人表皮生長因子受體2(Her-2)定量測定試劑盒及其檢測方法

人表皮生長因子受體2(Her-2)定量測定試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】一種人表皮生長因子受體2定量測定試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括HER-2磁分離試劑，試劑1，試劑2，稀釋液，HER-2標準品，HER-2質控品，清洗濃縮液以及酶促化學發光底物溶液；所述的HER-2磁分離試劑含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的單克隆抗體復合物的納米磁性微球；所述的試劑1是含有堿性磷酸酶標記的抗HER-2單克隆抗體；所述的試劑2是含有三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纖維素的緩沖液；所述稀釋液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液。其目的是提供一種特異性強，靈敏度高，獲得檢測結果的時間短，操作方式簡便，檢測結果準確可靠的人表皮生長因子受體2定量測定試劑盒及其檢測方法。
【專利說明】人表皮生長因子受體2 (Her-2)定量測定試劑盒及其檢測 方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種測定血清的試劑盒及其測試方法，尤其是人表皮生長因子受體 2 (HER-2)定量測定試劑盒及其檢測方法。

【背景技術】
[0002] 表皮生長因子受體（epidermal growth Tactor receptor，縮寫 EGFR)是 ErbB 家 族成員之一，具有酪氨酸激酶活性，是一種重要的跨膜受體。EGFR被配體激活后，啟動胞內 信號傳導，經過細胞質中銜接蛋白、酶的級聯反應，調節轉錄因子激活基因的轉錄，指導細 胞遷移、黏附、增殖、分化、凋亡，且與腫瘤的形成和惡化密切相關。
[0003] 目前乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤，也是常見的女性腫瘤死亡原因之一。 大約有20%?30%的乳腺癌患者冊1?-2/1^11高表達，冊1?-2/1^11高表達與患者的不良預后 密切相關。HER-2/neu基因是人表皮生長因子家族的第2位成員。定位于染色體17q21，其 編碼一種分子量為185ku的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，結構上分為膜外配體結合 域、跨膜區和膜內酪氨酸激酶的活性域。HER-2/neu蛋白的胞外部分可以從細胞的表面脫落 至血液中，形成分子量大約為l〇5ku的可溶性蛋白HER-ZE⑶。HER-ZE⑶的裂解啟動了細胞 膜上的受體磷酸化，從而激活了細胞核內her-2并導致基因轉錄、細胞增殖；或ECD裂解后， 截短的細胞內酪氨酸激酶保持信號傳導能力，相應的實驗結果認為ECD的裂解會使細胞膜 上的P95發生磷酸化，從而導致腫瘤細胞的增殖。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種特異性強，靈敏度高，獲得檢測結果的時間短，操作方式 簡便，檢測結果準確可靠的人表皮生長因子受體2 (Her-2)定量測定試劑盒及其檢測方法。
[0005] 本發明的人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒，包括HER-2磁分離試 齊IJ，試劑1，試劑2,稀釋液，HER-2標準品，HER-2質控品，清洗濃縮液以及酶促化學發光底物 溶液；所述的HER-2磁分離試劑含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的單克隆抗體復合物 的納米磁性微球：所述的試劑1是含有堿性磷酸酶標記的抗HER-2單克隆抗體；所述的試 齊IJ2是含有三羥甲基氨基甲烷（TRIS)、MAK33和甲基纖維素的緩沖液；所述稀釋液是含有牛 血清白蛋白（BSA)的溶液；所述的HER-2標準品和HER-2質控品分別是含HER-2抗原的牛 血清白蛋白（BSA)溶液；所述清洗濃縮液是含有吐溫-20(TWEE\-20)和Proclin-300的緩 沖液。
[0006] 本發明的人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒，其中所述HER-2磁分 離試劑采用如下步驟制成：
[0007] (1)、稱取7g三羥甲基氨基甲烷（TRIS)、lg似隊和68甲基纖維素于容器中，稱取 4g吐溫20 (TWEEN-20)，加適量水使吐溫20 (TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；
[0008] (2)、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒 入上述容器中，然后在容器中加入800ml純化水，充分攪拌；
[0009] (3)、加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH，控制pH在7. 95-8. 05之間；
[0010] (4)、稱取牛血清白蛋白（BSA)3g，四環素0.04g，硫酸新霉素 lg，全部倒入上述容 器中，充分混勻；
[0011] (5)、最后用純化水將容器中的溶液定容至1000ml,用0. 2 μ μπι濾器過濾，得到 免疫磁珠緩沖液，備用；
[0012] (6)、將l.Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul二甲基亞砜（DMS0)中，備用；取 2mg兔抗小鼠抗體溶于PH9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為lml，獲得一級抗體溶液， 用移液槍吸取溶于50ul二甲基亞砜（DMS0)中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯，加入到所述抗體 溶液中，置室溫90min，獲得二級抗體溶液；
[0013] (7)、將步驟6獲得的二級抗體溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機 中，在3000g下離心30min，濃縮至0. 5ml，獲得三級抗體溶液；
[0014] (8)、取0. 5ml免疫磁珠，加入5ml反應杯中，經磁鐵吸附2分鐘后，吸取上清，然后 加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步驟7獲得的三級抗體溶液中，保持 混勻狀態，室溫反應4小時，獲得已經標記的免疫磁珠；
[0015] (9)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液室溫反應30分鐘，然后加入1.5ml PH7. 2 0. lmol/LPB清洗已經標記的免疫磁珠，混勻30秒；
[0016] (10)、用10ml PH7. 2 0· lmol/L PB將步驟9獲得的已經標記的免疫磁珠轉入玻璃 瓶；
[0017] (11)、將1. 5mg小鼠抗人HER-2抗體溶于5ml步驟9獲得的已經標記的免疫磁珠 的保存液中，加入到步驟10中的玻璃瓶中，混勻反應2小時，再加入5ml PH7. 2 0. lmol/L PB清洗已經標記的免疫磁珠，并混勻30秒；
[0018] (12)、用50ml免疫磁珠保存液將免疫磁珠轉入玻璃瓶，配制得免疫磁珠濃度為 0. 05 %的標準濃度磁珠使用液；
[0019] (13)、將步驟12獲得的溶液與步驟5獲得的免疫磁珠緩沖液按照1 : 1的體積比 例混勻，即得所述HER-2磁分離試劑（其使用濃度為0· 025% );
[0020] 所述試劑1采用如下步驟制成：
[0021] (1)、取 Tris6. 06g、NaC113. 0g、Zncl20. 05g、Proclin-300 0· 2ml 和 MgCl20. 05g 于 燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使其中的固體完全溶解；
[0022] (2)、加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH，控制pH在7. 35-7. 45范圍內；
[0023] (3)、稱取牛血清白蛋白（BSA)3g倒入上述燒杯中；
[0024] (4)、最后用純化水定容至1000ml,用0. 2 μ μ m濾器過濾,得試劑1稀釋液，備 用；
[0025] (5)、取10mg堿性磷酸酶（ALP)，加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM 尚心20分鐘，濃縮至1暈升，獲得濃縮液；
[0026] (6)、向步驟5獲得濃縮液中加入0. 2ml的0. 1M Nal04溶液，室溫下避光攪拌20分 鐘，然后裝入透析袋中，用ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液；
[0027] (7)、向步驟6獲得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0,然 后立即加入2. 5mg抗HER-2單克隆抗體，攪拌2小時，再加入0. lml的4mg/ml NaBH4溶液， 混勻，置4°C下2小時；
[0028] (8)、將步驟7獲得溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保 留液；
[0029] (9)、向步驟8獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時，然后 3000rpm離心半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4的PBS中，獲得溶液；
[0030] (10)、將步驟9獲得的溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB緩沖液透析5個 小時，去除銨離子，收集保留液后10, OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積 比為1體積的上清液：100體積的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即得堿性磷酸酶（ALP) 與抗HER-2單克隆抗體的偶聯物，將收集到的堿性磷酸酶（ALP)與抗HER-2單克降抗體的 偶聯物，用上述步驟4獲得的試劑1稀釋液，以1體積的偶聯物：1000體積的試劑1稀釋液 的體積比混合均勻，即得試劑1。
[0031] 所述試劑2采用如下步驟制成：
[0032] (1)、取TRIS1. 56g、NaC14. 23g和0. 5g甲基纖維素，全部加入容器中，取0. 2ml Proclin-300于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入容器中；
[0033] (2)、取800ml純化水加入步驟1容器中，充分攪拌直至其中的固體物完全溶解，調 PH 在 7. 35-7. 45 之間；
[0034] (3)、根據Mak33的濃度量取最終量為0· 9g的Mak33,稱取牛γ球蛋白（lgG)20g， 羊血清4ml，馬血清5ml加入步驟2容器中；最后用純化水定容至1000ml，完全溶解后，用 〇.2μπι濾器過濾，即得試劑2;
[0035] 所述稀釋液采用如下步驟制成：
[0036] (1)、稱取 NaC19. Og 和 BSA60g，加入容器中；
[0037] (2)、取(λ 5ml Proclin-300加10ml純化水溶解，加入步驟1容器中；
[0038] (3)、最后加純化水定容1000ml,完全溶解后，用0. 2 μ m濾器過濾，即得稀釋液；所 述清洗濃縮液采用如下步驟制成：
[0039] (1)、取 TRIS12. 54g 和 NaC1325. 6g，加入容器中；
[0040] ⑵、取5g Tween-20,加20ml水使其完全溶解后，加入步驟1容器中；
[0041] (3)、取0· 2ml Proclin-300,用10ml純化水完全溶解后，加入步驟2容器中；
[0042] (4)、取800ml純化水加入步驟3容器中，充分攪拌，直至其中的固體物完全溶解；
[0043] (5)、加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調PH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間；
[0044] (6)、最后用純化水定容1000ml,用0. 2 μ μ m濾器過濾，即得清洗濃縮液；
[0045] 所述酶促化學發光底物溶液采用如下步驟制成：
[0046] (1)、取 TRIS2. 35g、NaC16. 41g、Na2S030 . 00 2g、光澤精 0· 002g 和 Proclin-300 0. 2ml，加入燒杯中；
[0047] (2)、加入600ml純化水于燒杯中，充分攪拌直至其中的固體物完全溶解，調PH在 7. 95-8. 05 之間；
[0048] (3)、向燒杯中加入250ml Lumi-PHos480,用純化水定容至1000ml，混勻后用 0. 2 μ m濾器過濾，即得酶促化學發光底物溶液。
[0049] 本發明的人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒，其中所述HER-2校準 品中HER-2抗原的濃度分別為0、15、45、90、180、350ng/ml ;所述HER-2質控品中HER-2抗 原的濃度分別為15、180ng/ml。
[0050] 本發明的人表皮生長因子受體2(Her-2)的定量測定試劑盒，其中所述室溫反應 的溫度為20°C -24°C。
[0051] 本發明的人表皮生長因子受體2(Her-2)的定量測定試劑盒的檢測方法，包括如 下步驟：
[0052] 1)、向試管架上的每一試管中分別加入30 μ 1 HER-2標準品、質控品和待測標本；
[0053] 2)、向每一試管中加入45 μ 1試劑1 ;
[0054] 3)、向每一試管中加入45 μ 1試劑2 ;
[0055] 4)、向每一試管中加入30 μ 1 HER-2磁分離試劑；
[0056] 5)、用多管混勻器輕輕振蕩試管架30秒后，將試管架連同全部試管置于水浴箱 中，溫浴45分鐘；
[0057] 6)、將試管架連同全部試管放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸， 沉淀1分鐘，然后快速倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在吸水紙 上，用力拍擊分離器底部，以除去粘在試管內壁上的所有液滴；
[0058] 7)、將清洗濃縮液按照1體積的清洗濃縮液：7體積純化水的比例添加純化水，得 到清洗液，向每一試管中加 200 μ 1清洗液，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30秒；加樣時應 避免加樣力度過大而導致磁珠濺出；
[0059] 8)、再次將試管架連同全部試管放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面 接觸，沉淀1分鐘，然后快速倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在 吸水紙上，用力拍擊分離器底部，以除去粘在試管內壁上的所有液滴；
[0060] 9)、再次向每一試管中加200 μ 1清洗濃縮液，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30 秒；加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出；
[0061] 10)、第3次將試管架連同全部試管放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表 面接觸，沉淀1分鐘，然后快速倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放 在吸水紙上，用力拍擊分離器底部，以除去粘在試管內壁上的所有液滴；
[0062] 11)、加 200 μ 1酶促化學發光底物溶液至試管中，混勻5秒，迅速用準備好的發光 檢測儀進行檢測，即可得到相關數據。
[0063] 本發明的人表皮生長因子受體2(Her-2)的定量測定試劑盒的檢測方法，其中所 述待測標本為高值HOOK樣本時，使用稀釋液對標本進行稀釋。
[0064] 本發明的人表皮生長因子受體2 (Her-2)定量測定試劑盒及其檢測方法，其試劑 盒包括HER-2磁分離試劑，試劑1，試劑2,稀釋液，HER-2標準品，HER-2質控品，清洗濃縮 液以及酶促化學發光底物溶液；實驗表明，本發明的人表皮生長因子受體2也即癌胚抗原 (HER-2)定量測定試劑盒及其檢測方法，具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測結 果的時間和更簡便的操作方式。
[0065] 下面對本發明的人表皮生長因子受體2(Her-2)定量測定試劑盒及其檢測方法作 進一步詳細說明。

【具體實施方式】
[0066] 本發明的人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒，包括HER-2磁分離試 齊?，試劑1，試劑2,稀釋液，HER-2標準品，HER-2質控品，清洗濃縮液以及酶促化學發光底物 溶液；所述的HER-2磁分離試劑含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的單克隆抗體復合物 的納米磁性微球；所述的試劑1是含有堿性磷酸酶標記的抗HER-2單克降抗體；所述的試 齊IJ2是含有三羥甲基氨基甲烷（TRIS)、MAK33和甲基纖維素的緩沖液；所述稀釋液是含有牛 血清白蛋白（BSA)的溶液；所述的HER-2標準品和HER-2質控品分別是含HER-2抗原的牛 血清白蛋白（BSA)溶液；所述消洗濃縮液是含有吐溫-20(TWEEN-20)和Proclin-300的緩 沖液。
[0067] 上述HER-2磁分尚試劑米用如下步驟制成：
[0068] (1)、稱取7g三輕甲基氨基甲燒（TRIS)、lg NaN3和6g甲基纖維素于容器中，稱取 4g吐溫20 (TWEEN-20)，加適量水使吐溫20 (TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；
[0069] (2)、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒 入上述容器中，然后在容器中加入800ml純化水，充分攪拌；
[0070] (3)、加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH，控制pH在7. 95-8. 05之間；
[0071] (4)、稱取牛血清白蛋白（BSA)3g，四環素0.04g，硫酸新霉素 lg，全部倒入上述容 器中，充分混勻；
[0072] (5)、最后用純化水將容器中的溶液定容至1000ml,用0. 2 μ μπι濾器過濾，得到 免疫磁珠緩沖液，備用；
[0073] (6)、將l.Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul二甲基亞砜（DMS0)中，備用；取 2mg兔抗小鼠抗體溶于PH9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為lml，獲得一級抗體溶液， 用移液槍吸取溶于50ul二甲基亞砜（DMS0)中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯，加入到所述抗體 溶液中，置室溫90min，獲得二級抗體溶液；
[0074] (7)、將步驟6獲得的二級抗體溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機 中，在3000g下離心30min，濃縮至0. 5ml，獲得三級抗體溶液；
[0075] (8)、取0. 5ml免疫磁珠，加入5ml反應杯中，經磁鐵吸附2分鐘后，吸取上清，然后 加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步驟7獲得的三級抗體溶液中，保持 混勻狀態，室溫反應4小時，獲得已經標記的免疫磁珠；
[0076] (9)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液室溫反應30分鐘，然后加入1.5ml PH7. 2 0. lmol/LPB清洗已經標記的免疫磁珠，混勻30秒；
[0077] (10)、用10ml PH7. 2 0· lmol/L PB將步驟9獲得的已經標記的免疫磁珠轉入玻璃 瓶；
[0078] (11)、將1. 5mg小鼠抗人HER-2抗體溶于5ml步驟9獲得的已經標記的免疫磁珠 的保存液中，加入到步驟10中的玻璃瓶中，混勻反應2小時，再加入5ml PH7. 2 0. lmol/L PB清洗已經標記的免疫磁珠，并混勻30秒；
[0079] (12)、用50ml免疫磁珠保存液將免疫磁珠轉入玻璃瓶，配制得免疫磁珠濃度為 0. 05 %的標準濃度磁珠使用液；
[0080] (13)、將步驟12獲得的溶液與步驟5獲得的免疫磁珠緩沖液按照1 : 1的體積比 例混勻，即得所述HER-2磁分離試劑（其使用濃度為0· 025% );
[0081] 所述試劑1采用如下步驟制成：
[0082] (1)、取 Tris6. 0 6 g、NaC113. 0g、Zncl20. 05g、Proclin-300 0· 2ml 和 MgCl2 0· 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使其中的固體完仝溶解：
[0083] (2)、加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH，控制pH在7. 35-7. 45范圍內：
[0084] (3)、稱取牛血清白蛋白（BSA)3g倒入上述燒杯中；
[0085] (4)、最后用純化水定容至1000ml，用0. 2 μ μ m濾器過濾，得試劑1稀釋液，備 用：
[0086] (5)、取10mg堿性磷酸酶（ALP)，加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM 尚心20分鐘，濃縮至1暈升，獲得濃縮液；
[0087] (6)、向步驟5獲得濃縮液中加入0. 2ml的0. 1M Nal04溶液，室溫下避光攪拌20分 鐘，然后裝入透析袋中，用ImM pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液：
[0088] (7)、向步驟6獲得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0,然 后立即加入2. 5mg抗HER-2單克隆抗體，攪拌2小時，再加入0. lml的4mg/mlNaBH ;溶液， 混勻，置4°C下2小時：
[0089] (8)、將步驟7獲得溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保 留液；
[0090] (9)、向步驟8獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時，然后 3000rpm離心半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4的PBS中，獲得溶液；
[0091] (10)、將步驟9獲得的溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB緩沖液透析5個 小時，去除銨離子，收集保留液后10, OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積 比為1體積的上清液：100體積的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即的堿性磷酸酶（ALP) 與抗HER-2單克隆抗體的偶聯物，將收集到的堿性磷酸酶（ALP)與抗HER-2單克隆抗體的 偶聯物，用上述步驟4獲得的試劑1稀釋液，以1體積的偶聯物：1000體積的試劑1稀釋液 的體積比混合均勻，即得試劑1。
[0092] 所述試劑2采用如下步驟制成：
[0093] (1)、取TRIS1. 56g、NaCl 4. 23g和0· 5g甲基纖維素，全部加入容器中，取 0. 2mlProclin-300于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入容器中；
[0094] (2)、取800ml純化水加入步驟1容器中，充分攪拌直至其中的固體物完全溶解，調 PH 在 7. 35-7. 45 之間；
[0095] (3)、根據Mak33的濃度量取最終量為0.9g的Mak33,稱取牛球蛋白（lgG)20g， 羊血清4ml，馬血清5ml加入步驟2容器中；最后用純化水定容至1000ml，完全溶解后，用 〇.2μπι濾器過濾，即得試劑2:
[0096] 所述稀釋液采用如下步驟制成：
[0097] (1)、稱取 NaC19. Og 和 BSA60g，加入容器中：
[0098] (2)、取0· 5ml Proclin-300加10ml純化水溶解，加入步驟1容器中；
[0099] (3)、最后加純化水定容1000ml，完全溶解后，用0. 2 μ m濾器過濾，即得稀釋液：
[0100] 所述清洗濃縮液采用如下步驟制成：
[0101] (1)、取 TRlS12.54g 和 NaC1325.6g，加入容器中；
[0102] (2)、取5gTween-20,加 20ml水使其完全溶解后，加入步驟1容器中；
【權利要求】
1. 人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒，其特征在于：包括HER-2磁分離 試劑，試劑1，試劑2,稀釋液，HER-2標準品，HER-2質控品，清洗濃縮液以及酶促化學發光底 物溶液；所述的HER-2磁分離試劑含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的單克隆抗體復合 物的納米磁性微球；所述的試劑1匙含有堿性磷酸酶標記的抗HER-2單克隆抗體；所述的 試劑2是含有三羥甲基氨基甲烷（TRIS)、MAK33和甲基纖維素的緩沖液；所述稀釋液是含有 牛血清白蛋白（BSA)的溶液；所述的HER-2標準品和HER-2質控品分別是含HER2抗原的牛 血清白蛋白（BSA)溶液；所述清洗濃縮液是含有吐溫-20(TWEE\-20)和Proclin-300的緩 沖液。
2. 按照權利要求1所述的人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒，其特征在 于：所述HER-2磁分離試劑采用如下步驟制成： (1) 、稱取7g三羥甲基氨基甲烷（TRIS)、lg似隊和68甲基纖維素于容器中，稱取4g吐 溫20 (TWEEN-20)，加適量水使吐溫20 (TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中； (2) 、用移液器將Procl in-300量取0. 2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上 述容器中，然后在容器中加入800ml純化水，充分攪拌； (3) 、加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH，控制pH在7. 95-8. 05之間； (4) 、稱取牛血清白蛋白（BSA)3g，四環素0. 04g，硫酸新霉素 lg，全部倒入上述容器中， 充分混勻； (5) 、最后用純化水將容器中的溶液定容至1000ml,用0. 2 μ μπι濾器過濾，得到免疫 磁珠緩沖液，備用； (6) 、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul二甲基亞砜（DMS0)中，備用；取2mg兔 抗小鼠抗體溶于PH9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為lml，獲得一級抗體溶液，用移 液槍吸取溶于50ul二甲基亞砜（DMS0)中的辛二酸二琥珀酰亞胺酯，加入到所述抗體溶液 中，置室溫90min，獲得二級抗體溶液； (7) 、將步驟6獲得的二級抗體溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機中， 在3000g下離心30min，濃縮至0. 5ml，獲得三級抗體溶液； (8) 、取0. 5ml免疫磁珠，加入5ml反應杯中，經磁鐵吸附2分鐘后，吸取上清，然后加入 1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步驟7獲得的三級抗體溶液中，保持混勻 狀態，室溫反應4小時，獲得已經標記的免疫磁珠； (9) 、加入0. 3mllmol/L的TRIS溶液室溫反應30分鐘，然后加入1.5ml PH7. 2 0. lmol/ L PB清洗已經標記的免疫磁珠，混勻30秒； (10) 、用10ml PH7. 20. lmol/LPB將步驟9獲得的已經標記的免疫磁珠轉入玻璃瓶； (11) 、將1. 5mg小鼠抗人HER-2抗體溶于5ml步驟9獲得的已經標記的免疫磁珠的保 存液中，加入到步驟10中的玻璃瓶中，混勻反應2小時，再加入5ml PH7. 2 0. lmol/L PB清 洗已經標記的免疫磁珠，并混勻30秒； (12) 、用50ml免疫磁珠保存液將免疫磁珠轉入玻璃瓶，配制得免疫磁珠濃度為0. 05% 的標準濃度磁珠使用液； (13) 、將步驟12獲得的溶液與步驟5獲得的免疫磁珠緩沖液按照1 : 1的體積比例混 勻，即得所述HER-2磁分離試劑（其使用濃度為0· 025% ); 所述試劑1采用如下步驟制成： (1) 、取 Tris6. 06g、NaC113. 0g、Zncl2、0. 05g、Proclin-300 0· 2ml 和 MgCl2 0· 05g 于燒 瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使其中的固體完全溶解； (2) 、加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH，控制pH在7. 35-7. 45范圍內； (3) 、稱取牛血清白蛋白（BSA)3g倒入上述燒杯中； (4) 、最后用純化水定容至1000ml,用0. 2μ μ m濾器過濾,得試劑1稀釋液,備用； (5) 、取10mg堿性磷酸酶（ALP)，加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心 20分鐘，濃縮至1毫升，獲得濃縮液； (6) 、向步驟5獲得濃縮液中加入0. 2ml的0. 1M Nal04溶液，室溫下避光攪拌20分鐘， 然后裝入透析袋中，用ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液； (7) 、向步驟6獲得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0,然后立 即加入2. 5mg抗HER-2單克隆抗體，攪拌2小時，再加入0. lml的4mg/ml NaBHi溶液，混勻， 置4°C下2小時； (8) 、將步驟7獲得溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7.4PBS透析，4°C過夜，收集保留液： (9) 、向步驟8獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時，然后3000rpm 離心半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0. 15M PH7. 4 的PBS中，獲得溶液； (10) 、將步驟9獲得的溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB緩沖液透析5個小時， 去除銨離了，收集保留液后10, OOOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為 1體積的上清液：1〇〇體積的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即得堿性磷酸酶（ALP)與 抗HER-2單克隆抗體的偶聯物，將收集到的堿性磷酸酶（ALP)與抗HER-2單克隆抗體的偶 聯物，用上述步驟4獲得的試劑1稀釋液，以1體積的偶聯物：1000體積的試劑1稀釋液的 體積比混合均勻，即得試劑1。 所述試劑2采用如下步驟制成： (1) 、取TRIS1.56g、NaC14. 23g和0. 5g甲基纖維素，全部加入容器中，取0. 2ml Proclin-300于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入容器中； (2) 、取800ml純化水加入步驟1容器中，充分攪拌直至其中的固體物完全溶解，調PH 在 7. 35-7. 45 之間； (3) 、根據Mak33的濃度量取最終量為0.9g的Mak33,稱取牛γ -球蛋白（lgG)20g， 羊血清4ml，馬血清5ml加入步驟2容器中；最后用純化水定容至1000ml，完全溶解后，用 〇.2μπι濾器過濾，即得試劑2 ; 所述稀釋液采用如下步驟制成： (1) 、稱取NaC19. 0g和BSA60g，加入容器中； (2) 、取0· 5ml Proclin-300加10ml純化水溶解，加入步驟1容器中； (3) 、最后加純化水定容1000ml，完全溶解后，用0. 2 μ m濾器過濾，即得稀釋液； 所述清洗濃縮液采用如下步驟制成： (1) 、取 TRIS12. 54g 和 NaC1325. 6g，加入容器中； (2) 、取5gTween-20,加20ml水使其完全溶解后，加入步驟1容器中； (3) 、取0. 2ml Proclin-300,用10ml純化水完全溶解后，加入步驟2容器中； (4) 、取800ml純化水加入步驟3容器中，充分攪拌，直至其中的固體物完全溶解； (5) 、加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調PH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間； (6) 、最后用純化水定容1000ml,用0. 2 μ μ m濾器過濾，即得清洗濃縮液： 所述酶促化學發光底物溶液采用如下步驟制成： (1) 、取 TRIS2. 35g、NaC16. 41g、Na2S030 . 00 2g、光澤精 0· 002g 和 Proclin-300 0· 2ml， 加入燒杯中； (2) 、加入600ml純化水于燒杯中，充分攪拌直至其中的固體物完全溶解，調PH在 7. 95-8. 05 之間； (3) 、向燒杯中加入250ml Lumi-PHos480，用純化水定容至1000ml，混勻后用0. 2 μ m濾 器過濾，即得酶促化學發光底物溶液。
3. 按照權利要求2所述的人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒，其特征在 于：所述HER-2校準品中HER-2抗原的濃度分別為0、15、45、90、180、350ng/ml ;所述HER-2 質控品中HER-2抗原的濃度分別為15、180ng/ml。
4. 按照權利要求3所述的人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒，其特征在 于：所述室溫反應的溫度為20°C -24°C。
5. 人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒的檢測方法，其特征在于：包括如 下步驟： 1) 、向試管架上的每一試管中分別加入30 μ 1 HER-2標準品、質控品和待測標本； 2) 、向每一試管中加入45 μ 1試劑1 ; 3) 、向每一試管中加入45 μ 1試劑2 ; 4) 、向每一試管中加入30 μ 1 HER-2磁分離試劑； 5) 、用多管混勻器輕輕振蕩試管架30秒后，將試管架連同全部試管置于水浴箱中，溫 浴45分鐘； 6) 、將試管架連同全部試管放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀 1分鐘，然后快速倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在吸水紙上，用 力拍擊分離器底部，以除去粘在試管內壁上的所有液滴； 7) 、將清洗濃縮液按照1體積的清洗濃縮液：7體積純化水的比例添加純化水，得到清 洗液，向每一試管中加200 μ 1清洗液，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30秒；加樣時應避免 加樣力度過大而導致磁珠濺出； 8) 、再次將試管架連同全部試管放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸， 沉淀1分鐘，然后快速倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在吸水紙 上，用力拍擊分離器底部，以除去粘在試管內壁上的所有液滴； 9) 、再次向每一試管中加200 μ 1清洗濃縮液，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30杪；力口 樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出； 10) 、第3次將試管架連同全部試管放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接 觸，沉淀1分鐘，然后快速倒轉分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在吸 水紙上，用力拍擊分離器底部，以除去粘在試管內壁上的所有液滴； 11) 、加200 μ 1酶促化學發光底物溶液至試管中，混勻5秒，迅速用準備好的發光檢測 儀進行檢測，即可得到相關數據。
6. 按照權利要求5所述的人表皮生長因子受體2 (Her-2)的定量測定試劑盒的檢測方 法，其特征在于：所述待測標本為高值HOOK樣本時，使用稀釋液對標本進行稀釋。
【文檔編號】G01N21/76GK104122394SQ201310140596
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月23日 優先權日:2013年4月23日
【發明者】鄢盛愷 申請人:北京豪邁生物工程有限公司