酶電極的制作方法

            文檔序號:6171936閱讀:572來源:國知局
            酶電極的制作方法
            【專利摘要】本發明涉及酶電極。本發明提供一種酶電極,是包含擔載有以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(GDH)的碳粒子和與上述碳粒子接觸的電極層的酶電極,其特征在于,上述碳粒子和/或上述電極層包含粒徑100nm以下且比表面積至少200m2/g以上的碳粒子。
            【專利說明】酶電極
            [0001]本發明申請是PCT專利申請PCT/JP2008/002573、申請日為2008年9月18日、發明名稱為“酶電極”的發明專利申請的分案申請,母案進入中國的申請號為200880107747.X。
            【技術領域】
            [0002]本發明涉及擔載有含有葡萄糖脫氫酶的油墨的酶電極、特別是作為葡萄糖傳感器使用的酶電極、用于制造該酶電極的油墨及該酶電極的制造方法。
            【背景技術】
            [0003]酶電極通常是指在金電極、鉬電極、碳電極等電極表面上擔載有酶的電極。酶電極被廣泛用作利用酶的反應特異性、特異性地檢測各種生理活性物質的生物傳感器。特別是可以作為用于測定作為對糖尿病重要的標記的血中葡萄糖濃度的葡萄糖傳感器使用。
            [0004]作為酶電極中使用的氧化還原酶,例如有以葡萄糖脫氫酶(GDH)為代表的脫氫酶、及以葡萄糖氧化酶(GOD)為代表的氧化酶。GOD有以下優點:對葡萄糖的基質特異性高,熱穩定性優異,能夠大量生產酶,所以生產成本比其他酶便宜。另外,使用了 GDH的體系不易受到測定樣品中的溶解氧的影響,所以即使在氧分壓低的環境下進行測定、或測定要求大量酶的高濃度樣品時,也可以精度良好地測定葡萄糖。
            [0005]將上述氧化還原酶應用于酶電極時,存在電極的應答電流值低的問題。于是,本發明的發明人等為了提高電極的應答電流值,提出了具有電子媒介和電子傳遞蛋白質的酶電極(參見下述專利文獻2)。
            [0006]電子媒介是指能夠介導由氧化還原酶向電極的電子傳遞的非蛋白質性金屬配位化合物、有機化合物等氧化還原物質,例如可以舉出鐵氰化鉀、吩嗪硫酸甲酯、二茂合鐵及它們的衍生物。
            [0007]電子傳遞蛋白質是指能夠在生物體的氧化還原體系中,由施電體接受電子而被還原,然后將電子傳遞給受電體而被氧化的蛋白質。作為電子傳遞蛋白質的例子,可以舉出細胞色素b、細胞色素C,優選細胞色素b562等。
            [0008]在專利文獻I中,通過將電子傳遞蛋白質與氧化還原酶一同固定在電極上,可以促進從氧化還原酶向電極的、或向電子媒介的電子傳遞,由此可以得到應答電流值高的酶電極。
            [0009]使用上述酶電極的葡萄糖濃度測定通常在恒溫池內放入緩沖液,加入輔酶、CaCl2及電子媒介,維持在一定溫度后,作為作用電極,使用例如在碳電極上固定了酶的酶電極,使用對電極(例如鉬電極)及參考電極(例如Ag/AgCl電極)。對上述碳電極施加一定的電壓,電流恒定后,加入含葡萄糖的試樣測定電流的增加。
            [0010]由此,上述現有方法必須將電子媒介包含在電極內或固定在電極表面、或作為水溶液加入到恒溫池中,還必須與氧化還原酶分開準備電子媒介。因此,工藝復雜,大量生產化存在成本方面的難點。[0011]專利文獻1:特開2003-121407號公報
            [0012]專利文獻2:國際公開02/73181號小冊子
            [0013]專利文獻3:國際公開2005/023111號小冊子

            【發明內容】

            [0014]發明解決的課題
            [0015]本發明的目的在于提供不使用電子媒介、不比使用電子媒介時遜色、特別是作為葡萄糖傳感器使用時能夠得到高應答電流值、且還能夠得到寬的動態范圍的酶電極。
            [0016]用于解決課題的手段
            [0017]在本發明中,作為用于測量葡萄糖的傳感器,使用包含擔載有葡萄糖脫氫酶的碳粒子、和與上述碳粒子接觸的電極層的酶電極時,通過使上述碳粒子和/或構成上述電極層的碳粒子的粒徑為IOOnm以下且比表面積為至少200m2/g以上,上述電極層和擔載有葡萄糖脫氫酶的碳粒子之間、或構成電極層的碳粒子和擔載有葡萄糖脫氫酶的碳粒子之間的電子移動順利進行,使其發揮作為酶電極的功能。
            [0018]S卩,本發明在如上所述構成的酶電極中,無論與擔載有葡萄糖脫氫酶的碳粒子接觸的電極材料的形狀.大小如何,均可通過調整擔載有葡萄糖脫氫酶的碳粒子的粒徑及比表面積,提聞應答電流。
            [0019]另外,本發明在如上所述構成的酶電極中,通過使用碳粒子作為與擔載有葡萄糖脫氫酶的碳粒子接觸的電極材料,同時還調整其粒徑及比表面積,能夠進一步提高應答電流。
            [0020]本發明的具體構成如下所述。
            [0021](I) 一種酶電極,是包含擔載有以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(GDH)的碳粒子、和與上述碳粒子接觸的電極層的酶電極,其特征在于,上述碳粒子和/或上述電極層包含粒徑為IOOnm以下且比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子。
            [0022](2)上述(I)所述的酶電極,其中,上述葡萄糖脫氫酶(⑶H)為氧化還原酶催化亞單位或氧化還原催化亞單位和電子傳遞亞單位的復合體。
            [0023]( 3 )上述(I)或(2 )所述的酶電極,其中,上述電極層包含金屬。
            [0024](4)上述(3)所述的酶電極,其中,上述包含金屬線。
            [0025](5)上述(I)?(4)中的任一項所述的酶電極,其中,所述酶電極作為葡萄糖傳感器使用。
            [0026](6)用于在酶電極中使用的油墨材料,其特征在于,包含以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(⑶H)和IOOnm以下且比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子。
            [0027](7)上述(6)所述的油墨材料,其中,上述葡萄糖脫氫酶(⑶H)是氧化還原酶催化亞單位或氧化還原酶催化亞單位和電子傳遞亞單位的復合體。
            [0028](8) 一種酶電極的制造方法,其特征在于,將上述(6)或(7)所述的油墨材料涂布在電極層的表面后,使其干燥。
            [0029]本發明的特征在于使用的擔載有以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(GDH)的碳粒子的粒徑小、比表面積大,優選粒徑為IOOnm以下、更優選粒徑為50nm以下、且比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子。作為上述碳粒子,例如可以舉出市售的科琴黑(粒徑34nm、比表面積1400m2/g)、烏爾康(vulcan)(粒徑30nm、比表面積254m2/g)及包含科琴黑的Lionpaste (Lion公司商標)等。
            [0030]在本發明中,與上述碳粒子一同混合以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(本說明書中,稱為“FADGDH”)制作構成酶電極的油墨材料。油墨材料可以通過在碳粒子、例如、科琴黑中加入溶劑、例如丙醇水溶液充分混合進行制造。
            [0031 ] 在本發明中,通常,酶電極通過將上述油墨材料涂布在電極層上制作酶電極。
            [0032]本發明中使用的電極層可以使用碳粒子或金屬。碳粒子沒有特別限定,優選粒徑小、比表面積大的碳粒子,更優選粒徑為IOOnm以下、更優選粒徑為50nm以下且比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子。作為上述碳粒子,例如可以舉出市售的科琴黑(粒徑34nm、t匕表面積1400m2/g)、烏爾康(粒徑30nm、比表面積254m2/g)及含科琴黑的Lionpaste (Lion公司商標)等。使用金屬時,可以優選使用金屬線,更優選使用金或不銹鋼的線。
            [0033]本發明中使用的葡萄糖脫氫酶可以是天然氧化還原酶的一部分被化學改變的改變型氧化還原酶。上述改變型酶可以通過例如將蛋白質的I個或I個以上氨基酸殘基用其他天然或天然中不存在的氨基酸殘基置換、或者缺失或加成I個或I個以上氨基酸而制造。
            [0034]本發明的酶電極通過如上所述同時調整擔載有葡萄糖脫氫酶的碳粒子的粒徑及比表面積,在電子移動至電極層時不需要電子媒介。本發明中使用的葡萄糖脫氫酶從功能方面考慮,包含:具有葡萄糖脫氫活性的催化劑活性亞單位、和包含用于將由上述催化亞單位供給的電子給與電極層的電子傳遞蛋白質的電子傳遞亞單位。此時,在本發明中,作為氧化還原酶,可以僅使用催化亞單位,也可以使用催化亞單位和電子傳遞亞單位的復合體。
            [0035]催化亞單位發揮從試樣中的葡萄糖獲取電子、將該電子供給電子傳遞亞單位的作用,優選使用以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的FADGDH催化亞單位。因此,經由還原型FAD,從催化亞單位對電子傳遞亞單位供給電子。
            [0036]催化亞單位的含量是例如換算為活性相當于5~IOOU的量。此處,酶I單位(IU)對每個酶其定義是已知的,例如為GDH的情況下,定義為在標準檢定條件(pH6.0、37°C)下在DCIP的吸收波長600nm下經時檢測基于DCIP (2,6- 二氯靛酚)的還原的退色時,每I分鐘氧化I μ M葡萄糖的量(摩爾吸光系數為4.76X1000 μ M/cm)ο
            [0037]FADGDH只要是具有葡萄糖脫氫活性的催化亞單位或作為FADGDH復合體在上述催化亞單位上結合了電子傳遞亞單位的催化亞單位即可,沒有特別限定,其中優選使用洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia),特別優選使用洋蔥伯克霍爾德菌KSl株(本說明書中稱為“KS1株”)。
            [0038]KSl株是從溫泉附近的土壤中分離的新菌株,根據其菌學性質鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌,在平成12年9月25日以微生物保藏編號第FERMBP-7306保藏在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566日本茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)。KSl株的詳細情況公開在國際公開W002/36779號公報,可以產出包含為催化亞單位的α亞單位(分子量約60kDa)、相當于為電子傳遞亞單位的細胞色素C的β亞單位(分子量約43kDa)及Y亞單位(分子量約14kDa)的⑶H。其中,分子量是在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中測定的。
            [0039]為了制造本發明的酶電極,將葡萄糖脫氫酶或其復合體與碳粉末一起充分混合安裝在電極上。為了將葡萄糖脫氫酶或其復合體固定在碳粒子上,如上所述安裝在電極上后,例如用戊二醛等二交聯性試劑進行交聯處理。或者也可以使用固體高分子電解質進行固定。作為固體高分子電解質,最常使用的是Nafion。可以將以Nafion為代表的固體高分子電解質溶解在異丙醇等溶劑中,將其滴在吸附或涂布干燥了酶的酶膜上,或者與酶一同混合Nafion溶液進行干燥,由此制作酶固定化膜。
            [0040]本發明的酶電極原則上不通過電子媒介進行動作,但是也不排除這種情況。使用電子媒介時,沒有特別限定,例如可以使用鐵氰化鉀、吩嗪硫酸甲酯、釕配位化合物等。
            [0041]將本發明的酶電極作為葡萄糖傳感器使用時,將上述酶電極用作工作電極。作為對電極,例如可以使用鉬電極,作為參考電極,例如可以使用Ag/AgCl電極。在恒溫池中放入緩沖液,裝置上述電極,對工作電極施加一定的電壓,電流恒定后,在恒溫池內加入包含葡萄糖的試樣,測定電流的增加。可以按照通過標準濃度的葡萄糖溶液制作的標準曲線,計算試樣中的葡萄糖濃度。
            [0042]另外,作為葡萄糖傳感器使用時,也可以采用下述構成:例如可以連續測定葡萄糖濃度,連續進行多次葡萄糖測定。此時,葡萄糖傳感器的構成為:還具備用于從皮下組織采集血液或間質液的采集要素,使通過采集要素采集的血液或間質液接觸電極。
            [0043]上述葡萄糖傳感器也可以構成為將電極的至少一部分埋入皮下組織進行使用。此時,電極被形成在絕緣基板上。
            [0044]本發明的酶電極可以作為酶燃料電池的陽極使用。此時,可以將基于酶的基質特異性的物質作為燃料。陰極可以使用擔載有鉬的碳電極、鉬電極等,可以構筑無隔板的酶燃料電池。作為反應溶液,可以使用磷酸緩沖液等普通緩沖液,進而也可以在體液中使用。可以通過改變施加在外部電路上的電阻值,調整電動勢。
            【專利附圖】

            【附圖說明】
            [0045][圖1]表示FADGDH酶固定化層使用科琴黑/電極層使用科琴黑時的葡萄糖濃度與電流值的相關。
            [0046][圖2]表示FADGDH酶固定化層使用碳糊/電極材料使用科琴黑時的葡萄糖濃度與電流值的相關。
            [0047][圖3]表示FADGDH酶固定化層使用科琴黑/電極材料使用碳糊時的葡萄糖濃度與電流值的相關。
            [0048][圖4]表示FADGDH酶固定化層使用碳糊/電極材料使用碳糊時的葡萄糖濃度與電流值的相關。
            [0049][圖5]表示FAD⑶H酶固定化層使用科琴黑、Lionpaste、烏爾康及DENKABLACK/電極材料使用玻璃碳時的葡萄糖濃度和電流值的相關。
            [0050][圖6]表示酶固定化層的碳粒子的比表面積和應答電流值的相關。
            [0051][圖7]表示FAD⑶H酶固定化層使用Lionpaste(W-311N,W-370)/電極材料使用玻璃碳時的葡萄糖濃度和電流值的相關。
            [0052][圖8]表示FADGDH酶固定化層使用烏爾康/電極材料使用烏爾康時的葡萄糖濃度和電流值的相關。
            [0053][圖9]表示FAD⑶H酶固定化層使用Lionpaste(W-311N)/電極材料使用金線時的葡萄糖濃度和電流值的相關。
            [0054][圖10]表示FAD⑶H酶固定化層使用Lionpaste(W-311N) /電極材料使用不銹鋼線時的葡萄糖濃度和電流值的相關。
            [0055][圖11]表示FAD⑶H酶固定化層使用Lionpaste(W-311N) /電極材料使用不銹鋼制一體型電極時的葡萄糖濃度和電流值的相關。
            [0056][圖12]表示碳粒子擔載在聚合物基板上制作的市售電極。
            [0057][圖13]表示在圖12所示的電極上涂布酶油墨制作的酶電極上滴下含葡萄糖的試樣、施加電位后的應答曲線。
            [0058][圖14]表示在圖13所示的應答曲線中,試樣中的葡萄糖濃度和電位施加后5秒后的電流值的相關。
            【具體實施方式】
            [0059]以下,作為實施例詳細說明本發明,但本發明不限定于下述實施例。
            [0060]作為電極層使用碳粒子時的實施例
            [0061]首先,給出電極層、酶層均使用碳粒子時的實施例。
            [0062]實施例1
            [0063]作為碳粒子,準備粒徑為34nm、比表面積為1400m2/g、空隙率為78vol%的科琴黑(以下稱為 KB)。在 IOOmgKB 中加入 400 μ IMilliQ 水、lml5%Nafion (1-丙醇 48% 水溶液),充分混合后,靜置3日制成KB油墨,在10 μ IKB油墨中混合10 μ IlOOmMp.p.b.(pH7.0)、40 μ 18.4U/mlFAD⑶H制成FAD⑶Η/KB油墨。在作為電極材料填充了 KB的一體型電極(Φ0.4mm)中按25U/mm2滴加FAD⑶Η/KB油墨,在4°C下干燥2小時。以制作的酶電極為工作電極,以Pt為對電極,以Ag/AgCl參考電極為參考電極。采用3電極方式,以IOmllOOmMp.p.b.(pH7.0)為反應溶液,測定施加+250mVvs.Ag/AgCl的電位時伴隨葡萄糖添加的應答電流值,結果示于圖1。以250rpm攪拌反應溶液,在37°C下進行測定。從在各葡萄糖濃度下測定的電流值中減去葡萄糖為OmM時得到的電流值作為應答電流值。
            [0064]如圖1所示,通過慢慢提高葡萄糖濃度,觀測到的電流值增加。葡萄糖的終濃度55mM下的應答電流值分別約為1500nA。5mM葡萄糖的電流密度為6998nA/mm2。如果使用滿足粒徑為IOOnm以下且比表面積為至少200m2/g以上的KB碳粒子,則能夠得到充分的應答電流值。
            [0065]比較例I
            [0066]作為碳粒子,代替KB,使用粒徑為7000nm、比表面積為lm2/g的CP,按與實施例1相同的程序制作酶電極。即,在IOOmgCP中加入400 μ IMilliQ水、lml5%Nafion (1-丙醇48%水溶液),充分混合后,靜置3日制成CP油墨,在10 μ ICP油墨中混合10 μ IlOOmMp.p.b.(pH7.0),40 μ 18.4U/mlFAD⑶H制成FAD⑶Η/CP油墨。在作為電極材料填充了 KB的一體型電極(Φ0.4mm)中按25U/mm2滴加FAD⑶Η/CP油墨,在4°C下干燥2小時。以制作的酶電極為工作電極、Pt為對電極、Ag/AgCl參考電極為參考電極。采用3電極方式,以IOmllOOmMp.p.b.(pH7.0)為反應溶液,測定施加+250mVvs.Ag/AgCl的電位時伴隨葡萄糖添加的應答電流值,結果示于圖2。以250rpm攪拌反應溶液,在37°C下進行測定。從在各葡萄糖濃度下測定的電流值中減去葡萄糖為OmM時得到的電流值作為應答電流值。[0067]如圖2所示,通過緩慢提高葡萄糖濃度,觀測到的電流值增加。葡萄糖的終濃度55mM下的應答電流值分別約800nA。5mM葡萄糖下的電流密度為3160nA/mm2。通過比較圖1和圖2,確認使用作為電極層填充了相同的KB的一體型電極時,通過將涂布在其上的油墨材料由FAD⑶Η/KB油墨變成FAD⑶Η/CP油墨,應答電流值由1500nA降低至約800nA。即,使用相同的電極層時,擔載有酶的碳粒子的粒徑越小,另外,比表面積越大,能夠得到越高的應答電流。
            [0068]實施例2
            [0069]在IOOmgKB 中加入 400 μ IMilliQ 水、lml5%Naf ion( 1-丙醇 48%水溶液),充分混合后,靜置 3 H制成 KB 油墨,在 10 μ IKB 油墨中混合 10 μ IlOOmMp.p.b.(ρΗ7.0),40 μ 18.4U/mlFAD⑶H,制成FAD⑶Η/ΚΒ油墨。在作為電極材料填充了碳糊(CP)的一體型電極(Φ0.4mm)上按25U/mm2滴加FAD⑶Η/KB油墨,在4°C下干燥2小時。達到恒定的電流值和反應溶液中的葡萄糖濃度的相關示于圖3。如圖3所示,為本酶時,盡管使用相同的電極面積、酶量但55mM下的電流值為IlOnA左右。本酶電極在5mM葡萄糖下的電流密度為690nA/mm2。
            [0070]比較例2
            [0071]作為碳粒子,代替KB,使用粒徑為7000nm、比表面積為lm2/g的碳糊(以下稱為CP),按與實施例1相同的程序制作酶電極。即,在IOOmgCP中加入400 μ IMilliQ水、lml5%Nafion (1-丙醇48%水溶液),充分混合后,靜置3日制成CP油墨,在10 μ ICP油墨中混合 10 μ IlOOmMp.p.b.(ρΗ7.0),40 μ 18.4U/mlFADGDH 制成 FADGDH/CP 油墨。在作為電極材料填充了 CP的一體型電極(Φ0.4mm)上按25U/mm2滴加FAD⑶Η/CP油墨,在4°C下干燥2小時。達到恒定的電流值和反應溶液中的葡萄糖濃度的相關示于圖4。如圖4所示,為FADGDH+CP電極的情況下,盡管使用相同的電極面積、酶量,但55mM下的電流值為55nA左右。本酶電極在5mM葡萄糖下的電流密度為330nA/mm2。
            [0072]通過比較圖3和圖4,確認了使用作為電極層填充了相同CP的一體型電極的情況下,通過將涂布在其上的油墨材料由FAD⑶Η/KB油墨改為FAD⑶Η/CP油墨,應答電流值由690nA降低至約55nA。即,使用相同的電極層時,擔載有酶的碳粒子的粒徑越小、比表面積越大,能夠得到越高的應答電流。
            [0073]實施例3
            [0074]使用相同的玻璃碳(GC)電極作為電極層,為了觀察擔載有酶的碳粒子的比表面積的影響,作為碳粒子,除上述使用的KB以外,使用包含粒徑為30nm、比表面積為254m2/g的烏爾康(VC、Cabot公司的商標)、粒徑為35nm、比表面積為68m2/g的乙炔黑(DENKABLACK、DB、電氣化學工業公司的商標)及KB的糊、即Lionpaste (LP、Lion公司的商標),測定應答電流。
            [0075]首先,以在IOOmgKB 中混合了 200 μ lMilliQ、1200 μ 15%Nafion 的混合物作為 KB油墨,以在IOOmgVC中混合了 200μ lMilliQ、1200y 15%Nafion的混合物作為VC油墨。將KB 油墨或 VC 油墨:1OOmMp.p.b.(pH7.0):4.6U/μ IFAD⑶H 按 1:3.8:3.2 的體積比混合得到的混合物分別作為KB酶油墨或VC酶油墨。然后,將在50mgDB中混合了 850 μ I MilliQ,600 μ 15%Nafion 得到的混合物作為 DB 油墨,將 DB 油墨:1OOmMp.p.b.(ρΗ7.0):4.6U/μ IFAD⑶H按1: 1.4:1.6的體積比混合得到的混合物作為DB酶油墨。另外,使用以KB為主成分的 Lion paste,將 Lionpasteff-311N: 5%Nafion:1OOmMp.p.b.(pH7.0):4.6U/ μ IFAD⑶H按1:1:4:4的體積比進行混合得到的混合物作為LP酶油墨。進而,不使用碳粒子,將 5%Nafion:100mMp.p.b.(ρΗ7.0):4.6U/μ I FAD⑶H 按 1:5:4 的體積比進行混合得到的混合物作為酶油墨。
            [0076]將5μ IKB酶油墨(圖5中的KBink)、VC酶油墨(圖5中的VCink)、DB酶油墨(圖5中的DBink)、Lionpaste酶油墨(圖5中的LPink)或酶油墨(圖5中的ink)滴加在研磨后的玻璃碳(GC)電極(Φ3πιπι)上,于4°C下干燥2小時。將該電極使用25%戊二醛溶液的蒸氣進行30分鐘交聯處理后,在IOmMTris-HCl (pH7.0)中浸潰20分鐘。將該電極浸潰在IOOmMp.p.b.(pH7.0)中,于4°C下平衡一夜。采用以制作的酶電極為工作電極、以Pt為對電極、以Ag/AgCl為參考電極的3電極方式,以IOmllOOmMp.p.b.(pH7.0)為反應溶液,測定施加+250mVvs.Ag/AgCl的電位時伴隨葡萄糖添加產生的應答電流值,制作標準曲線(150rpm、37°C)。
            [0077]使用由此制作的酶電極測定葡萄糖,結果示于圖5。隨葡萄糖濃度升高,任一酶電極均觀測到電流的增加。其中,使用KB酶油墨及Lionpaste酶油墨時能夠得到相等且與其他油墨相比特別高的應答。使用VC酶油墨時也是前2者差,但是能夠得到實用上沒有問題的高應答。相反,使用DB酶油墨時只能得到與使用未使用碳粒子的酶油墨時同等的低信號。上述傳感器在葡萄糖濃度為5mM下的應答電流值與使用的油墨的碳粒子的比表面積的相關示于圖6。采用比表面積為254m2/g的烏爾康(VC)時,能夠得到基本令人滿意的應答電流,而使用比表面積為68m2/g的乙炔黑時無法得到令人滿意的應答電流。如上所述,應答電流值與使用的碳粒子的比表面積高度相關,必須使用比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子。另外,粒徑必須均為IOOnm以下。
            [0078]實施例4
            [0079]將5%Nafion:LionpasteW_311N 或 W-370C:100mMp.p.b.(ρΗ7.0):8.4U/μ IAD⑶H按1:1:4:4的體積比分別混合,制成酶油墨。將各酶油墨滴在研磨后的玻璃碳(GC)電極(Φ3_)上,使FAD⑶H的量為17U (2.4U/mm2),在4°C下干燥2小時。將該電極使用25%戊二醛溶液的蒸氣進行30分鐘交聯處理,在IOmMTris-HCl (pH7.0)中于室溫下浸潰20分鐘,除去未反應的戊二醛,進而在IOOmMp.p.b.(pH7.0)中浸潰30分鐘,進行平衡化。將其作為工作電極、將鉬線作為對電極、將Ag/AgCl參考電極作為參考電極,以IOmllOOmMp.p.b.(pH7.0)為反應溶液,測定施加+250mVvs.Ag/AgCl的電位時伴隨葡萄糖添加產生的應答電流值。以250rpm攪拌反應溶液,在37°C下進行測定。從在各葡萄糖濃度下測定的恒定電流值中減去葡萄糖為OmM時得到的恒定電流值作為應答電流值。
            [0080]使用由此制成的酶電極測定葡萄糖,結果示于圖7。隨葡萄糖濃度升高觀測到電流的增加。作為酶層中使用的碳粒子使用Lionpaste W-311N或W-370C時,在葡萄糖濃度為5mM下觀測的電流密度分別為1684nA/mm2、1452nA/mm2。以KB為主成分的Lionpaste的情況下,確認了無論產品的種類如何,均能夠得到高應答電流。
            [0081]實施例5
            [0082]作為碳粒子,準備粒徑為30nm、比表面積為254m2/g的烏爾康(VULCAN:VC)。在IOOmgVC中加入400 μ IMilliQ水、lml5%Naf ion (1-丙醇48%水溶液),充分混合后,靜置3日制成 VC 油墨,在 10 μ IVC 油墨中混合 10 μ IlOOmMp.p.b.(ρΗ7.0),40 μ 18.4U/mlFADGDH。制成FAD⑶H/VUL油墨。在將VC作為電極材料進行填充的一體型電極(Φ0.75mm)上按25U/mm2滴加FAD⑶H/VC油墨,在4°C下使其干燥2小時。以制作的酶電極為工作電極、Pt為對電極、Ag/AgCl參考電極為參考電極。采用3電極方式時,以IOmllOOmMp.p.b.(pH7.0)為反應溶液,測定施加+250mVvs.Ag/AgCl的電位時隨葡萄糖添加產生的應答電流值,結果示于圖5。以250rpm攪拌反應溶液,在37°C下進行測定。從在各葡萄糖濃度下測定的電流值中減去葡萄糖為OmM時得到的電流值作為應答電流值。
            [0083]如圖8所示,通過緩慢提高葡萄糖濃度,觀測到的電流值增加。葡萄糖的終濃度為55mM時的應答電流值分別為約3500nA。5mM葡萄糖時的電流密度為2327nA/mm2。如上所述,使用粒徑為30nm、比表面積為254m2/g的VC的VC油墨即使電極層如實施例3所述為玻璃碳,另外,即使如本實施例所述為VC,均可得到令人滿意的應答電流。
            [0084]如上所述,電極層、酶層均使用碳粒子時,如果將相同種類的碳粒子用于電極層,則酶層中使用的碳粒子的粒徑越小、比表面積越大,能夠得到越高的應答電流,特別是如果使用粒徑為IOOnm以下且比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子,則能夠得到令人滿意的應答電流。另外,將相同種類的碳粒子用于酶層時,電極層中使用的碳粒子的粒徑越小、t匕表面積越大,能夠得到越高的應答電流,特別是如果使用粒徑為IOOnm以下且比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子,則應答電流提高。
            [0085]作為電極層使用金屬線時的實施例
            [0086]下面給出作為電極層使用金屬線、作為酶層使用LP油墨時的實施例。
            [0087]實施例6
            [0088]將金線(Φ0.5mm)在Piranha溶液(過氧化氫:濃硫酸=1:3)中浸潰5分鐘X 3次,進行清洗。在該金線上涂布使用LionpasteW-311N在與實施例4的說明中記載的相同條件下制作的酶油墨,在4°C下干燥2小時。采用將該電極用與實施例4的說明中記載的相同方法進行交聯處理、實施平衡化作為工作電極、作為對電極使用沒有進行任何涂布的金線、作為參考電極使用Ag/AgCl參考電極的3電極方式時,與實施例4的說明同樣地測定伴隨葡萄糖添加產生的應答電流值。
            [0089]使用由此制成的酶電極測定葡萄糖,結果示于圖9。隨葡萄糖濃度升高觀察到電流的增加。5mM葡萄糖下的電流密度為201nA/mm2。
            [0090]實施例7
            [0091]將5%Nafion:LionpasteW-311N:1OOmMp.p.b.(pH7.0):8.4U/μ I FADGDH 按1:1:4:4的體積比進行混合,制成酶油墨。將酶油墨涂布在不銹鋼線Φ0.5mm的前端10mm,在4°C下使其干燥2小時。將該不銹鋼線使用25%戊二醛溶液的蒸氣進行30分鐘交聯處理,在IOmM Tris-HCl (pH7.0)中于室溫下浸潰20分鐘,除去未反應的戊二醛,再在IOOmMp.p.b.(pH7.0)中浸潰I小時,進行平衡化。以其為工作電極、以鉬線為對電極、以Ag/AgCl為參考電極,以IOmllOOmMp.p.b.(pH7.0)為反應溶液,測定施加+400mVvs.Ag/AgCl的電位時伴隨葡萄糖添加產生的應答電流值。以250rpm攪拌反應溶液,在37°C下進行測定。從在各葡萄糖濃度下測定的恒定電流值中減去葡萄糖為OmM時得到的恒定電流值作為應答電流值。
            [0092]將固定了酶的各不銹鋼線作為工作電極時的、伴隨葡萄糖添加產生的應答電流值示于圖10。隨葡萄糖濃度升高觀察到電流的增加。5mM葡萄糖下的電流密度為232nA/mm2。
            [0093]實施例8[0094]將不銹鋼制一體型電極的前端的不銹鋼部位(0.165mm2)用作工作電極,將另一個不銹鋼部位(0.942mm2)用作對電極。在將 5%Nafion:LionpasteW_311N:1OOmMp.p.b.(pH7.0):8.4υ/μ IFAD⑶H按1:1:4:4的體積比混合得到的酶油墨中,浸潰工作電極,然后,在4°C下干燥2小時。將該電極使用25%戊二醛溶液的蒸氣進行30分鐘交聯處理后,在IOOmMp.p.b.(pH7.0)中浸潰30分鐘,平衡化。將該電極使用恒電勢儀,采用以Ag/AgCl為參考電極的3電極方式,測定施加+400mVvs.Ag/AgCl時伴隨葡萄糖添加產生的應答電流值。以IOmllOOmMp.p.b.(pH7.0)為反應溶液,以攪拌速度150rpm、于37°C下進行測定。從在各葡萄糖濃度下測定的恒定電流值中減去葡萄糖為OmM時得到的恒定電流值作為應答電流值。
            [0095]將制作的不銹鋼制一體型電極的、相對于葡萄糖的應答電流值的標準曲線示于圖
            11。在采用電極方式的測定中,相對于5mM葡萄糖的應答電流值為134nA/mm2。該值為與由使用0.5mm不銹鋼線試制的酶電極實施例7得到的值相同的程度。由此可以構筑使用該不銹鋼制一體型電極的葡萄糖傳感器。
            [0096]酶電極的制作例
            [0097]實施例9
            [0098]通過在圖12所示的碳粒子被擔載在聚合物基板上制成的市售電極((有)biodevicetechnology公司制DepChip圓型碳電極)上涂布酶油墨,構筑酶電極。作為酶油墨,使用將 5%Nafion: Lionpaste W-311N:1OOmMp.p.b.(ρΗ7.0):4.0U/μ IFAD⑶H 按1:1:1:7的體積比進行混合得到的混合物。將1.5μ I該酶油墨涂布在圖12的電極上,然后,在4°C下干燥2小時。將該電極使用恒電勢儀,采用以同一電極上的Ag/AgCl為參考電極的3電極方式,測定施加+250mVvs.Ag/AgCl時伴隨葡萄糖添加產生的應答電流值。
            [0099]測定首先在沒有將電位施加給電極的狀態下將包含溶解在IOOmMp.p.b.(pH7.0)中的各種濃度葡萄糖的試樣溶液5 μ I滴在酶電極上。5秒后,使用恒電勢儀,采用以同一電極上的Ag/AgCl為參考電極的3電極方式,施加+250mVvs.Ag/AgCl。添加含有各種濃度的試樣時觀察到的電流值變化示于圖13。觀察到的電流值因如上所述地添加的葡萄糖濃度而不同。施加電位后,以5秒后的電流值為指標檢測與葡萄糖濃度的相關。以縱軸為5秒后的電流值、以橫軸為試樣中的葡萄糖濃度的圖表示于圖14。如上所述使用本酶電極無需加入電子媒介即可測定葡萄糖濃度。
            [0100]以上實施例是本發明的例示,即使使用此處所示實施例以外的材料、條件,只要包含在本發明的權利要求書內,就能夠發揮同樣的效果,當然也可以進行其他各種變更、改良等。例如,本發明的使用油墨材料的酶電極如上所述可以用作葡萄糖傳感器中的工作電極,另外,也可以優選用作以葡萄糖為燃料的燃料電池中的陽極催化劑。
            【權利要求】
            1.一種酶電極,是包含擔載有以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(GDH)的碳粒子、和與上述碳粒子接觸的電極層的酶電極,其中,上述碳粒子包含粒徑為IOOnm以下且比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子,并且其中,上述電極層包含金屬。
            2.如權利要求1所述的酶電極,其中,上述葡萄糖脫氫酶(GDH)是氧化還原酶催化亞單位或氧化還原催化亞單位和電子傳遞亞單位的復合體。
            3.如權利要求1所述的酶電極,其中,上述碳粒子是烏爾康、科琴黑或LionPaste。
            4.如權利要求1所述的酶電極,其中,上述電極層包含金屬的線。
            5.葡萄糖傳感器,其使用權利要求1?4中的任一項所述的酶電極。
            6.一種酶電極的制造方法,包括將油墨材料涂布在電極層的表面后,使其干燥,其中所述油墨材料包含以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(⑶H)和碳粒子,其中上述碳粒子包含粒徑為IOOnm以下且比表面積為至少200m2/g以上的碳粒子,并且其中,上述電極層包含金屬。
            7.如權利要求6所述的方法,其中,上述葡萄糖脫氫酶(GDH)是氧化還原酶催化亞單位或氧化還原酶催化亞單位和電子傳遞亞單位的復合體。
            8.如權利要求6所述的方法,其中,上述碳粒子是烏爾康、科琴黑或LionPaste。
            9.如權利要求6所述的酶電極的制造方法,還包括向吸附或涂布干燥了酶的酶膜添加固體高分子電解質。
            10.如權利要求9所述的酶電極的制造方法,其中所述油墨材料還包含固體高分子電解質。
            11.如權利要求9所述的酶電極的制造方法,其中所述固體高分子電解質是Nafion。
            12.—種酶燃料電池,其使用權利要求1?4中的任一項所述的酶電極,其中所述酶電極作為陽極使用。
            【文檔編號】G01N27/30GK103472108SQ201310306077
            【公開日】2013年12月25日 申請日期:2008年9月18日 優先權日:2007年9月18日
            【發明者】津川若子, 早出廣司 申請人:究極酵素國際股份有限公司, 日本生物工程研究所有限責任公司, 愛科來株式會社
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