10、試紙條的組裝
[0080] 將樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊依次按順序粘貼在PVC底板上；結 合物釋放墊從起始端有1/3區域被樣品吸收墊覆蓋，結合物釋放墊的末端與反應膜的始端 連接，反應膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與PVC底板的始端對齊，吸水 墊的末端與PVC底板的末端對齊；所述反應膜上有檢測線和質控線，檢測線（T線)和質控線 (C線）均為與所述試紙條的長相垂直的條狀帶；檢測線位于靠近結合物釋放墊的末端的一 偵h質控線位于遠離結合物釋放墊的末端的一側；將試紙條用機器切成3_寬的小條，裝在 特制的塑料制卡中，4~30°C條件下可保存12個月。
[0081] 實施例2樣品中嘔吐毒素殘留的檢測
[0082] 1、樣品的前處理
[0083] 稱取3. 0±0. 05g粉碎的谷物/飼料樣品至15ml或50ml聚苯乙烯離心管中。加 入6ml乙腈，將瓶塞蓋緊，振蕩5min;室溫（20-25°C)，3000g以上離心5min。移取Iml上清 液到玻璃離心管中，于5(T60°C水浴氮氣流或空氣流下吹干。加入0. 4ml樣品復溶液，渦動 30s，待檢。
[0084] 2、用試紙條進行檢測
[0085] 用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加3滴于加樣孔，液體流動時開始計時，反應 5~10min，判定結果。
[0086] 3、分析檢測結果
[0087] 陰性（_):T線和C線都顯色，表示樣品中嘔吐毒素濃度低于檢測限，如圖2 (a)。
[0088] 陽性（ + ):T線無顯色C線顯色，表示樣品中嘔吐毒素濃度等于或高于檢測限，如圖 2 (b)。
[0089] 無效：未出現C線，表明不正確的操作過程或試紙條已變質失效，如圖2 (c)。在 此情況下，應再次仔細閱讀說明書，并用新的試紙條重新測試。
[0090] 實施例3樣品檢測實例
[0091] 1、檢測限試驗
[0092] 取空白谷物及飼料樣本，在其中分別添加嘔吐毒素至終濃度為0. 5、l、2yg/g，取 試紙條進行檢測,每個樣本重復測定三次。
[0093] 用試紙條檢測谷物及飼料樣本時，當其中嘔吐毒素添加濃度為0. 5g/g時，試紙 條上顯示出肉眼可見的兩條紅色線條，呈陰性；當其中嘔吐毒素添加濃度為l、2i!g/g時， 試紙條質控線顯色，檢測線不顯色，呈陽性，表明本試紙條對谷物及飼料中嘔吐毒素的檢測 限為IUg/g。
[0094] 2、假陽性率、假陰性率試驗
[0095] 取已知嘔吐毒素含量大于IUg/g的谷物及飼料陽性樣本各20份和含量小于 IUg/g的谷物及飼料陰性樣本各20份，用三批試紙條進行檢測，計算其陰陽性率。結果見 表1,表2。
[0096] 表1谷物檢測樣本結果
[0097]
【權利要求】
1. 一種檢測嘔吐毒素的試紙條，包括樣品吸收墊（I)、結合物釋放墊（2 )、反應膜（3 )、 吸水墊（4 )和底板（7 )，其特征在于所述反應膜上具有包被有嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶 聯物的檢測線（5 )和包被有羊抗鼠抗抗體的質控線（6 )，所述結合物釋放墊（2 )噴涂有嘔吐 毒素單克隆抗體-膠體金標記物。
2. 如權利要求1所述的試紙條，其特征在于所述樣品吸收墊（1)、結合物釋放墊（2)、反 應膜（3 )、吸水墊（4 )依次粘貼在底板（7 )上。
3. 如權利要求1-2任一項所述的試紙條，其特征在于所述結合物釋放墊1/3~1/2被覆 蓋于樣品吸收墊下。
4. 如權利要求1所述的試紙條，其特征在于所述嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物由 嘔吐毒素半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍蛋 白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
5. 如權利要求1或4任一項所述的試紙條，其特征在于所述嘔吐毒素半抗原是由嘔吐 毒素與鄰苯二甲酸酐反應得到，其分子結構式為：
6. 如權利要求1所述的試紙條，其特征在于所述嘔吐毒素單克隆抗體是以嘔吐毒素半抗 原-載體蛋白偶聯物作為免疫原制備獲得，所述羊抗鼠抗抗體是將鼠源抗體免疫羊得到。
7. -種制備權利要求1-6任一項所述試紙條的方法，其包括步驟： 1) 制備噴涂有嘔吐毒素單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊； 2) 制備具有包被有嘔吐毒素半抗原-載體蛋白偶聯物的檢測線和包被有羊抗鼠抗抗 體的質控線的反應膜； 3) 將1)和2)制備好的結合物釋放墊、反應膜與樣品吸收墊、吸水墊和底板組裝成試紙 條。
8. -種檢測谷物及飼料中嘔吐毒素殘留的方法，其包括步驟： 1) 樣本前處理； 2) 用權利要求1-6任一項所述的試紙條進行檢測； 3) 分析檢測結果。
【文檔編號】G01N33/532GK104345145SQ201310329001
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月31日 優先權日:2013年7月31日
【發明者】馮才偉, 扶勝, 楊學林, 賈芳芳, 景瀅瀅, 聶雯瑩, 馮靜, 孫震 申請人:北京勤邦生物技術有限公司