Cystatin SN和AFP在制備診斷和預示肝癌標志物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN（Cystatin?SN）與甲胎蛋白（AFP）的聯合應用，具體為Cystatin?SN與AFP在制備診斷和預示肝癌標志物中應用，本發明還公開了肝癌標志物的捕獲劑，將捕獲劑與常規試劑組合后形成肝癌檢測試劑盒，所得試劑盒具有特異性好、靈敏度高等優點，能夠用于肝癌的早期診斷，治療過程中的療效評估及其治療后的轉移復發監控，檢測結果早于臨床癥狀。
【專利說明】Cystatin SN和AFP在制備診斷和預示肝癌標志物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學檢測領域,涉及Cystatin SN和AFP在制備診斷和預示肝癌標志物中的應用。
【背景技術】
[0002]肝癌是世界上第五大常見的腫瘤，根據世界衛生組織的報告，肝癌死亡率的增速在所有癌癥中增速第二。全球每年超過50萬人患肝癌，其中一半以上在中國。肝癌的發生率和死亡率幾乎是一致的，預示著肝癌比較差的總體生存期。因此尋找到合適的腫瘤分子標志物實現肝癌早期診斷，療效評估以及復發監控，對降低肝癌死亡率、改善肝癌患者的生存狀態具有非常高的價值。
[0003]肝硬化是肝癌發展中重要的危險因素，因此臨床上建議對肝硬化患者進行肝癌風險篩查。目前對于肝癌的檢測的方法主要是基于影像學方法CT或者MRI掃描，但是檢測肝組織橫斷面成像需要組織病理來確定是否為肝癌，而這樣的創傷性診斷方式，給患者帶來非常大的生理的疼痛，因此患者不易接受。
[0004]標志物檢測是今年發展起來的用于診斷疾病的方法，具有快速、創傷性小等特點。甲胎蛋白(AFP)是最常用的監視全球肝癌的腫瘤分子標志物，但是新發病例中AFP陰性肝癌比例的不斷增加，AFP診斷肝癌的特異性及敏感度已不能滿足監視肝癌的作用。因此，急需開發一些新的具有診斷價值的肝癌血清標志物，理想的肝癌標志物需要在肝臟結節惡變的早期階段即能敏感和特異性地從外周血中檢出。
【發明內容】
[0005]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN (Cystatin SN)和甲胎蛋白(AFP)在制備診斷和預示肝癌標志物中的應用；本發明的目的之二在于提供肝癌標志物的捕獲劑；本發明的目的之三在于提供含有捕獲劑的試劑盒；本發明的目的之四在于提供試劑盒建立計算診斷和預示肝癌閾值的方法。
[0006]為達到上述目的，本發明提供如下技術方案:
[0007]1.半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白在制備診斷和預示肝癌標志物中的應用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述甲胎蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]優選的，所述診斷和預示為診斷、療效評估或轉移復發監控。
[0009]2.肝癌標志物的捕獲劑，所述標志物為半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述甲胎蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]優選的，所述捕獲劑為識別半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白的特異性抗體。
[0011]3.含有所述捕獲劑的試劑盒。[0012]優選的，所述試劑盒為檢測血清中半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白濃度的試劑盒。
[0013]更優選的，所述試劑盒為酶聯免疫檢測試劑盒。
[0014]更優選的，所述試劑盒含有包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標記的多克隆抗體和顯色底物。
[0015]最優選的，所述單克隆抗體為鼠抗人Cystatin SN單克隆抗體,所述多克隆抗體為兔抗人Cystatin SN多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯苯胺。
[0016]4.利用所述試劑盒建立計算診斷和預示肝癌閾值的方法，用所述試劑盒檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白濃度，根據P=exp (-1.313+0.751X^2.608X2) /[1+exp(-1.313+0.751XJ2.608X2)]計算P值，當P > 0.5時，判斷為陽性；當P≤0.5時，判斷為陰性；
[0017]其中X1為Cystatin SN的濃度，單位為pg/mL ;X2為甲胎蛋白的濃度，單位為ng/
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[0018]本發明的有益效果:本發明公開了診斷和預示肝癌的新標志物，即將Cystatin SN和AFP聯合用于制備診斷和預示肝癌的標志物，利用兩個標志物聯合檢測肝癌的靈敏度和特異性高于單獨檢測其中一種標志物；本發明還公開了檢測肝癌標志物的捕獲劑，將捕獲劑與常規試劑組合形成檢測試劑盒，形成的試劑盒具有使用方便，重復性好，便于攜帶，可用于肝癌的早期診斷、療效評估或移轉復發監控等，其診斷肝癌的靈敏度為85.6%，特異性為 91.4% ο
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖:
[0020]圖1為Cystatin SN酶聯免疫檢測試劑盒檢測Cystatin SN蛋白的標準曲線。
[0021]圖2為Cystatin SN-AFP聯合檢測試劑盒診斷肝癌ROC曲線。
【具體實施方式】
[0022]下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。
[0023]本發明使用的試劑如下:鼠抗人Cystatin SN單克隆抗體購自美國R&D公司(貨號:MAB1285);兔抗人Cystatin SN多克隆抗體、Cystatin SN蛋白標準品購自北京義翹神州生物技術有限公司；AFP血清ELISA檢測試劑盒購自北京熱景生物技術有限公司(貨號:1003)。
[0024]實施例1建立Cystatin SN血清檢測反應體系及其優化
[0025]用濃度為5 μ g/mL的鼠抗人Cystatin SN單克隆抗體包被ELISA板,于4°C條件下包被過夜，洗板；然后在質量分數為2%的BSA中室溫封閉2小時,洗板；然后將濃度為Opg/mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 200pg/mL, 400pg/mL, 800pg/mL, 1600pg/mL 的 Cystatin SN 蛋白標準品(編碼Cystatin SN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1)和血清樣品分別加入封閉板中，于37°C反應I小時，洗板；然后用濃度為0.5 μ g/mL HRP標記的兔抗人Cystatin SN多克隆抗體，在37°C條件下反應I小時，洗板；再與四甲基聯苯胺(TMB)反應2-3分鐘，最后用濃度為2M的硫酸終止反應，并于450nm條件下檢測OD值(圖1)。由圖1可知，CystatinSN酶聯免疫檢測試劑盒線性范圍為50pg/mL-1600pg/mL，在線性范圍內標準品線性相關系數r≥0.990，回收率在90%~110%范圍內。
[0026]檢測體系優化，比對分別由美國R&D，英國Abcam和美國NOVUS B10L0GICALS3個不同公司生產的Cystatin SN單克隆抗體、美國R&D公司和北京義翹神州生物技術有限公司生產的Cystatin SN蛋白標準品和美國R&D,英國Abcam和北京義翅神州生物技術有限公司生產的Cystatin SN多克隆抗體。結果表明，Cystatin SN單克隆抗體優選R&D公司提供的產品，最佳工作濃度為5 μ g/mL ；Cystatin SN蛋白標準品和Cystatin SN多克隆抗體優選北京義翹神州生物技術有限公司產品，最佳工作濃度為0.5μ g/mL，在最佳條件下，可實現背景(》值< 0.1，能夠有效區分陰性組與陽性組，且具有統計學意義。
[0027]固相載體的確定:對美國Corning、德國Greiner、美國Thermo和丹麥Nunc4個不同廠家生產的酶標板進行了比較。結果顯示，美國corning公司(貨號為:9018)和thermo(貨號為:468667)公司的酶標板符合背景OD值< 0.1，且信噪比較高。
[0028]包被液的選擇:根據抗體包被于固相載體所需要的緩沖體系，ELISA常用包被液為緩沖鹽溶液，分別用磷酸鹽緩沖液(PH7.5)和碳酸鹽緩沖液(pH9.6)檢測包被環境對反應體系的影響，結果顯示碳酸鹽緩沖液(PH9.6)可滿足空白組OD值< 0.1，有效區分空白組、陰性組和陽性組，信噪比較高。
[0029]稀釋劑的選擇:通過實驗對比了 2種商品化稀釋劑(分別購自天津博美科生物技術有限公司(貨號BMKF017-1)和上海西唐生物科技有限公司(貨號C0901))和自制稀釋劑的稀釋效果，主要從保護蛋白能力，自身穩定性兩方面評價稀釋劑的稀釋效果。結果顯示自制稀釋劑的效果最佳，自制稀釋劑各組分的濃度如下:3mM EDTA、質量分數為0.5%的BSA、1XPBS、質量分數為0.05%的Tween-20和質量分數為0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0030]穩定劑的選擇:使用3種穩定劑(3種穩定劑具體如下:穩定劑1:質量分數為3%的蔗糖，體積分數為8%的甘油和質量分數為1.3%的NaCl ;穩定劑I1:質量分數為3%的蔗糖，體積分數為8%的甘油，質量分數為0.1%的EDTA和質量分數為1.3%的NaCl，穩定劑III:體積分數為68.8%的PBS，體積分數為30%的胎牛血清和質量分數為0.2%的硫柳汞)分別稀釋單克隆抗體、蛋白標準品和多克隆抗體至濃度為0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用時按體積比為1:100稀釋。并于第O天、第7天和第14天進行檢測，結果顯示穩定劑III效果最佳，其組分為:體積分數為68.8%的PBS、體積分數為30%的胎牛血清、質量分數為0.2%的硫柳萊。
[0031]通過以上研究確定了檢測體系的主要組分，然后建立了 Cystatin SN血清檢測體系O
[0032]實施例2Cystatin SN酶聯免疫檢測試劑盒
[0033]根據實施例1中建立Cystatin SN血清檢測體系構建Cystatin SN酶聯免疫檢測試劑盒，具體組分如表1所示:
[0034]表1.Cystatin SN酶聯免疫檢測試劑盒組分
[0035]
【權利要求】
1.半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白在制備診斷和預示肝癌標志物中的應用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述甲胎蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述診斷和預示為診斷、療效評估或轉移復發監控。
3.肝癌標志物的捕獲劑，其特征在于:所述標志物為半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述甲胎蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.根據權利要求3所述的捕獲劑，其特征在于:所述捕獲劑為識別半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白的特異性抗體。
5.含有權利要求3或4所述捕獲劑的試劑盒。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為檢測血清中半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白濃度的試劑盒。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為酶聯免疫檢測試劑盒。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標記的多克隆抗體和顯色底物。
9.根據權利要 求8所述的試劑盒，其特征在于:所述單克隆抗體為鼠抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯苯胺。
10.利用權利要求5-9任一項所述試劑盒建立計算診斷和預示肝癌閾值的方法，其特征在于:用所述試劑盒檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和甲胎蛋白濃度，根據P=exp(-1.313+0.751X^2.608X2)/[1+exp (-1.313+0.751X^2.608X2)]計算閾值，當 P > 0.5 時，判斷為陽性；當P < 0.5時，判斷為陰性； 其中X1為半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的濃度，單位為pg/mL ；X2為甲胎蛋白的濃度，單位為 ng/mL0
【文檔編號】G01N33/574GK103940996SQ201310165095
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年5月7日 優先權日:2013年5月7日
【發明者】王弢, 秦勇, 吳孝林 申請人:上海良潤生物醫藥科技有限公司