一種檢測尿液中pca3基因和psa基因表達量的熒光定量pcr法及其診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及了一種用于檢測尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PGR法及其診斷試劑盒。該方法指首先跨內含子設計PCA3和PSA的特異性的引物和Taqman熒光探針，2個探針使用不同的熒光染料進行標記，可以在同一反應液中進行擴增和檢測，然后利用含PCA3和PSA特異性擴增片段的體外轉錄RNA定量標準品制作標準曲線，對尿液樣本中PCA3和PSA?mRNA分別進行定量，最后通過對比PCA3基因和PSA基因表達量，建立PCA3評分標準，PCA3分數可以協助臨床醫生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預測前列腺穿刺陽性活檢率。該診斷試劑盒包括：PCA3/PSA-PCR反應液、PCA3/PSA?RNA陽性對照、陰性對照、4種已知濃度的PCA3/PSA?RNA定量標準品。本發明為臨床利用尿液樣本進行前列腺癌早期篩查提供了一種新的方法。
【專利說明】—種檢測尿液中PCA3基因和PSA基因表達量的焚光定量PCR法及其診斷試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥及體外診斷試劑領域，具體涉及檢測尿液樣本中前列腺癌組織表達基因PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PCR法及其診斷試劑盒。
【背景技術】
[0002]前列腺癌(prostate carcinoma, PCa)是男性常見的惡性腫瘤之一，除少數病例外；其生長大多比較緩慢，潛伏期較長，有些甚至終生不被發現。許多患者早期沒有任何主觀不適，等出現臨床癥狀時已至疾病晚期，從而錯過了最佳治療時機。臨床上探尋前列腺癌的早期診斷方法，一直是研究的熱點。因此，開發早期診斷前列腺癌的試劑盒有重要的臨床價值。目前血清前列腺特異性抗原(PSA)是臨床應用最廣泛的前列腺腫瘤標記物，PSA敏感度高，但特異度較低，由此導致臨床前列腺穿刺活檢陰性幾率較高，以及多次前列腺重復穿刺活檢、過度診斷和過度醫療等問題。因此人們不斷尋找敏感性高，特異性強的檢測項目。
[0003]PCA3 (prostate cancer antigen3)是 1999 年 Bussemakers 等應用差異顯不分析方法，通過比較前列腺癌組織和正常前列腺組織的mRNA表達譜時發現的一種前列腺癌特異性基因。PCA3基因位于9號染色體長臂2區I帶到2帶，全長25000bp，含有4個外顯子和3個內含子，具有很高的組織特異性和癌特異性，在癌變的前列腺細胞中表達量很高，具有較高的敏感性和特異性，是最新發現的前列腺癌早期診斷篩查和對治療后的患者進行有效的監測的標記物。Hessels等應用RT-PCR法證實，PCA3基因高度表達于前列腺癌組織，在正常前列腺、良性前列腺增生細胞中僅有少數表達或不表達，在其他腫瘤組織及器官中無表達，現已成為一種較有應用前景的前列腺癌標記物，它較之單一檢測PSA水平篩查前列腺癌具有更高的效能。
[0004]各種研究認為PCA3基因序列中含有高密度的終止密碼子，因而PCA3表達非編碼的mRNA，而不產生相應的蛋白質。因此，目前檢測PCA3的主要方法都是檢測PCA3 mRNA。研究還發現PCa組中PCA3 mRNA和PSA mRNA含量顯著高于前列腺增生組，PCA3 mRNA和PSAmRNA可作為PCa診斷的良好標志。PSA mRNA診斷PCa的敏感度高于PCA3 mRNA,但特異度較之低，可能是由于PSA mRNA在腫瘤細胞中的表達量高于PCA3 mRNA，而PCA3 mRNA高度特異性地表達于PCa細胞。因此，若將PCA3 mRNA和PSA mRNA聯合檢測，則可相互彌補PCA3mRNA敏感度低和PSA mRNA特異性低的不足，從而大大提高對早期PCa的診斷效能。臨床評估證明PCA3在前列腺癌的診斷過程中能與PSA檢測結合，有效排除前列腺體積、炎癥等干擾因素，顯著提高前列腺癌的早期診斷價值。PCA3分數=PCA3 mRNA表達量/PSA mRNA表達量。慢性前列腺炎、前列腺體積、PSA水平對PCA3分數沒有影響。在世界多個地區、國家的人群多樣本研究中表明，PCA3分數可以有效預測穿刺陽性活檢率。
[0005]目前有3種針對PCA3的診斷技術，第一種是以熒光定量PCR技術定量檢測PCA3mRNA的表達；第二種是uPM3技術,是由Bostwick實驗室發展的基于核苷酸序列擴增的檢驗方法；第三種是Gen-P1be公司以APTIMA技術為基礎開發分子診斷試劑盒，為目前唯一的商業化試劑盒。國內外各種研究表明，利用熒光定量RT-PCR建立的PCA3評分方法，方法簡便、特異且重復性好，為臨床應用提供了一種新方法。
[0006]本發明應用Taqman熒光探針技術定量檢測尿液樣本中PCA3基因和PSA基因的mRNA的表達，然后通過對比兩種基因的表達，建立PCA3評分標準，PCA3分數可以協助臨床醫生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預測前列腺穿刺陽性活檢率。
【發明內容】
[0007]本發明的目的提供一種可以同時對尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量定量檢測體外診斷試劑盒。
[0008]本發明的另一目的在于建立一種對尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量熒光定量PCR檢測方法，通過對比PCA3基因和PSA基因表達量，建立PCA3評分標準，PCA3分數可以協助臨床醫生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預測前列腺穿刺陽性活檢率。
[0009]所述的PCA3/PSA mRNA熒光定量PCR檢測試劑盒包括PCA3/PSA-PCR反應液、PCA3/PSA RNA陽性對照、陰性對照、4種已知濃度的PCA3/PSA RNA定量標準品。
[0010]所述的PCA3/PSA-PCR反應液包括反轉錄PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、AMV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶、PCA3基因上游引物(PCA3-F)、PCA3基因下游引物(PCA3-R)、PCA3基因熒光探針(PCA3-P)PSA基因上游引物(PSA-F)、PSA基因下游引物(PSA-R)、PSA基因熒光探針(PSA-P)、內參基因上游引物(IC-F)、內參基因下游引物(IC-R)和內參基因熒光探針(IC-P)。
[0011]所述PCA3/PS A-PCR反應液各成分的終濃度為:1X的反轉錄PCR緩沖液、4mM的MgCl2、0.4mM 的 dNTP、2U 的 Taq DNA 聚合酶、2U 的 AMV 逆轉錄酶、200nM 的 PCA3_F、200nM 的PCA3-R、150nM 的 PCA3_P、200nM 的 PSA_F、200nM 的 PSA_R、200nM 的 PSA-P、10nM 的 IC-F、10nM 的 IC-R 和 10nM 的 IC-P0
[0012]所述的PCA3-F序列為:
[0013]5' -GCTTCCTGTGTGTGTGGATATTTAA-3'；
[0014]所述的PCA3-R序列為:
[0015]5' -GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACA-3'；
[0016]所述的PCA3-P序列為:
[0017]5' -TCCTGGTCTCCCTCGGCTGCA-3'；
[0018]所述的PSA-F序列為:
[0019]5' -GTCTGCGGCGGTGTTCTG-3;；
[0020]所述的PSA-R序列為:
[0021]5' -GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3'；
[0022]所述的PSA-P序列為:
[0023]5' -CCCCAGTGGGTSCTCACAGCTGC-3'；
[0024]所述的IC-F序列為:
[0025]5' -TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3'；
[0026]所述的IC-R序列為:
[0027]5' -TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3'；
[0028]所述的ICP序列為:
[0029]5' -ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-3'；
[0030]其中PCA3-P的U端標記FAM熒光報告基團，3'端標記BHQl熒光淬滅基團；PSA-P的5'端標記HEX熒光報告基團，3'端標記BHQl熒光淬滅基團；IC_P的5'端標記ROX熒光報告基團，3'端標記BHQ2熒光淬滅基團。
[0031 ] 所述的PCA3/PSA RNA陽性對照為含靶序列的PCA3體外轉錄的RNA與含靶序列的PSA體外轉錄的RNA的等比例混合物。
[0032]所述的陰性對照為DEPC處理水。
[0033]所述的4種已知濃度的PCA3/PSA RNA定量標準品為含靶序列的PCA3體外轉錄的RNA與含靶序列的PSA體外轉錄的RNA的等比例混合物，濃度從高到底依次為17拷貝/mL、106 拷貝 /mL、105 拷貝 /mL 和 14 拷貝 /mL。
[0034]本發明中試劑盒的原理為:首先為避免PCA3和PSA基因組DNA的干擾，跨內含子設計PCA3和PSA的特異性的引物和Taqman熒光探針，2個探針使用不同的熒光染料進行標記，可以在同一反應液中進行擴增和檢測。TaqMan技術是由美國Perkin Elmer (PE)公司研制的一種實時PCR技術,它在一條20多bp的寡核苷酸探針的兩端分別標記上突光發射基團(R)和淬滅基團(Q)，在PCR反應中設立標準品模板系列和陰性對照，根據FRET原理，探針完整時發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，當PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個游離的熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，并計算出Rn值、Λ Rn值、Ct值和閾值。Ct值是指樣品管的熒光信號達到某一固定閾值的PCR反應循環數。同時利用標準品模板系列繪制出標準曲線，結合各樣品的Ct值，就可以確定樣品的起初模板量。根據不用的熒光標記，儀器可以識別不同的熒光信號，達到分開檢測的目的，常用的熒光基團是FAM、J0E、HEX和R0X。在整個擴增中有2個酶起到重要作用，AMV反轉錄酶負責把mRNA反轉錄為cDNA，Taq酶負責PCR擴增。跨內含子設計的引物可以避免基因組DNA的干擾，熒光探針可以使2種產物在一個反應管中同時檢測到。通過自制的標準品制作標準曲線，分別對PCA3mRNA和PSA mRNA進行定量，然后就可以得到PCA3分數(PCA3分數=PCA3 mRNA表達量/PSA mRNA表達量)，根據PCA3分數臨床醫生可以判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預測前列腺穿刺陽性活檢率。
【具體實施方式】
[0035]下列實施是旨在舉例說明，而不是限制本發明。
[0036]實施例1:本發明試劑盒的使用方法
[0037]I產品名稱:PCA3/PSA mRNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)
[0038]2預期用途:用于男性尿液樣本中PCA3和PSA mRNA的表達量進行定量檢測，通過計算PCA3和PSA mRNA的比值，確定PCA3分數，為前列腺癌的早期診斷提供依據，為預測前列腺活檢陽性率提供參考。
[0039] 3試劑盒組成成分:2管PCA3/PSA-PCR反應液(1.1mL/管)、I管PCA3/PSARNA陽性對照(200ul/管)、1管陰性對照(300ul/管)、1管PCA3/PSA RNA定量標準品I (200ul/管)、I 管 PCA3/PSA RNA 定量標準品 2 (200ul/管)、I 管 PCA3/PSA RNA 定量標準品 3 (200ul/管)、1管PCA3/PSA RNA定量標準品4 (200ul/管)和1份產品說明書。
[0040]4樣本的采集、保存和運輸:
[0041]4.1樣本采集:取當日第一次晨尿，不少于50mL。
[0042]4.2樣本的保存和運輸:保存于4_8°C，48h內檢測。樣本長距離運輸采用泡沫盒加冰袋，3h內送達實驗室。
[0043]5樣本處理:取15mL尿液，使用商品化的總RNA提取試劑盒抽提RNA。
[0044]6試劑準備:若樣本數為n，準備n+6個PCR管，每管分裝45ul的PCA3/PSA-PCR反應液，其中6指1份陽性對照、1份陰性對照和4份定量標準品。
[0045]7加樣:向分裝的PCR反應液中依次分別加入5ul的陰性對照、抽提的RNA樣本、陽性對照和定量標準品。
[0046]8 上機:使用 ABI7500。
[0047]8.1樣品設置:根據樣本類型設置樣本編號、陰性對照、陽性對照和定量標準品(包括其濃度值)。
[0048]8.2熒光通道選擇:每個樣品選擇FAM、ROX和J0E3個通道。參比熒光(PassiveReference)設置為 none。
[0049]8.3反應條件設定
[0050]
【權利要求】
1.一種用于檢測尿液樣本中PCA3基因和PSA基因表達量的熒光定量PCR法，其特征在于: 為避免PCA3和PSA基因組DNA的干擾，首先跨內含子設計PCA3和PSA的特異性的引物和Taqman熒光探針，2個探針使用不同的熒光染料進行標記，可以在同一反應液中進行擴增和檢測，同時加入內參檢測引物和探針對樣本處理和PCR擴增進行全程監控。然后利用含PCA3和PSA特異性擴增片段的體外轉錄RNA定量標準品制作標準曲線，對尿液樣本中PCA3和PSA mRNA分別進行定量。最后通過對比PCA3基因和PSA基因表達量，建立PCA3評分標準，PCA3分數可以協助臨床醫生判斷患者得前列腺癌的可能性，有效預測前列腺穿刺陽性活檢率。
2.如權利I所述，PCA3mRNA檢測所用的引物和探針為: 上游引物 PCA3-F 序列為 5' -GCTTCCTGTGTGTGTGGATATTTAA-3'； 下游引物 PCA3-R 序列為 5' -GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACA-3'； 熒光探針PCA3-P序列為5' -TCCTGGTCTCCCTCGGCTGCA-3' ,5'端標記FAM熒光報告基團，3'端標記BHQl熒光淬滅基團。
3.如權利I所述，PSAmRNA檢測所用的引物和探針為: 上游引物 PSA-F 序列為:5' -GTCTGCGGCGGTGTTCTG-3'； 下游引物 PSA-R 序列為:5' -GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3'； 熒光探針 PSA-P 序列為:5 ' -CCCCAGTGGGTSCTCACAGCTGC-3' ,5'端標記 HEX 熒光報告基團，3'端標記BHQl熒光淬滅基團。
4.如權利I所述，內參基因檢測所用的引物和探針為: 上游引物 IC-F 序列為:5' -TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3'； 下游引物 IC-R序列為:5' -TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3'； 熒光探針 ICP 序列為:5 ' -ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-3'，5'端標記 ROX 熒光報告基團，3'端標記BHQ2熒光淬滅基團。
5.如權利I所述，PCA3標準品中含的特異性擴增片段為:
GAGAAGCTGGCATCAGAAAAACAGAGGGGAGATTTGTGTGGCTGCAGCCGAGGGAGACCAGGAAGATCTGCATGGTGGGAAGGACCTGATGATACAGAGGTGAGAAATAAGAAAGGCTGCTGACTTTACCATCTGAGGCCACACATCTGCTGAAATGGAGATAATTAACATCACTAGAAACAGCAAGATGACAATATAATGTCTAAGTAGTGACATGTTTTTGCACATTTCCAGCCCCTTTAAATATCCACACACACAGGAATC。
6.如權利I所述，PSA標準品中含的特異性擴增片段為:
GGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCC0
7.一種PCA3和PSA mRNA核酸熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括:PCA3/PSA-PCR反應液、PCA3/PSA RNA陽性對照、陰性對照、4種已知濃度的PCA3/PSA RNA定量標準品。
8.如權利7所述，PCA3/PSA-PCR反應液各成分的終濃度為:1X的反轉錄PCR緩沖液、4mM 的 MgCl2、0.4mM 的 dNTP、2U 的 Taq DNA 聚合酶、2U 的 AMV 逆轉錄酶、200nM 的 PCA3-F、200nM 的 PCA3-R、150nM 的 PCA3_P、200nM 的 PSA_F、200nM 的 PSA_R、200nM 的 PSA-P、10nM的 IC-FUOOnM 的 IC-R 和 10nM 的 IC-P0
【文檔編號】G01N21/64GK104164474SQ201310182694
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優先權日:2013年5月17日
【發明者】劉代新, 何勝祥 申請人:劉代新