一種雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法
【專利摘要】本發明提供一種雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，該篩選方法包括如下步驟：上清液預處理、上清液點樣及后處理、上清液標記、點樣測試、雙抗體夾心檢測。在雜交瘤法細胞上清階段微量抗體時首先進行配對篩選，利用芯片的高靈敏及多通量的優點，避免大量的無目的的單抗純化工作。制備這個種類的單克隆抗體時，可以使用這個方法預先篩選出配對甚至可以預篩臨床檢測效果好的配對抗體，再進行大規模制備，極大的提高了效率，降低了制備的成本及風險。
【專利說明】一種雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗體篩選方法，特別是一種雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法。
【背景技術】
[0002]雙抗體夾心法是臨床體外診斷檢測抗原最常用的ELISA方法，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原的定量檢測。其基本工作原理是:利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復合物。
[0003]傳統的經典雙抗體夾心目標抗體篩選方法需要采用雜交瘤技術制備單克隆抗體(簡稱單抗)，在單抗純化后通過ELISA方法和Western blotting測定抗體的效價與特異性，還有抗體類型、相對親和力測定，應用純化的單抗建立雙抗體夾心ELISA檢測方法篩選適合檢測的配對抗體。傳統方法制備單抗時，需要針對特定免疫原的所有的陽性克隆進行擴大培養并進行單抗純化。但是，制備出的單抗并不一定能針對該免疫原進行雙抗體夾心配對，制備存在一定的盲目性。即使篩選出針對免疫原可以進行雙抗體夾心配對的抗體，臨床檢測血清效果時也存在很大的差異。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種效率高、且可有目的地進行單抗純化工作的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，以解決現有技術中存在的問題。
[0005]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0006]一種雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，該篩選方法包括如下步驟:
[0007](I)取細胞融合后所形成的雜交瘤細胞的培養上清液，通過鹽析法去除雜質后更換緩沖體系，獲得預處理上清液；
[0008](2)將步驟(I)中得到的預處理上清液中的抗體固定至微透鏡陣列芯片；
[0009](3)對步驟(2)的微透鏡陣列芯片進行陽性反應，確認上清液中抗體活性及在微透鏡陣列芯片上的固定情況；
[0010](4)將步驟(I)中得到的預處理上清液標記辣根過氧化物酶；
[0011](5)使用免疫原及固定上清蛋白芯片對標記上清液分別進行雙抗體夾心反應篩選配對情況，然后通過復核、陰性對照確認、天然蛋白驗證得出的適合的配對上清。
[0012]如上所述的篩選方法，優選地，所述步驟(I)的具體操作方法是:a)取細胞融合后所形成的雜交瘤細胞的培養上清液，向所述上清液加入上清液體積的80%?150%的飽和硫酸銨溶液，在2?8°C條件下沉淀8?15h，在高速冷凍離心機中，離心分離后得到沉淀物；b)所述沉淀物用0.4ml緩沖液溶解，用超濾管離心分離，重復超濾2?6次后得到預處理上清液；
[0013]如上所述的篩選方法，優選地，所述步驟(2)的具體操作方法是:a)所述步驟(I)獲得的預處理上清液用點樣緩沖液稀釋5~20倍后點樣至微透鏡陣列芯片；b)在25~37°C條件下孵育30~120min后用PBST洗板3~6次，加入封閉液，在2~8°C條件下孵育8~15小時；
[0014]如上所述的篩選方法，優選地，所述步驟(3)的具體操作方法是:a)向所述步驟
(2)獲得的微透鏡陣列芯片加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠，在25~37°C條件下孵育30~120min后，PBST洗滌3~6次；b)使用化學發光掃描儀掃描得出可反映上清液與微透鏡陣列芯片的結合情況的圖像；
[0015]如上所述的篩選方法，優選地，所述步驟(4)的具體操作方法是:將步驟(1)中得到的預處理后上清液用過碘酸鈉氧化法標記上辣根過氧化物酶；
[0016]如上所述的篩選方法，優選地，所述步驟(5)的具體操作方法是:a)將免疫原用封閉液稀釋至0.1~lyg/ml，加入步驟(2)處理過的微透鏡陣列芯片的微孔內，在25~37°C條件下孵育60~150min ；b) PBST洗滌2~6次；c)在微透鏡陣列芯片的微孔內加入用封閉液5~20倍稀釋的步驟(3)處理的辣根過氧化物酶標記上清液的，25-37°C孵育60~150min ；d) PBST洗滌5~8次；e)使用化學發光掃描儀掃描，得出圖像；f)根據圖像，微透鏡陣列芯片上有光信號的點所對應的上清液即為可以配對的上清液；g)得出的配對上清液重復步驟(6)中的a)~e)的反應，同時在進行步驟a)時增加以封閉液代替免疫原進行反應的陰性對照；當陰性對照微透鏡陣列芯片無光信號，且免疫原反應有信號時，確定配對信息的真實有效出)對于篩選出的配對上清，使用天然蛋白質代替免疫原重復步驟(6)中的a)~e)的反應，得出光信號的數值與臨床檢測濃度線性擬合評價，篩選出最適合臨床檢測的配對上清信息。
[0017]如上所述的篩選方法，優選地，所述步驟(1)中離心分離操作的離心力是10000~15000g，運行時間是10~30min。
[0018]如上所述的篩選方法，優選地，所述超濾管的截留分子量小于上清液中抗體的分子量。
[0019]如上所述的篩選方法，優選地，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液的濃度為0.0111101/1，？!1為7.2。
[0020]如上所述的篩選方法，優選地，所述點樣緩沖液為碳酸鹽(CBS)和30%甘油的混合物，所述CBS濃度為0.05mol/L。
[0021]如上所述的篩選方法，優選地，所述封閉液為磷酸鹽緩沖液與牛血清白蛋白混合物，該磷酸鹽緩沖液的濃度為0.lmol/L，pH為7.2，牛血清白蛋白與磷酸鹽緩沖液的質量體積比為1:100~5:100。
[0022]本發明的有益效果為:
[0023]常規方法制備抗體時，需要將針對免疫原所有的陽性克隆擴大培養，獲得足夠多的細胞上清液后進行蛋白純化，利用純化的蛋白進行相關的測試。而且，如果測試結果不理想，需要重復免疫、細胞培養、抗體純化、測試的過程來獲得優質的抗體，制備周期長，耗費成本高。本發明在陽性克隆細胞上清中微量抗體時，利用微透鏡陣列芯片的高靈敏及多通量的優點，首先進行相關測試，篩選出配對效果好的陽性克隆，再進行擴大培養及蛋白純化，避免了盲目的擴大培養及蛋白純化工作，可以將目前傳統的制備時間縮短一倍甚至更多，極大的提高了效率，并且降低了制備的成本及風險。【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法的流程圖；
[0025]圖2為上清液點樣至微透鏡陣列芯片上的示意圖；
[0026]圖3為微透鏡陣列芯片上清固定陽性測試的示意圖；
[0027]圖4為一個上清的免疫原配對示意圖；
[0028]圖5為本發明實施例1中上清的天然蛋白配對示意圖；
[0029]圖6為上清液與微透鏡陣列芯片的結合情況的示意圖；
[0030]圖7為本發明實施例2中上清的天然蛋白配對示意圖。
【具體實施方式】
[0031]雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法的流程圖見圖1，下面結合附圖對本發明方法做進一步說明。
[0032]實施例1:雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選
[0033]1、取細胞融合后所形成的雜交瘤細胞的培養上清液，通過鹽析法去除雜質后更換緩沖體系，獲得預處理上清液，具體步驟如下:
[0034]a) 29份細胞上清液分別加入等體積飽和硫酸銨溶液，4°C沉淀15小時，12000g離心IOmin,棄上清液得到沉淀物；
[0035]b)沉淀物分別用濃度為0.01mol/L, pH為7.2的磷酸鹽緩沖液溶解后，分別置于容積為0.5ml,分子量為50KD的millipore超濾管，12000g離心分離IOmin,重復超濾2次
后得到預處理上清液；
[0036]2、將步驟I預處理上清抗體固定至微透鏡陣列芯片:
[0037]a)所述步驟I預處理上清液使用點樣緩沖液稀釋10倍后使用GSD1800點樣儀點樣至微透鏡陣列芯片的58個位置(即29份雜交瘤細胞上清液，每份做兩個平行)，如圖2所示，所述點樣緩沖液為CBS和30%甘油的混合物，所述CBS濃度為0.05mol/L ；
[0038]b)37°C孵育30min，用PBST洗板3次；加入封閉液4°C封閉8小時備用
的配制方法為:向濃度為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的萬分之五的吐溫20 ；所述封閉液為磷酸鹽緩沖液與牛血清白蛋白混合物，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.lmol/L, pH為7.2，牛血清白蛋白與磷酸鹽緩沖液質量體積比為5:100o
[0039]3、對步驟2中微透鏡陣列芯片上清固定情況進行確認:
[0040]a)向步驟2中點樣后向微透鏡陣列芯片加入用封閉液按體積比1:1000稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗鼠(注:每份做一個平行樣，另一個平行樣用于做步驟5，這種辣根過氧化物酶標記羊抗鼠采用武漢博士德公司BA1050，37°C孵育30min后，PBST洗滌3次；
[0041]b)使用GSS2400化學發光掃描儀掃描得出可反映上清液與微透鏡陣列芯片的結合情況的圖像，如圖3所示；
[0042]4、預處理上清標記辣根過氧化物酶:將預處理后的29份上清液用過碘酸鈉氧化法分別標記上HRP。
[0043]5、使用免疫原對上清液進行雙抗體夾心反應篩選配對情況，然后通過復核、陰性對照確認、天然蛋白驗證得出的適合的配對上清:[0044]a)將免疫原使用封閉液稀釋至0.5 μ g/ml，加入步驟2點樣的微透鏡陣列芯片內，37°C反應 60，min ；
[0045]b) PBST 洗滌 3 次；
[0046]c)在每個孔加入一種用封閉液稀釋10倍的對應步驟4辣根過氧化物酶上清液標記抗體，37 °C反應60min ；
[0047]d) PBST 洗滌 6 次；
[0048]e)使用GSS2400化學發光掃描儀掃描，得出圖像；
[0049]f)根據分析結果，得出可以配對的標記上清編號，重復這個標記上清的反應，同時做陰性對照，確定配對信息的真實有效；
[0050]g)對于確定的配對上清，進行天然蛋白(例如臨床血清)的評價，篩選出適合臨床檢測的配對信息，如圖4、圖5所示。
[0051]實施例2:
[0052]1、取細胞融合后所形成的雜交瘤細胞的培養上清液，通過鹽析法去除雜質后更換緩沖體系，獲得預處理上清液:
[0053]a) 20份細胞上清液分別加入上清體積的150%的飽和硫酸銨溶液，4°C沉淀8小時，12000g離心lOmin，棄上清液得到沉淀物；
[0054]b)沉淀物分別用濃度為0.0lmol/L, pH為7.2的磷酸鹽緩沖液溶解后，分別置于容積為0.5ml,分子量為50KD的millipore超濾管，12000g離心分離IOmin,重復超濾2次
后得到預處理上清液；
[0055]2、將步驟I中預處理上清蛋白固定至微透鏡陣列芯片，具體步驟如下:
[0056]a)所述步驟I預處理上清液使用點樣緩沖液稀釋5倍后使用GSD1800點樣儀點樣至微透鏡陣列芯片的60個位置，所述點樣緩沖液為CBS和30%甘油的混合物，所述CBS濃度為 0.05mol/L ；
[0057]b)25°C孵育60min，用PBST洗板6次；加入封閉液4°C封閉15小時備用
的配制方法為:向濃度為0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中加入體積為磷酸鹽緩沖液體積的萬分之五的吐溫20 ；所述封閉液為磷酸鹽緩沖液與牛血清白蛋白混合物，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.lmol/L，pH為7.2，牛血清白蛋白與磷酸鹽緩沖液質量體積比為:1:100。
[0058]3、對步驟2中微透鏡陣列芯片上清固定情況進行確認，具體步驟如下:
[0059]a)向對步驟2中點樣后向微透鏡陣列芯片加入用封閉液按體積比1:1000稀釋酶標記羊抗鼠，這種辣根過氧化物酶標記羊抗鼠采用武漢博士德公司BA1050，25°C孵育60min后，PBST洗滌6次；
[0060]b)使用GSS2400化學發光掃描儀掃描得出可反映上清液與微透鏡陣列芯片的結合情況的圖像，如圖6所示；
[0061]4、將步驟I中預處理上清標記辣根過氧化物酶:
[0062]將步驟I中將預處理后的20份上清液用過碘酸鈉氧化法分別標記上辣根過氧化物酶。
[0063]5、使用免疫原對上清液進行雙抗體夾心反應篩選配對情況，然后通過復核、陰性對照確認、天然蛋白驗證得出的適合的配對上清，具體步驟如下:
[0064]a)將免疫原使用封閉液稀釋至I μ g/ml，加入步驟2中點樣的微透鏡陣列芯片內，25°C反應 150min ；
[0065]b) PBST 洗滌 6 次；
[0066]c)在每個孔加入一種用封閉液稀釋20倍的對應步驟4辣根過氧化物酶標記的上清液抗體，25 °C反應150min ；
[0067]d) PBST 洗滌 8 次；
[0068]e)使用GSS2400化學發光掃描儀掃描，得出圖像；
[0069]f)根據分析結果，得出可以配對的標記上清編號，重復這個標記上清的反應，同時做陰性對照，確定配對信息的真實有效；
[0070]h)對于確定的配對上清，進行天然蛋白(例如臨床血清)的評價，篩選出適合臨床檢測的配對信息，如圖7所示。
【權利要求】
1.一種雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，該篩選方法包括如下步驟: (1)取細胞融合后所形成的雜交瘤細胞的培養上清液，通過鹽析法去除雜質后更換緩沖體系，獲得預處理上清液； (2)將步驟(1)中得到的預處理上清液中的抗體固定至微透鏡陣列芯片； (3)對步驟(2)的微透鏡陣列芯片進行陽性反應，確認上清液中抗體活性及在微透鏡陣列芯片上的固定情況； (4)將步驟(1)中得到的預處理上清液標記辣根過氧化物酶； (5)使用免疫原及固定上清蛋白芯片對標記上清液分別進行雙抗體夾心反應篩選配對情況，然后通過復核、陰性對照確認、天然蛋白驗證得出的適合的配對上清。
2.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述步驟(1)的具體操作方法是:a)取細胞融合后所形成的雜交瘤細胞的培養上清液，向所述上清液加入上清液體積的80%~150%的飽和硫酸銨溶液，在2~8 °C條件下沉淀8~15h，在高速冷凍離心機中，離心分離后得到沉淀物；b)所述沉淀物用0.4ml緩沖液溶解，用超濾管離心分離，重復超濾2~6次后得到預處理上清液。
3.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作方法是:a)所述步驟(1)獲得的預處理上清液用點樣緩沖液稀釋5~20倍后點樣至微透鏡陣列芯片；b)在25~37°C條件下孵育30~120min后用PBST洗板3~6次，加入封閉液，在2~8°C條件下孵育8~15小時。
4.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述步驟(3)的具體操作方法是:a)向所述步驟(2)獲得的微透鏡陣列芯片加入辣根過氧化物酶標記羊抗鼠，在25~37°C條件下孵育30~120min后，PBST洗滌3~6次；b)使用化學發光掃描儀掃描得出可反映上清液與微透鏡陣列芯片的結合情況的圖像。
5.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述步驟(4)的具體操作方法是:將步驟(1)獲得的預處理后上清液用過碘酸鈉氧化法標記上辣根過氧化物酶。
6.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述步驟(5)的具體操作方法是:a)將免疫原用封閉液稀釋至0.1~1u g/ml，加入所述步驟(2)處理過的微透鏡陣列芯片的微孔內，在25~37°C條件下孵育60~150min ；b)PBST洗滌2~6次；c)在微透鏡陣列芯片的微孔內加入用封閉液5~20倍稀釋的步驟(3)處理的標記上清液的，25-37°C孵育60~150min ；d) PBST洗滌5~8次；e)使用化學發光掃描儀掃描，得出圖像；f)根據圖像，微透鏡陣列芯片上有光信號的點所對應的上清液即為可以配對的上清液；g)得出的配對上清液重復步驟(6)中的a)~e)的反應，同時在進行步驟a)時增加以封閉液代替免疫原進行反應的陰性對照；當陰性對照微透鏡陣列芯片無光信號，且免疫原反應有信號時，確定配對信息的真實有效；h )對于篩選出的配對上清，使用天然蛋白質代替免疫原重復步驟(6)中的a)~e)的反應，得出光信號的數值與臨床檢測濃度線性擬合評價，篩選出最適合臨床檢測的配對上清信息。
7.根據權利要求2所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述步驟(1)中離心分離操作的離心力是10000~15000g,運行時間是10~30min。
8.根據權利要求2所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述超濾管的截留分子量小于上清液中抗體的分子量。
9.根據權利要求3所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述點樣緩沖液為碳酸鹽和30%甘油的混合物，所述碳酸鹽的濃度為0.05mol/L。
10.根據權利要求6所述的雜交瘤細胞上清階段微量抗體的篩選方法，其特征在于，所述封閉液為磷酸鹽緩沖液與牛血清白蛋白混合物，該磷酸鹽緩沖液的濃度為0.lmol/L, pH為7.2，牛血清白蛋白與磷酸鹽 緩沖液的質量體積比為1:100~5:100o
【文檔編號】G01N33/68GK103808922SQ201310154372
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年4月27日 優先權日:2013年4月27日
【發明者】王振宇, 陸冬雷, 戴良 申請人:無錫國盛生物工程有限公司